№ п/п Види Штами Мікотоксини
ВА* РА* РН* Т-2 НТ-2 Т-2 тріол Т-2 тетраол Фузаренон-Х ДАОС* ДОН*
1 D. polymorphus 149 0,05 0,05 0,05 8 — 10 — — — 15
2 D. polymorphus 396 5 5 10 15 — 15 — — — 15
3 D. polymorphus 65 1 10 0,5 15 — 15 — — — 15
4 D. polymorphus 142 1 1 1 15 — 15 — 10 10 15
5 D. polymorphus 527 5 5 0,5 10 — 15 — — — 15
6 W. californica 34 0,2 0,2 5 15 — 8 — — — 10
7 W. californica 18/31 0,5 0,5 0,4 10 10 10 10 10 10 15
8 W. saturnus 342 0,2 0,2 0,1 12 10 10 10 10 10 12
9 W. saturnus 393 0,5 0,5 0,4 15 10 10 10 10 10 15
10 W. saturnus 32/22 0,4 0,4 0,1 10 10 10 10 10 10 10
11 K. marxianus 1 0,1 0,5 0,1 0,5 10 5 10 — — 15
12 K. marxianus 7 0,1 0,2 0,1 0,2 10 5 10 — — 10
13 K. marxianus 1r 0,5 0,8 0,1 0,5 10 10 10 10 10 15
14 P. guilliemondii 275 5 10 5 10 — 15 — — 10 —
15 P. membranaefaciens 36r 0,1 1 0,2 0,2 — 10 — — 10 —
16 P. membranaefaciens 884 0,1 0,5 0,5 1 10 10 10 10 10 1
17 S. cerevisiae 12 0,5 5 5 15 10 10 — 10 — 15
18 S. cerevisiae 24 1 1 1 8 10 5 — — 5 —
19 S. cerevisiae 22r 0,5 0,5 0,1 0,8 10 10 10 — 10 15
20 S. pombe 652 0,4 0,1 0,1 0,5 10 0,5 10 10 1 0,8
21 S. pombe 657 0,2 0,5 0,05 1 10 10 10 10 1 1
22 C. albicans 3 0,4 0,5 0,5 10 10 10 10 10 10 15
23 C. albicans 621 10 10 1 15 — 8 — — — 15
24 C. kefyr 873 0,1 0,1 0,03 0,1 10 15 10 10 10 1
25 C. kefyr 194 0,1 0,1 0,05 0,1 10 2 10 10 5 15
26 C. kefyr 1128 0,1 0,1 0,1 0,1 1 5 10 — 1 2
27 C. valida 38r 1 5 10 15 — 15 — — — 15
28 R. minuta 652 5 3,5 0,1 1 10 10 10 — 10 0,4
Примітка: * ВА – верруукарин А; РА – рорідин А; РН – рорідин Н;
ДАОС – діацетоксисцирпенол; ДОН – дезоксиніваленол;
— не вивчали
Перевірку цього феномена проводили в дослідах з використанням Т-2 токсину як єдиного джерела вуглецю для D. polymorphus 396. Культивування здійснювали на качалках протягом 96 год. Т-2 токсин вносили в середовище з розрахунку 2 мг/150 мл. Накопичення біомаси дріжджів і вміст Т-2 токсину в середовищі визначали в динаміці вирощування D. polymorphus 396 через кожні 12 год.
Ідентифікацію Т-2 токсину та його метаболітів здійснювали за допомогою ТШХ на пластинках „Silufol” UV 254 після екстракції з культуральних фільтратів етилацетатом. Візуалізацію цих речовин проводили за допомогою 4п-(нітробензил)піридину з наступною обробкою концентрованим розчином аміаку (Takitani et al., 1979). Поряд з цим, індикацію Т-2 токсину та його метаболітів здійснювали за допомогою мікробіологічного методу, в якому використовували дріжджову культуру C. kefyr 899 з чутливістю до Т-2 токсину 3 мкг/мл.
Таблиця 3
Індикаторні штами дріжджів щодо трихотеценових мікотоксинів
№ п/п Види Штами Мікотоксини*, що визначаються
1 Debaryomyces polymorphus 142 VA, RA, RH
2 D. polymorphus 149 VA ,RA, RH
3 D. polymorphus 527 RH
4 Williopsis californica 34 VA, RA
5 W. californica 18/31 VA, RA, RH
6 W. saturnus 32/22 VA, RA, RH
7 W. saturnus 393 VA, RA, RH
8 Kluyveromyces marxianus 1 VA, RA, RH, T-2
9 K. marxianus 7 VA, RA, RH, T-2
10 K. marxianus 1r VA, RA, RH, T-2
11 Pichia membranaefaciens 36r VA, RA, RH, T-2
12 P. membranaefaciens 884 VA, RA, RH, T-2
13 Saccharomyces cerevisiae 12 VA
14 S. cerevisiae 22r VA, RA, RH, T-2
15 Schizosaccharomyces pombe 652 VA, RA, RH, T-2, DAOC, DON
16 S. pombe 657 VA, RA, RH, T-2, DAOC, DON
17 Candida albicans 621 RH
18 C. kefyr 194 VA, RA, RH, T-2
19 C. kefyr 873 VA, RA, RH, T-2
20 C. kefyr 1128 VA, RA, RH, T-2, DAOC, DON
21 C. valida 38r VA
Примітка: * позначення такі ж як в табл. 2.
Результати досліджень, представлені на рис. 4, свідчать про значне зниження вмісту Т-2 токсину в середовищі, який на кінець 2 доби культивування виявляється в незначній кількості і практично не виявляється на 3 добу за допомогою як хроматографічного, так і мікробіологічного методів.
Натомість, як видно зі схеми хроматограми, наведеної на рис. 5, в динаміці „споживання” Т-2 токсину в культуральних фільтратах, поряд з Т-2 токсином, виявляються також НТ-2 токсин, Т-2 тетраол та інші сполуки, що дають забарвлення з 4п-(нітробензил)піридином. Поряд з цим, виявляються пігментні речовини, забарвлені в оранжевий колір, цілком можливо, каротиноїдної природи, оскільки як каротиноїди, так і терпеноїдні структури, до яких належать і трихотеценові метаболіти, мають спільні біосинтетичні шляхи.
Таким чином, нами показана принципова можливість мікробіологічної інактивації Т-2 токсину за допомогою дріжджової культури D. polymorphus 396.
Стосовно трихотеценових мікотоксинів наша спроба була першою, а з огляду на високу чутливість дріжджів до цієї групи метаболітів, - в певній мірі навіть унікальною.
На можливість метаболічних перетворень Т-2 токсину в кишковику щурів вказують Conrady-Lorck et al., (1988), а також бактеріальними угрупуваннями, виділеними з ґрунту, води та кишковика (Betina, 1984; Betton, Bull, 1989; Swanson et al., 1988).
Природно виникає питання щодо можливого практичного використання цього феномена. Ми не виключаємо його реалізації в майбутньому з врахуванням частоти виявлення Т-2 токсину в зерні і зернопродуктах та актуальності цієї проблеми взагалі. Однак, успішне вирішення цього питання, як нам здається, буде визначатись успіхом розробки відповідних технологій.
Враховуючи унікальність структур трихотеценових мікотоксинів, а також результати вивчення їх фунгістатичних властивостей щодо широкого загалу дріжджових штамів, нами був здійснений комп'ютерний аналіз цих даних, і на конкретних прикладах показана принципова можливість використання реакції дріжджів на трихотецени, як додаткового таксономічного критерію при їх видовій диференціації.
При оцінці таксономічного значення відношення дріжджів до мікотоксинів застосовували один з методів нумеричного аналізу, який звичайно використовують в біологічних дослідах для
Рис. 4. Зміна вмісту Т-2 токсину в середовищі при культивуванні D. polymorphus 396 (контроль - за відсутності штаму дріжджів)
Рис. 5. Схема хроматографічного розподілу продуктів метаболізму Т-2 токсину
1 — Т-2 токсин; 2 — НТ-2 токсин; 3 — Т-2 тетраол.
класифікації організмів, що базується на групуванні вибірки в кластери і встановлення зв'язку між таксонами на основі подібності ознак (Малашенко с соавтор., 1980).
За дендрограмою (рис. 6), при високому коефіцієнті подібності сформувалось кілька груп видів: W. californica та W. saturnus, а також велика група видів, головним чином з родів Candida і Kluyveromyces. При цьому слід зазначити, що взаємозв'язок видів в межах роду, за невеликим виключенням, був ідентичним як для суми макроциклічних трихотеценів, так і для окремих досліджуваних представників цього класу мікотоксинів.
Рис. 6 Дендрограма, яка визначає фенотипову подібність деяких видів дріжджів на основі критерію відношення до досліджуваних трихотеценових мікотоксинів
Наші дані щодо відмінностей досліджуваних видів за чутливістю до макроциклічних трихотеценів підтримують це положення.
На основі фенотипової подібності незавершених дріжджів прийнято C. valida вважати анаморфою завершеного виду P. membranaefaciens, а C. kefyr анаморфою K. marxianus (Нагорная с сотр., 1990). Однакова чутливість до мікотоксинів представників обох видів також підтверджує цю подібність і групує їх з видами C. krusei і C. lambica на рівні 91,2 – 95,8 %. Види C. krusei, C. lambica і C. valida в останньому визначнику (Kurtzman, Fell, 1998) включені в одну групу на основі фізіологічних відмінностей.
Для більш широкого застосування цього критерію як в плані збільшення кількості видів, так і використання для цього більш широкого набору мікотоксинів необхідні подальші дослідження.
Використання нами ряду штамів фітопатогенних бактерій, як і Грам+ спороутворюючих коків, дало відповідь лише на деякі з поставлених питань.
З одного боку, прослідковується чітка специфічність щодо чутливості окремих видів до патуліну, з іншого – вкрай низька їх чутливість до зеараленону і резистентність до афлатоксину В1.
З точки зору виявлення серед них індикаторних культур, можна сподіватись на сприятливу перспективу, хоча в цьому напрямку ще слід багато працювати. Що ж стосується можливої ролі патуліну в системі взаємовідносин „рослина - фітопатоген”, то на даному етапі вона уявляється нам дещо нереальною, з огляду на відсутність в літературі відповідних даних щодо цього метаболіту, хоча його фітотоксичні властивості, як і антибактеріальна дія добре відомі (Waksman, 1942). Більше того, окремі дані (Lindroth, 1980) свідчать також про використання патуліну для контролю деяких грибних фітопатогенів. Слід сподіватись на подальшу цілеспрямовану роботу в цьому напрямку.
Більш показовими і інформативними виявились дослідження антибіотичних властивостей мікотоксинів щодо Грам+ спороутворюючих коків, саме з огляду на прояв чутливості до окремих мікотоксинів, перспектив відбору індикаторних штамів і оцінки можливої ролі в системі взаємовідносин „людина (тварина) - патоген”.
Особливо цікавою видається різниця в чутливості до афлатоксину штамів бацил, виділених від урологічних хворих людей, та штамів, виділених від здорових телят. Більша чутливість останніх повинна насторожувати в плані санітарно-токсикологічних профілактичних заходів щодо кормової бази тварин, оскільки дисбактеріози можуть суттєво ускладнювати перебіг аліментарних мікотоксикозів. З іншого боку, досліджені штами Грам+ спороутворюючих коків відрізняє значно вища специфічність в чутливості до афлатоксину В1 і патуліну.
Дослідження чутливості зелених водоростей також дозволило виявити ряд штамів, перспективних для визначення Т-2 токсину та дезоксиніваленнолу. При цьому слід наголосити, що чутливість зелених водоростей до мікотоксинів може слугувати і надійним тестом на їх фітотоксичну активність (Зольникова, 1979; Zaichenko et al., 1989).
Ця обставина робить перспективним використання в мікробіологічних методах індикації мікотоксинів саме цих мікроорганізмів. Ряд таких штамів пропонується нами для включення в банк індикаторних мікроорганізмів (табл. 4).
Таблиця 4
Штами фітопатогенних бактерій, Грам+ спороутворюючих коків та зелених водоростей, перспективних для індикації мікотоксинів
№ п/п Види Штами Мікотоксини, що визначаються
1 Pseudomonas syringae pv syringae 8512 патулін
2 Erwinia aroidea 9034 патулін, зеараленон
3 E. aroidea 8636 — // —
4 E. papulina 9042 — // —
5 E. pyri 8474 — // —
6 E. carotovora 11T — // —
7 Xanthomonas campestris pv begonia 1a зеараленон
8 Bacillus subtilis 12a патулін
9 B. subtilis 332 афлатоксин В1
10 B. subtilis 617 патулін
11 B. pumilis 303 патулін
12 B. cereus 54 афлатокин В1
13 B. cereus 432 патулін
14 B. licheniformis 248 патулін
15 B. licheniformis 11 патулін
16 B. licheniformis 69 афлатоксин В1
17 Chlorella vulgaris 189 Т-2 токсин, дезоксиніваленол
18 C. vulgaris 326 Т-2 токсин
19 C. kessleri 200 — // —
20 C. kessleri 201 дезоксиніваленол
ВИСНОВКИ
1.Досліджено антибіотичні властивості афлатоксину В1, патуліну і зеараленону щодо 80 штамів фітопатогенних бактерій — представників рр. Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas та 47 штамів Грам+ спороутворюючих коків, виділених від урологічно хворих людей і від здорових телят та деяких трихотеценових мікотоксинів (Т-2 токсин, веррукарин А, рорідини А і Н) щодо 506 штамів дріжджів, представлених 24 видами та 10 родами, та 16 штамів зелених водоростей, представлених 2 видами.
На основі одержаних даних сформовано банк індикаторних культур дріжджів (21 штам), фітопатогенних бактерій (7 штамів), Грам+ спороутворюючих коків (9 штамів) та зелених водоростей (4 штами), перспективних для розробки мікробіологічного методу визначення мікотоксинів.
2.Удосконалено метод екстракції дезоксиніваленолу. Використання системи ацетонітрил:вода (3:1) забезпечує найбільшу її ефективність (на 45 - 100 % вищу від пропонованої стандартизованими методами), а, відповідно, і адекватність результатів аналізів продуктів харчування, кормів та продовольчої сировини при оцінці їх санітарно-токсикологічних показників.
3.Одержано в кристалічному вигляді афлатоксин В1 (176,3 мг), рорідин Н (172 мг) та дезоксиніваленол (427 мг). Ідентичність одержаних препаратів підтверджена загальноприйнятими методами.
4.В результаті культивування D. polymorphus 396 на середовищі з Т-2 токсином в продуктах його метаболізму виявлені малотоксичні НТ-2 токсин та Т-2 тетраол. В лабораторних умовах показана принципова можливість інактивації Т-2 токсину за допомогою штаму D. polymorphus 396, який проявляв токсин-залежний ріст, що вперше встановлено для трихотеценових мікотоксинів.
5.Сукупність властивостей, які визначають відношення дріжджів до трихотеценових мікотоксинів, дає підстави стверджувати можливість використання їх як додаткової таксономічної ознаки при видовій диференціації.
6.Дослідження антибіотичної дії патуліну та зеараленону щодо фітопатогенних бактерій показало їх високу і специфічну чутливість до цих метаболітів, що робить їх перспективними для використання в мікробіологічному методі індикації.
7.Встановлено, що досліджені штами B. subtilis, виділені від урологічно хворих людей, проявляють специфічну чутливість до афлатоксину В1, в той час як штами B. licheniformis того ж походження — до патуліну.
8.Показано, що неідентифіковані штами Грам+ спороутворюючих коків, виділені з кишковика здорових телят, характеризуються більш високою чутливістю як до афлатоксину В1, так і патуліну. Обидва мікотоксини проявляють статичну дію щодо досліджених штамів бацил.
9.У мікробіологічному методі визначення мікотоксинів в зерні і зернопродуктах як індикаторні культури рекомендуються: Candida kefyr 899 (Т-2 токсин); Bacillus subtilis 608(3) (афлатоксин В1); Erwinia aroidea 9034 (зеараленон); Erwinia papulina 9042 (патулін); Chlorella vulgaris 189 (T-2 токсин і дезоксиніваленол).
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Кобзиста О.П., Зайченко О.М. Мікробіологічна інактивація Т-2 токсину // Современные проблемы токсикологи. — 2001. — №1.— С. 39 - 41.
2. Зайченко О.М., Рубежняк И.Г., Кобзистая О.П. Макроциклические трихотеценовые микотоксины: продуценты, распространение, определение, физиология токсинообразования, токсигенный потенциал // Современные проблемы токсикологии. — 2001. — №2. — С. 56 – 62.
3. Кобзиста О.П., Зайченко О.М. Фунгістатичні властивості трихотеценових мікотоксинів та їх практичне значення // Науковий вісник Ужгородського університету. — Серія „Біологія”. — №10. — Ужгород, 2001. — С. 141 – 143.
4. Кобзистая О.П., Зайченко О.М. Антибиотические свойства некоторых микотоксинов // Современная микология в России — 1-й съезд микологов России, Москва — апрель, 2002. — С. 265.
5. Кобзиста О.П. Удосконалений метод визначення дезоксиніваленолу в зерні та зернопродуктах // Збірка матеріалів конференції — Всеукраїнська конференція молодих вчених. — Київ, 2002.
АНОТАЦІЯ
Кобзиста О.П. Антибіотичні властивості мікотоксинів та деякі напрямки їх практичного використання. — Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 — мікробіологія. — Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2002.
Дисертація присвячена дослідженню антибіотичних властивостей регламентованих (афлатоксин В1, патулін, зеараленон, Т-2 токсин і дезоксиніваленол) та деяких інших (веррукарин А, рорідини А і Н) мікотоксинів щодо 506 штамів дріжджів, 80 штамів фітопатогенних бактерій, 47 штамів Грам+ спороутворюючих коків та 16 штамів зелених водоростей.
На основі одержаних результатів сформовано банк індикаторних культур (41 штам) для мікробіологічного визначення мікотоксинів в харчових продуктах, кормах для тварин та виробничих субстратах.
Одержані в кристалічному вигляді афлатоксин В1 (176,3 мг), рорідин Н (172 мг) і дезоксиніваленол (427 мг).
В лабораторних умовах вперше показана принципова можливість інактивації Т-2 токсину за допомогою дріжджового штаму Debaryomyces polymorphus 396, який проявляв токсинозалежний ріст.
Встановлено, що сукупність властивостей, які визначають відношення дріжджів до трихотеценових мікотоксинів може бути використана як додаткова таксономічна ознака при їх видовій диференціації.
Запропоновано мікробіологічний експрес-метод індикації мікотоксинів в різних субстратах на основі застосування відібраних тест-організмів та відпрацьовані оптимальні умови їх інкубації.
Ключові слова: мікотоксини, індикаторні культури, інактивація, мікробіологічний метод.
АННОТАЦИЯ
Кобзистая О.П. Антибиотические свойства микотоксинов и некоторые направления их практического использования. — Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 — микробиология. — Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2002.
Диссертация посвящена исследованию антибиотических свойств регламентированных (афлатоксин В1, патулин, зеараленон, Т-2 токсин и дезоксиниваленол) и некоторых других (веррукарин А, роридины А и Н) микотоксинов в отношении 506 штаммов дрожжей, 80 штаммов фитопатогенных бактерий, 47 штаммов Грам+ спорообразующих кокков и 16 штаммов зеленых водорослей.
На основании полученных результатов сформировано банк индикаторных культур (41 штамм) для микробиологического определения микотоксинов в пищевых продуктах, кормах для животных и производственных субстратах.
Исследована специфичность индикаторных культур в отношении чувствительности к широкому набору микотоксинов.
В лабораторных условиях впервые показана принципиальная возможность инактивации Т-2 токсина при помощи дрожжевого штамма Debaryomyces polymorphus 396, проявляющего токсинозависимый рост. В продуктах метаболизма Т-2 токсина обнаружены менее токсичные НТ-2 токсин, Т-2 тетраол и другие вещества, окрашиваемые 4п-(нитробензил)пиридином.
Установлено, что совокупность свойств, определяющих отношение дрожжей к трихотеценовым микотоксинам, может быть использована в качестве дополнительного таксономического признака при их видовой дифференциации.
Исследование антибиотических свойств патулина и зеараленона в отношении фитопатогенных бактерий — представителей рр. Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas — показало их высокую и специфическую чувствительность к этим метаболитам, в то время как изученные Грам+ спорообразующие кокки характеризовались более высокой чувствительностью как к патулину, так и к афлатоксину В1.
Предложен набор индикаторных культур для использования в микробиологическом методе определения микотоксинов и отработаны оптимальные условия их инкубации.
Ключевые слава: микотоксины, индикаторные культуры, инактивация, микробиологический метод.
ABSTRACT
Kobzistaya O.P. The antibiotic properties of mycotoxins and some directions of its practical use. – Manuscript.
Thesis for a candidate's degree by speciality 00.03.07 – microbiology. – D.K. Zabolotny Institute of microbiology and virology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.
The dissertation is devoted to the investigation of antibiotic properties of the regulated mycotoxins such as aflatoxin B1, patulin, zearalenon, T-2 toxin and deoxynivalenol and some others (verrucarin A, roridins A and H) to 506 strains of yeasts, to 80 strains of phytopatogenic bacteria, to 47 strains of Gram+ spore-former coccuses and to 16 strains of green alga.
On the bases of the obtained results the bank of indicator cultures (41 strains) for the microbiological determination of mycotoxins in food products, forage and industrial substrates were created.
Aflatoxin B1 (176,3 mg), roridin H (172 mg) and deoxinivalenol (427 mg) were obtained in crystalline form.
The principle possibility of T-2 toxin inactivation by yeast strain Debaryomyces polymorphus 396, which performed toxin-dependent growth, were shown.
It was established that sum of properties, which determine the attitude of yeasts toward trichothecene mycotoxins, can be used as additional taxonomic characteristic for their specific differentiation.
The microbiological express-method of mycotoxins indication in the different substrates on the base of selected test-organisms has been proposed, optimal conditions of incubation has been worked out.
Key words: mycotoxins, indicator cultures, inactivation, microbiological method.
| 
