Библиотечный каталог авторефератов Украины

Міністерство охорони здоров’я України

Львівський національний медичний університет

імені ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

Ель Ідріссі Абдеррахім

УДК 615.31+547.655.6

СИНТЕЗ ТА БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ
НОВИХ АМІНОКИСЛОТНИХ ПОХІДНИХ 1,4-НАФТОХІНОНУ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Львів – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології Національного університету “Львівська політехніка” Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник:        доктор хімічних наук, професор

Новіков Володимир Павлович,

Національний університет “Львівська політехніка”,

завідувач кафедри технології біологічно активних

сполук, фармації та біотехнології

Офіційні опоненти:        доктор фармацевтичних наук, професор

Владзімірська Олена Василівна,

Львівський національний медичний університет

імені Данила Галицького,

професор кафедри фармацевтичної, органічної та біоорганічної хімії

доктор фармацевтичних наук, професор

Коваленко Сергій Іванович,

Запорізький державний медичний університет,

професор кафедри фармацевтичної хімії

Провідна установа:        Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика

                               МОЗ України, кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії.

Захист відбудеться 27.04.2004 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.600.02 у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 69.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Львівського національного медичного  університету імені Данила  Галицького (79000, м. Львів, вул. Січових Стрільців, 6).

Автореферат розісланий 25.03.2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                                           Гасюк Г.Д. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження в області синтезу нових біологічно активних сполук з подальшим пошуком серед них лікарських препаратів, розробка новітніх технологій їх одержання є актуальним завданням сьогодення .

Амінокислоти та їх похідні - клас біологічно активних природних сполук, використання яких в медичній практиці є ефективним та обґрунтованим при лікуванні широкого кола хвороб і пато­логічних станів. В теперішній час на стадії розробки та клінічної апробації знаходиться ряд лікарських засобів на основі амінокислот та їх аналогів. Серед похідних амінокислот викликає не­абиякий інтерес карнозин - природний дипептид, який виявляє широкий спектр фізіологічної дії. Властивості карнозину складають основу його лікувального ефекту. Є посилання про використання карнозину для лікування поліартритів, виразкової хвороби, есенціальної гіпертонії, катаракти тощо. Проте в ряді випадків карнозин є менш ефективним, ніж його похідні. Крім того, карнозин в організмі швидко руйнується під дію ферменту карнозинази. Тому пошук нових похідних природних дипептидів є цікавим як з теоретичної, так і з практичної точки зору.

Одним з розділів сучасної фармацевтичної та органічної хімії, що динамічно розвиваються, є хімія хіноїдних сполук, в якій важливе місце посідають нафтохінон та його похідні. Сполуки цього класу викликають інтерес завдяки фізіологічним, хімічним, фізико-хімічним властивостям, зокрема здатності до зворотнього окисно-відновного процесу, що зумовлює різноманітну високу біологічну активність похідних 1,4-нафтохінону.

У зв’язку з особливою цінністю нафтохінонів та амінокислот незаперечний інтерес становлять дослідження з синтезу сполук, що містять одночасно амінокислотні фрагменти і хіноїдну систему зв’язків, оскільки вони можуть бути потенційними лікарськими засобами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами. Дисертаційна робота є частиною фундаментальних досліджень кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології Національного університету “Львівська політехніка” (№ держреєстрації 0100U000518), і виконана у відповідності з державними науково-технічними програмами 03.06 “Нові екологічно безпечні лікувальні засоби“ та 1.02 „Створення, вивчення та впровадження в практику охорони здоров’я України гостро необхідних лікарських засобів”, що є підтвердженням актуальності та перспективності даних досліджень.

Мета роботи. Метою даної роботи був синтез нових 2,3-дизаміщених-1,4-нафтохінонів з амінокислотними фрагментами, вивчення їх комплексоутворення з катіонами металів та пошук серед них ефективних і малотоксичних біологічно активних речовин - потенційних лікарських засобів.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

• одержати нові амінокислотні похідні 1,4–нафтохінону, та розробити зручні методи їх синтезу;
• синтезувати карнозинвмісні 1,4-нафтохінони - новий клас хіноїдних сполук;
• розробити метод комплексоутворення амінокислотних 1,4-нафтохінонів з катіонами металів;
• вивчити токсичність та біологічну активність синтезованих сполук;

• розробити і спроектувати технологію виробництва найбільш перспективної потенційної лікарської субстанції.

Об’єктами дослідження були реакції нуклеофільного заміщення у синтезі амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону, комплексоутворення останніх з катіонами металів, визначення біологічної активності, технологія виробництва потенційної лікарської субстанції .

Предметом дослідження стали 2,3-дизаміщені-1,4-нафтохінони та їх хелатні форми для пошуку нових біологічно активних сполук.

Методи дослідження: органічний синтез, спектральні методи (ІЧ-, ПМР-, МБ-, УФ-спектро­скопії), елементний аналіз, тонкошарова хроматографія, біологічний і фізіологічний скринінг, математичні та конструкторські розрахунки.

Наукова новизна одержаних результатів:

• вперше синтезовано нові амінокислотні похідні 1,4-нафтохінонів, їх калієві та натрієві солі, вдосконалені методи їх одержання;
• оптимізовано метод комплексоутворення 2-N-R-аміно-3-хлор-1,4-нафтохінонів з катіонами міді, цинку, кобальту, заліза, хрому, що призвело до створення нових оригінальних металокомплексів;
• вперше синтезовано карнозинвмісні нафтохінони і хелати міді та цинку на їх основі;
• розроблено і опрацьовано ефективну схему синтезу 2-D,L-карнозин-3-хлор-1,4-нафтохінону;
• вивчено будову синтезованих амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону та їх хелатів за допомогою сучасних фізико-хімічних методів аналізу (ПМР-, ІЧ-, УФ- і МБ-спектри);
• Вивчена токсичність, а також протигіпоксична, протиішемічна, антимікробна, антидерматитна, фунгіцидна та рістрегулююча дії групи синтезованих сполук
• виявлено ряд високоактивних сполук, активність яких в деяких випадках вища, а токсичність нижча за відповідні показники сучасних лікарських препаратів і еталонів.

Практичне значення одержаних результатів. Одержано нові низькотоксичні сполуки, які мають високу протигіпоксичну та протиішемічну активність і знаходяться на поглиблених фармакологічних дослідженнях, як потенційні лікарські препарати, що має вагоме значення для фармації і медицини.

Розроблені препаративні методики синтезу амінокислотних і карнозин похідних 1,4-нафто-хінону та металокомплексів на їх основі є фундаментальними дослідженням і мають істотне значення для теорії і практики органічної та фармацевтичної хімії.

Запроектовано автоматизовану технологічну схему виробництва субстанції 2-D,L-карнозин-3-хлор-1,4-нафтохінону, на основі якого розроблено склад нової  антидерматитної мазі.

Одержано нові низькотоксичні речовини, що виявляють сильну фунгіцидну, антимікробну, рістрегулюючу активності, які, в деяких випадках, перевищують показники еталонів і є перспективними для практичного застосування.

Одержані результати використовуються в науково-дослідній роботі та навчальному процесі Національного університету „Львівська політехніка”, Львівського Національного університету ім. І.Франка, наукових дослідженнях Відділення ФХ ТГК ІФХ НАН України, Інституту біології тварин УААН та на АТ „Галичфарм” (акти впровадження від 15.12.2003, 25.12.2003, 18.12.2003, 25.11.2003 та 17.12.2003 р. відповідно).

Особистий внесок здобувача

• Синтез 67 нових сполук в ряду дизаміщених 1,4-нафтохінону.
• Розробка нових методів синтезу амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону.
• Дослідження будови, реакційної здатності, деяких фізико–хімічних властивостей синтезо-
  ваних сполук.
• Оптимізація методу синтезу нових амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону та вивчення їх комплексоутворення з катіонами металів.

• Вивчення біологічної активності одержаних сполук та виявлення серед них високоактивних та малотоксичних речовин.

Апробація та публікація результатів досліджень. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на XIX Українській конференції з органічної хімії (Львів, 2001), Міжнародній науково-практичній конференції „Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002), IV регіональній конференції молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2002), семинары координационного совета с проблемой „Научные основы создания лекарственных препаратов” (Гурзуф, 2003), Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Біотехнологія. Освіта. Наука” (Київ, 2003).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з яких 3 – у наукових фахових виданнях, 4 – у  фахових виданнях з органічної хімії, 5 робіт – у матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з переліку умовних скорочень, вступу, п’яти розділів, загальних висновків, списку літератури, який містить 147 джерел та п’яти додатків (5 с.) Загальний обсяг дисертації – 137с., робота ілюстрована 21 таблицею (11 с.)та 11 рисунками (1 с.).

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовується вибір теми та її актуальність, формулюється завдання досліджень та основні положення, що виносяться на захист, відмічаються наукова новизна і практичне значення одержаних результатів.

У першому розділі представлено дані літератури з функціонального значення хінонів, короткий огляд методів синтезу та перетворень відомих амінокислотних похідних
1,4-нафтохінону; наведено дані з біологічної активності похідних 1,4-нафтохінону та
D,L-карнозину.

У другому розділі наведено обговорення експериментальних результатів щодо синтезу нових амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону та їх металокомплексів.

З цією метою розроблено новий спосіб синтезу амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону на основі 2,3-дихлор1,4-нафтохінону (9), що дозволило збільшити вихід кінцевого продукту на 10-20%. На додачувнення цікаво було дослідити перебіг цих реакцій з амінокислотами, що містять декілька альтернативних нуклеофільних центрів.Як амінокислотну компоненту було використано: α- і β- аланін, гістидин, аргінін, триптофан, метіонін.

Витримка 2,3-дихлор-1,4-нафтохінону (9) з еквімолярною кількістю амінокислоти у водно-спиртовому середовищі при 60 0С протягом 6 год. у присутності триетиламіну або карбонату калію приводить до одержання з доволі високими виходами (65-86%) відповідних 2-амінокислотних заміщених 1,4-нафтохінонів (41-46). Тут, і надалі, будову всіх синтезованих сполук підтверджено результатами елементного аналізу, ТШХ, спектральними даними.

Так, наприклад, в спектрі ПМР (δ,м.д.) 2-метіоніно-3-хлор-1,4-нафтохінону (46) присутні сигнали синглету трьох протонів метильної групи при 2. 139 та мультиплету двох протонів метиленової групи при 2.648-2.685, які зв’язані з атомом сірки. Накладені мультиплети двох метиленових протонів при 1.250-1.587, синглет протону аміногрупи та мультиплет чотирьох ароматичних протонів в області від 7.659 до 8.227 однозначно підтверджують будову сполуки (46).

В ІЧ-спектрах амінопохідних 1,4-нафтохінону (41-46) спостерігаються характерні смуги валентних коливань -NH- групи при ~ 3400 см–1. Смуги при 1642-1675 см–1 відповідають поглинанню карбонільних груп хіноїдного ядра, а в ділянці 1684-1720 см –1 проявляються інтенсивні смуги валентних коливань карбонільної групи СООН-фрагментів.

Для надання більшої водорозчинності амінокислотним похідним (41-46) з метою подальшого їх використання в комплексоутворенні та  випробування на кардіостимулюючу активність, було синтезовано їх калієві ( 47-52 ) та натрієві (53-58) солі.

Вперше синтезовані комплексні солі мікроелементів з амінокислотними похідними
1,4-нафтохінону (41-46). Як центральний йон використано катіони: Fe2+ , Zn2+ , Сu2+, Mn2+ , Со2+, Сr3+, а координаційними лігандами виступили аміногрупи амінокислотних фрагментів та молекули води. Нами розроблено і запропоновано декілька варіантів синтезу хелатів.

А. Додавання еквімолярної кількості карбонату металу до водно-спиртового розчину амінокислотних похідних (41-46) з наступним кип’ятінням реакційної маси протягом 2-3 годин.

Б. До спиртового розчину натрієвих солей амінокислотних похідних (53-58) додають насичені водні розчини нітратів, сульфатів чи хлоридів відповідних металів при 60 0С і витримують протягом 0,5 години.

В. У водному розчині лугу при 40-50 0С поступово розчиняють еквімолярну кількість амінокислотної похідної (41-46), додають 2 мл поліетиленгліколю (PЕG), поступово додають водний розчин солі металу і витримують протягом 0,25-0,5 години.

Найкращі результати були одержанні при використанні методів Б і В.

У випадку комплексоутворення з α-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-аланіном (41) утво­рюються дигідрати ди-[α-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-аланілат] металу ( 64-68 ) октаедричної форми з утворенням двох п’ятичленних аквакомплексних кілець.

У випадку β-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-аланіну (42), ізомерного сполуці (41), також утворюються дигідрати ди[β–N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)аланілат]металу (69-73) октаедричної форми з утворенням двох шестичленних аквакомплексних кілець.

Взаємодія гістидин – (43), аргінін - (44) і триптофан - (45) вмісних похідних з солями d-металів призводить до утворення у випадку гістидин- і триптофан- похідних (43,45) до утворення дигідратів ди[α- N-( 2-хлор-1,4 –нафтохіноніл-3)гістидинат]металу (74-76 ) і дигідратів ди[α-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)триптофанілат]металу (77-79), відповідно, а у випадку аргінінопохідного (45)- дигідратних аквакомплексів не утворюється.

В перших випадках це пояснюється стеричними перепонами, що виникають через взаємне відштовхування π-орбіталей нафтохіноїдного і гісти­динового чи триптофанового циклів, і незважаючи на те, що угруповання -NH- і -N= в спектро­хімічному ряді активніші за молекули H2O (тобто здатні активніше викликати розщепленя d-рівня металу), за геометричними параметрами неможливе утворення між ними комплексних зв’язків.

У випадку аргінінопохідного (45) завдяки відсутності стеричних затруднень утворюються координаційні зв’язки між вільною аміногрупою аргініну та катіоном металу. Одержані ди[ α-N- (2-хлор-1,4-нафтохіноніл ) аргінінат ] метали (80-82) не містять в утворених комплексах воду як ліганд.

Обробка N-(2-хлор-1,4-нафтононіл-3)-метіоніну (46) солями металів призводить до одер­жання бажаних хелатних похідних (83-85).

У випадку використання в якості катіона Cr3+ N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)–метіонін (46) вступає у процес комплексоутворення з одержанням найбільш ймовірної димерної структури– аквакомплексу гексагідрату гекса-[N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)метіонілат дихрому (86).

Координаційне число Cr3+ дорівнює шести, тому його комплекси мають форму октаедра і валентні електрони розташовуються виключно на зв’язуючих δ зв і незв’язуючих (πd )2  орбіталях.

де: Me2+= Cu2+ (83), Zn2+ (84), Fe 2+ (85)

Аналіз ІЧ-спектрів вихідних α(в)-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-аланінів (41-42) та синте­зованих ди[α(в)-(-N-2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-аланінат]-діакваметалів (64-73) свідчить, що зникнення смуг поглинання незв’язаної групи -NH- при 3450 см –1 (валентні коливання) та в області 1190 -1200 см –1 (плоскі деформаційні коливання), з одного боку, і наявність характе­ристичних смуг поглинань зв’язаних -NH- груп в області 2900 см  –1, з іншого боку, у синтезованих продуктах (64-73 ) є доведенням існування координаційного зв’язку між угрупованням NH- та йоном металу. Утворення координаційного зв’язку між атомом кисню карбонільної групи хіно­їдного кільця з йоном металу неможливе через стеричні перепони і підтверджується спектрально відсутністю зсуву смуги поглинання валентних коливань С=О групи у високочастотну область.

Додатковим і вагомим доказом структури синтезованих комплексів є інформація, що була одержана з допомогою даних Месбауерської (МБ) і електронної спектроскопій.

Встановлено, що МБ-спектр солі двовалентного заліза-лактату (еталонний взірець для порівняння) при 298 K характеризується дублетом з наступними параметрами: ізомерний зсув
δЕ = 1,47 мм/с і квадрупольне розщеплення ΔЕ=1,68 мм/с, що відповідає існуванню йону Fe2+ у чотирьохкоординованому стані. МБ-спектр ди[β-N-(-2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)аланілат]діаква-заліза (71) є суперпозицією двох дублетів. Параметри першого дублета (δ = 0,54 мм/с і
ΔЕ = 0,96 мм/с) відрізняються від параметрів МБ-спектрів двохвалентного лактату заліза і є характерним для йону Fe2+ з більшим координаційним числом, що є можливим виключно за рахунок приєднання додаткових лігандів (рис. 1).

Рис. 1. МБ-спектр ди[ β-N-(2-хлор-1,4-нафтохі­ноніл –3) аланінат] диаква заліза (71) при 298

Подібність кривих електронних спектрів хелатів вільних амінокислот (59-63) і на основі
1,4-нафтохінону (83-85) однозначно підтверджує комплексоутворення останніх (83-85) (рис. 2, 3).

Необхідно відзначити, якщо комплексоутворення суттєво не змінює електронну оболонку атомів, що входять у спряжену систему зв’язків, як у нашому випадку, то може спостерігатися навіть незначний гіпсохромний зсув. Однак у всіх випадках комплексоутворення супро­воджується збільшенням інтенсивності поглинання і значним розширенням смуги поглинання.

Рис. 2. Електронні спектри 1-диметіонат міді дигідрату (59)
і 2-ди[N-(2-хлор-1,4-нафтохі-Ноніл-3)метіонілат] міді дигідрату (83) у воді

Рис. 3. Електронні спектри 1- ди[в-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)аланінат] цинку дигідрату (70)
і 2- в-N-2-аланіл-3-хлор1,4-нафтохінону у воді

Співставляння електронних спектрів амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону до і після комплексоутворення показує, що при однаковій концентрації досліджуваних об’єктів чітко спосте­рігаються вищезгадані закономірності, а гіпсохромний ефект при переході від 2-N-β(-3-хлор-
1,4-нафтохіноніл)аланіну (42) до ди[2-N-β(3-хлор-1,4-нафтохіноніл)аланінінат]цинку дигідрату (70) зумовлений втратою сильної електронодонорної аміногрупи при утворенні хелатної форми.

Природний карнозин (β-аланін-L-гістидин) виявляє широкий спектр фізіологічної дії і для одержання карнозинопохідних 1,4-нафтохінону нами запропоновані декілька підходів.

Взаємодія природного L-карнозина (87а) з 2,3-дихлор-1,4-нафтохіноном (9) призводить до
2-L-карнозин-3-хлор-1,4-нафтохінону (88).

В ІЧ-спектрі 2-L-карнозин-3-хлор-1,4-нафтохінону (88) спостерігаються характерні  смуги поглинання: широка при 2980-2740 см-1, смуга при 1715 см-1, і характеристична смуга середньої інтенсивності при 945 см -1 відносяться до поглинання СOOH-групи; 3420 см -1 - валентні коливання смуги N-H пірольного циклу, 3350 см -1- валентні коливання N-H- зв’язків; 1680 см -1 - валентні коливання карбонільної хіноїдної групи в спектрі ПМР (δ, м.д.) в СDCl3 цієї сполуки також спостерігаються характерні сигнали протонів:

Для другого підходу розроблена схема синтезу синтетичного 2-D,L-карнозин-3-хлор-
1,4-нафтохінону (90).

Обробка β-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-аланіна хлористим тіонілом в сухому діоксані при 50 оС призводить до хлорангідриду β-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-амінопропіонової кислоти (89), при витримці якого в ацетоні з гістидином у присутності триетиламіну при 50о С утворюється 2-D,L-карнозин-3-хлор-1,4-нафтохінон (90).

В умовах комплексоутворення відомих хелатів на основі чистого карнозину були проведені реакції взаємодії карнозинвмісних нафтохінонів (88,90) з сульфатами цинку і міді у співвідношенні 2:1.

Застосування кислотно-основного титрування, УФ, та ІЧ-спектроскопій однозначно дозволило встановити, що в координації з катіоном задіяні чотири атоми азоту, два з яких – атоми
-N3= імідазольного циклу, а не пірольні атоми – N1H. Ідентичність кривих кислотно-основного титрування та подібність електронних спектрів мідних комплексів на основі L-карнозину (87а), 2-L-карнозин-3-хлор-1,4-нафтохінону (88) та 2-D,L-карнозин-3-хлор-1,4- нафтохінону (90) вказує на однакову будову хелатних структур.

У третьому розділі наведені експериментальні результати досліджень синтезованих сполук на біологічну активність. Характеризуючи дані гострої токсичності (табл. 1), можна зазначити, що нафто­хінони (48, 49, 47, 90) можуть бути віднесені до речовин з середньою токсичністю, оскільки їх LD50 знаходиться в межах 225-400 мг/кг, а 2-L-карнозин-3-хлор-1,4-нафтохінон (88) - до низькотоксичних речовин, оскільки його показник LD50 більший 500 мг/кг і знаходиться в межах 540-650 мг/кг.

При дослідженні антигіпоксичного ефекту встановлено, що в умовах гострої експери­ментальної асфіксії у щурів нафтохінони (47,48,49,50,88,90) в дозах, що дорівнюють 1% їх LD50 не поступаються еталонному антигіпоксанту – емоксипіну (10 мг/кг) (табл.2), а амінокислотні похідні (47,49) значно перевищують його за активністю.

Таблиця 1

Гостра токсичність похідних 1,4-нафтохінону при одноразовому введенні мишам

Таблиця 2

Вплив похідних 1,4-нафтохінону на тривалість біоелектричної активності серця щурів в умовах гострої асфіксії

Таблиця 3

Вплив похідних нафтохінону на летальність щурів з гострою ішемією головного мозку