|
ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.Н.КАРАЗІНА
БЕРЕЗНЯК Катерина Германівна
УДК 577.32
ВПЛИВ ГІДРАТАЦІЇ НА СТАБІЛЬНІСТЬ СПІРАЛЬНИХ ФОРМ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ РІЗНОГО АТ/GC - СКЛАДУ
03.00.02 – біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фізико-математичних наук
Харків - 2000Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усикова НАН України
Науковий керівник:
доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник
Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки
ім. О.Я.Усикова НАН України, провідний науковий співробітник (м.Харків).
Офіційні опоненти:
- доктор фізико-математичних наук, професор Димант Леонід Наумович, Севастопольський державний технічний університет, професор (м.Севастополь);
- доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник
Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім.Б.І.Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник (м.Харків).
Провідна установа:
Донецький державний університет, кафедра біофізики, м.Донецьк.
Захист відбудеться "22" червня 2000 року о 1600 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному
університеті ім. В.Н.Каразіна, 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4, ауд.7-4.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна: 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4.
Автореферат розісланий "19" травня 2000 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Для розуміння природи структурних перетворень, динамічних характеристик макромолекул і їхньої термодинамічної стабільності необхідно з'ясувати механізми взаємодії макромолекул нуклеїнових кислот (НК) з молекулами води. У зв'язку з цим активно здійснюється експериментальне та теоретичне вивчення гідратації НК.
Місця локалізації молекул води в різних структурах НК визначено із кристалографічних досліджень. Для з'ясування ролі води у стабілізації НК багатообіцяючими виявилися результати, що одержані при комп'ютерному моделюванні азотистих основ у парах і в стопках. Однак зараз практично відсутні експериментальні дані, які можна порівняти з теоретичними результатами для того, щоб більш глибоко зрозуміти енергетичну і пов'язану з нею структурну роль води у формуванні канонічних форм НК. Тому виникла необхідність одержання коректних експериментальних даних для оцінки енергії взаємодії біомолекул з водою, енергій водневих зв'язків в уотсон-криківських парах, стекінг- та інших типів взаємодії.
Вибір НК різного нуклеотидного складу як об'єкта дослідження пов'язано з тим, що збільшення кількості GC - пар призводить до підвищення термостабільності та ентальпії теплового переходу спіраль-клубок. Проведення термодинамічного дослідження переходу НК різного нуклеотидного складу з неупорядкованого стану в спіральні А- і В-форми дало б змогу виявити внесок молекул води в їхню термостабільність.
Інтерес до вивчення структурного стану НК при малому вмісті води і впливу низьких температур на структуру ДНК пов'язаний з проблемою вибору умов тривалого зберігання генетичного матеріалу.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з держбюджетними темами відділу молекулярної та прикладної біофізики Інституту радіофізики та електроніки НАН України "Структура и стабильность системы биополимер-вода-биологически активное вещество при воздействии температуры и излучений" (шифр "Кор", № 01.92U027978, постанова Бюро ВФА НАН України від 11.12.91, протокол №10), "Дослідження фізичних особливостей гідратованих біополімерів з урахуванням впливу іонізуючої радіації" (шифр "Гран", №01.96U006110, постанова Бюро ВФА НАН України від 19.12.95, протокол №9), "Експериментальні та теоретичні дослідження гідратно-залежних процесів стабілізації структури природних та модельних нуклеїнових кислот" (№2.4/759, виконується за проектом Державного фонду фундаментальних досліджень). Фінансова підтримка роботи частково забезпечувалася за рахунок гранта INTAS-97-31753.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з'ясування ролі гідратного оточення у формуванні та стабілізації спіральних структур синтетичних і природних НК різного нуклеотидного складу. Для досягнення мети вирішувались такі задачі:
- Одержання методами ІЧ-спектроскопії та п'єзогравіметрії експериментальних даних про механізм заповнення молекулами води гідратно-активних центрів природних ДНК різного AT/GC-складу та модельних двоспіральних полінуклеотидів, а також виявлення інтервалів сорбції води, у яких відбувається формування канонічних структур НК.
- Експериментальне визначення величин енергії зв'язування молекул води з НК (енергетичний "спектр") у широкому діапазоні відносної вологості (ВВ).
- Оцінка внесків різних типів взаємодій у загальну енергію стабілізації спіральних структур НК різного нуклеотидного складу за отриманими експериментальними даними.
- Вивчення впливу низьких температур на гідратну оболонку та структурний стан ДНК при різних значеннях ВВ.
Наукова новизна одержаних результатів. Отримано ІЧ-спектри НК різного АТ/GC-складу в широкому інтервалі ВВ і визначено послідовність зв'язування молекул води з гідратно-активними центрами, проведено поділ гідратної оболонки на шари, що формують А- і В-форми НК. Розраховано значення абсолютної інтенсивності смуг поглинання азотистих основ нуклеотидів і полінуклеотидів у розчинах D2O.
Вперше отримано експериментальні величини енергій зв'язування молекул води з НК на різних стадіях формування спіральних структур, що дозволило виявити основні типи взаємодій, що стабілізують А- і В-форми НК. Встановлено, що незалежно від нуклеотидного складу внесок енергії взаємодії молекул води з гідратно-активними центрами НК складає ~70%, внесок енергії водневих зв'язків в уотсон-криківських парах - ~25%. Інші типи взаємодій істотно не впливають на стабілізацію.
Оцінка змін термодинамічних параметрів при викликаному гідратацією переході НК у спіральну конформацію показала, що при малому вмісті води (Р-форма) полінуклеотиди та ДНК знаходяться в частково упорядкованому стані. Термостабільність GC - збагачених НК забезпечується, в основному, їхньою взаємодією з водою.
На основі аналізу ІЧ-спектрів вологих плівок ДНК при кімнатних і низьких (до 80 К) температурах пояснено природу зменшення поперечних розмірів жолобків ДНК при зниженні температури. Це зв'язано зі скороченням довжин водневих зв'язків між молекулами води та ДНК і у водних містках. Виявлено повну оборотність низькотемпературних структурних змін ДНК.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні результати дозволили поглибити існуючі уявлення про роль води як стабілізатора при формуванні спіральних структур НК. Це сприяє більш глибокому розумінню фізичних процесів при функціонуванні ДНК у живих системах.
Систематичні дані відносно інтенсивності смуг поглинання азотистих основ можуть бути використані для розрахунку резонансних частот поза- та внутрішньокільцевих коливань азотистих основ.
Виявлена при низьких температурах оборотність структурних змін ДНК, а також залежність величини фракції води, що не вимерзає, від сольового складу у системі ДНК - вода - іони дозволяють вибрати такі умови зберігання ДНК, за яких значно зменшено шкідливу дію низьких температур. Частина міцно зв'язаної води регулюється вмістом солі в системі. Ці результати можуть використовуватись при розробці режимів консервації біологічних матеріалів у кріобіології та кріомедицині.
Особистий внесок здобувача. В опублікованих спільно зі співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає:
у роботах [1, 6, 7, 9] - у розробці методики та одержанні ІЧ-спектрів при низьких температурах, обробці й аналізі отриманих результатів;
у роботах [2, 8] - у проведенні ІЧ-спектроскопічних вимірів, обробці й інтерпретації одержаних результатів, обгрунтуванні висновків;
у роботах [3, 10, 11] - у розрахунках енергетичних внесків, проведенні термодинамічного аналізу та узагальненні результатів;
у роботах [4, 5] - у виконанні розрахунків для розвитку методики аналізу змін спектральних параметрів смуг поглинання.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи за темою дисертації доповідались і обговорювались на:
- II Международной конференции "Молекулярные основы биотехнологии", Пущино, 1987;
- VI конференции по спектроскопии биополимеров, Харьков, 1988;
- Международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины", Харьков,1989;
- Second World Congress of Theoretical Organic Chemistry, University of Toronto, Canada, 1990;
- II з’їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 1998;
- International Conference "Physics of Biological Systems", Pouskcha-Vodytsa, Kiеv, 1998;
- II съезде биофизиков России, Москва, 1999;
- Symposium "Theoretical physics and biology", Kiev, 1999;
- семінарі Харківського відділення Українського біофізичного товариства, Харків, 2000.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 наукових робіт, у тому числі 5 статей у наукових журналах і 6 тез доповідей на конференціях.
Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, п'ятьох розділів, висновків і додатку. Матеріал дисертації викладено на 148 сторінках, з них 3 стор. займає додаток, 10 стор. - 26 ілюстрацій, 6 стор. - 13 таблиць, 18 стор. - список використаних джерел (185 найменувань).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обгрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету і задачі дослідження, показано наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено дані про апробацію роботи.
Розділ 1 містить огляд літератури, присвячений сучасному теоретичному й експериментальному дослідженню гідратації НК, а також аналізу сил, що стабілізують їхні спіральні конформації. Наведено дані про структуру, фізико-хімічні властивості іон-гідратної оболонки, необхідної для існування вторинної структури НК, про специфіку взаємодії між молекулами води та гідратно-активними центрами біополімера. Розглянуто природу А↔В- переходів, що викликані зміною гідратації. На основі даних рентгено-структурного аналізу (РСА) показано, що стан гідратного оточення залежить від нуклеотидного складу та конформації подвійної спіралі, а частина молекул води є структурним елементом спіральних форм НК і бере участь у їхній стабілізації. Також розглянуто інші типи внутрішньо- та міжмолекулярних взаємодій (водневі зв'язки в уотсон-криківських парах, гідрофобні та стекінг-взаємодії, взаємодія при конформаційному підстроюванні), які стабілізують спіральні конформації НК, і наведено оцінки їхніх енергій. Показано, що недостатня кількість експериментальних даних, які можна було б порівняти з результатами теоретичних розрахунків, ускладнює розуміння енергетичної та структурної ролі води у формуванні і стабілізації канонічних форм НК різного нуклеотидного складу. У останній частині огляду обговорюється вплив низьких температур на структуру і гідратне оточення ДНК. Це питання важливе у зв'язку з проблемою кріоконсервації генетичного матеріалу. На підставі всіх наведених в огляді даних сформульовано основні задачі дослідження.
У розділі 2 наведено методи дослідження і подано характеристику вивчених зразків. Завдяки високій чутливості до міжмолекулярних взаємодій і структурних змін біополімерів для дослідження гідратації і конформаційних переходів НК використано метод ІЧ-спектроскопії. У розділі коротко розглянуто фізичну основу методу, надано характеристику спектральних параметрів смуг поглинання, наведено віднесення основних смуг поглинання НК (Tsuboi, 1974; Taillandier, 1990). Описано методики приготування плівкових зразків, одержання й обробки ІЧ-спектрів. Похибка визначення оптичної щільності складала не більше 2%, а частот - 1-2 см-1.
Для інтерпретації змін спектральних параметрів при гідратації і структурних переходах використовувалися емпіричні правила прояву водневого зв'язку, результати квантово-хімічного розрахунку гідрату 5'-ЦМФ⋅Na2 (Стариков, 1988) і розрахунків резонансних частот поза- та внутрішньокільцевих коливань азотистих основ (Семенов, 1990). Значення абсолютних інтенсивностей смуг поглинання азотистих основ, що необхідні для обчислення резонансних частот, отримано в роботі шляхом поділу перекритих смуг спектра методом багатогранника, що деформується (Химмельблау, 1975). Контури смуг поглинання апроксимувалися лінійною комбінацією функцій Гаусса та Лоренца.
Для оцінки впливу протиіонів на спектральні параметри смуг поглинання проведено квантово-хімічний розрахунок комплексу 5'-ГМФ⋅Na2⋅Н2О напівемпіричним методом ППДП/2 у spd-базисі хвильових функцій за допомогою програми, наданої Ю.Ф.Педашом. Виявилося, що переміщення іона Na+ відносно нуклеотиду викликає значні зміни електронної щільності, які поряд з впливом гідратації можуть призводити до змін спектральних параметрів, що спостерігаються на початковій стадії зволоження. Однак розділити ці ефекти в теперішній час неможливо.
У розділі коротко розглянуто метод п'єзогравіметрії, що використовувався для одержання ізотерм гідратації НК. Об'єктом дослідження були синтетичні полінуклеотиди poly(rG)-poly(rC) і poly(dA)-poly(dT), а також природні ДНК різного нуклеотидного складу: ДНК з Microcoсcus lysodeikticus (АТ/GC=0,28/0,72) та ДНК з Clostridium perfringens (АТ/GC=0,69/0,31). Для аналізу залучено дані, отримані раніше М.О.Семеновим та Т.В.Больбухом при дослідженні комплексу poly(rA)-poly(rU) та ДНК з тимуса теляти (АТ/GC=0,58/0,42).
У розділі 3 наведено результати ІЧ-спектроскопічного дослідження плівок НК у широкому інтервалі ВВ. На рис.1(а,б) як приклад показано спектри комплексу poly(rG)-poly(rC) в області поглинання сахарофосфатного ланцюга (1300-900 см-1) і азотистих основ (1800-1300 см-1). В процесі зволоження плівки відбуваються значні зміни спектральних параметрів.
Рисунок 1
Рис.1. ІЧ-спектри плівок комплексу poly(rG)-poly(rC) у недейтерованому (а) і дейтерованому (б) станах при ВВ: 1 - 0%; 2 - 32%; 3 - 76%.
Для надійно віднесених смуг поглинання побудовано залежності частот ν і відносних інтенсивностей R, визначених як відношення оптичних щільностей при i-й та нульовій вологостях, від числа молекул води n, що припадають на один нуклеотид. Типові залежності подано на рис.2.
На початковому етапі гідратації (ВВ<50%) спостерігаються низькочастотні зсуви та зріст інтенсивності більшості смуг поглинання, що зв'язано з установленням водневих зв'язків між молекулами води і гідратно-активними центрами НК. Одночасно гідратуються катіон-фосфатні групи, а також гідрофільні групи сахарів і азотистих основ, що призводить до утворення моногідратного шару.
Рисунок 2
Рис.2. Типові залежності частоти ν і відносної інтенсивності R від числа молекул води n, які припадають на один нуклеотид, для смуг поглинання сахарофосфатного ланцюга та полоси з максимумом 1710 см-1 зразків у Н2О, а також азотистих основ зразків у D2O.
При подальшому збільшенні ВВ починається процес переходу НК у спіральну конформацію. Високочастотні зсуви та гіпохромізм смуг поглинання поза- та внутрішньокільцевих коливань азотистих основ пов'язані з виникненням резонансних взаємодій коливальних моментів переходів при утворенні "стопок" основ. Формування спіральної структури також характеризується високочастотними зсувами структурно-чутливої смуги при 1710 см-1 та смуг поглинання фуранози внаслідок зміни її конформації. На цьому етапі гідратації утворюється упорядкований шар молекул води внутрішньої гідратної оболонки типу "центр-вода-центр" зі суцільною сіткою водневих зв'язків.
Перехід ДНК у В-форму супроводжується додатковим зв'язуванням молекул води й формуванням зовнішньої гідратної оболонки, що призводить до зросту інтенсивності та низькочастотним зсувом смуг поглинання деяких груп.
Максимум смуги поглинання валентних коливань ОН-груп води, яка зв’язана з НК, в процесі гідратації зміщується у високочастотну область від ν=3370 см-1, але для GC-збагачених зразків не досягає значення, характерного для рідкої води.
На основі аналізу залежностей ν і R від n визначено інтервали вмісту води, в яких НК існують у моногідратному стані, інтервали переходів в А- і В- спіральні конформації, а по насиченню спектральних параметрів знайдено ступені гідратації НК (табл.1). Інтервал моногідратного стану природних ДНК ширше, ніж модельних полінуклеотидів, а також вище їхній ступінь гідратації. Гідратна оболонка комплексу poly(rG)-poly(rC) містить на 3-4 молекули води на нуклеотид менше, ніж poly(rA)-poly(rU). Незалежно від нуклеотидного складу перехід ДНК із А- у В - форму відбувається при зв'язуванні більше 11 молекул води на нуклеотид.
Таблиця 1
Інтервали існування різних структурних форм полінуклеотидів і ДНК
У розділі 4 за допомогою комплексного методичного підходу до вивчення гідратації НК у системі НК - змінний вміст води проаналізовано внески різних типів взаємодій у загальну ентальпію стабілізації спіральних структур НК і проведено термодинамічний аналіз переходу НК із неупорядкованого стану в спіральні А- і В-форми в процесі гідратації. Значення ентальпії теплової денатурації Δ може бути подано у вигляді суми трьох доданків:
де  - надлишкова енергія гідратації при утворенні А- або В-форм НК;
 - енергія водневих зв'язків у парах основ;
 - енергія інших типів взаємодії.
З енергетичної точки зору i-ту молекулу води можна вважати "зв'язаною", якщо її енергія взаємодії Еi з відповідним гідратно-активним центром перевищує середню енергію взаємодії вода - вода в рідкій фазі, Е0 = 40,5 кДж/моль:
Рисунок 3
Значення ΔЕгідр оцінювалися із частотних зсувів максимуму смуги поглинання валентних коливань ОН-груп молекул води, які припадають на НК (рис.3), за допомогою співвідношення Беджера-Бауера:
Δν/ν0≅ΔЕ⋅1,2⋅10-2 (3)
На підставі обчислених значень ΔЕгідр, а також даних, отриманих Т.В.Больбухом при аналізі ізотерм гідратації НК і А.І.Гасаном при калориметричному вимірі ентальпії випарювання води з вологих плівок НК, побудовано усереднені залежності надлишкової енергії гідратації від числа молекул води, які припадають на один нуклеотид, для усіх вивчених полінуклеотидів і ДНК.
Рисунок 4
Рис.4. Залежність надлишкової енергії гідратації ΔЕгідр від вмісту молекул води n для ДНК різного нуклеотидного стану (суцільна лінія) та полінуклеотидних комплексів (пунктирна лінія).
Можна виділити три особливості на цих залежностях:
- усі функції ΔЕгідр(n) є монотонно спадаючими, тобто по мірі сорбції молекул води їхні енергії зв'язування з гідратно-активними центрами НК і молекулами води внутрішньої гідратної оболонки зменшуються;
- чим більше вміст GC - пар в складі НК, тим вище проходять залежності ΔЕгідр(n), тобто з гідратно-активними центрами комплексу poly(rG)-poly(rC) і ДНК з M.lysodeikticus молекули води утворюють більш міцні водневі зв'язки;
- надлишкова енергія гідратації на заключній стадії формування гідратних оболонок для комплексу poly(rG)-poly(rC) і ДНК з M.lysodeikticus має значний розмір, тобто молекули води в зовнішньому шарі взаємодіють між собою з більшою енергією, ніж в об'ємній фазі.
Із використанням величин ΔЕгідр для кожної молекули води (рис.4) і даних табл.1 отримано значення енергії зв'язування молекул води з НК на різних ступенях формування спіральних структур (табл.2). Повна надлишкова енергія гідратації природних ДНК більше, ніж полінуклеотидів, і її значення зростають при збільшенні вмісту GC - пар. Для переходу ДНК із А- в В-форму незалежно від нуклеотидного складу потрібні незначні витрати енергії. У останньому рядку таблиці наведено теоретичні значення ΔЕгідр для В-форми ДНК (Tumanyan, 1990), що задовільно узгоджуються з експериментальними величинами для ДНК із випадковою нуклеотидною послідовністю.
Таблиця 2
Розподіл енергій молекул води по шарам у полінуклеотидах
та ДНК різного нуклеотидного складу
Для оцінки енергії водневих зв'язків у комплементарних парах азотистих основ було використано значення середніх енергій водневих зв'язків в одиночних парах: 4,2 кДж/моль у AU(AT)-парі та 4,6 кДж/моль у GC-парі (Семенов, 1990). У випадку синтетичних полінуклеотидів враховувалася кількість водневих зв'язків у парі основ, а у природних ДНК - нуклеотидний склад:
де Δ і Δ - надлишкові енергії водневих зв'язків, відповідно, у AT- і GC-парах;
α - частка АТ-пар азотистих основ у складі ДНК.
Значення ентальпії теплової денатурації ΔНперех частково було взято з літератури, а для ДНК з M.lysodeikticus і ДНК з Cl.perfringens проведено калориметричне визначення ΔНперех у 0,1% водному розчині. У таблиці 3 наведено внески різних типів взаємодій у ΔНперех, визначенні з точністю 5-10%.
Звертає на себе увагу мале значення енергії інших типів взаємодії (у тому числі стекінг-взаємодії). Можливо, вони не впливають суттєво на стабільність структури ДНК, а стабілізація "стопок" азотистих основ здійснюється за рахунок водневих зв'язків. Не дивлячись на те, що значення
Таблиця 3
Типи енергій взаємодій у НК
енергії водневих зв'язків у парах зростає зі збільшенням вмісту GC-пар у зразку, її внесок у ΔНперех складає ~25-30% незалежно від нуклеотидного складу НК. Основним фактором, що стабілізує структуру синтетичних комплексів і природних ДНК (70-75%), є молекули води гідратної оболонки.
При структурних переходах, індукованих зміною гідратації, зовнішнім параметром, який викликає зміну вільної енергії ΔG, є хімічний потенціал води μ. Ці переходи носять кооперативний характер і характеризуються різкою зміною спектральних параметрів у межах вузького інтервалу сорбції молекул води. Тому оцінка відносної стабільності двох конформаційних станів НК поза межами області переходу дає значення ΔG при структурному переході (Птицин, 1969):
Зміну вільної енергії Гіббса обчислювали за формулою:
| 
