Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Адель Ахмад Халіль Абуюсеф

УДК 582.783.2:577.151.02:577.152.32:542.3:613.24

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ВИВЧЕННЯ ЛИСТЯ ДЕЯКИХ ЙОРДАНСЬКИХ (ПАЛЕСТИНСЬКИХ) СОРТІВ ВИНОГРАДУ КУЛЬТУРНОГО

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету (м. Харків), Міністерство охорони здоров'я України.

Захист відбудеться "21" березня 2003_ р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий "17" лютого 2003 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                         Л.М. Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останній час все більшу популярність набувають лікарські рослини і препарати, які отримані на основі лікарської рослинної сировини. Низька токсичність, обмежений спектр побічної дії, висока біодоступність, можливість застосування при хронічних захворюваннях, в дитячій практиці та геронтології певним чином відрізняє фітопрепарати від синтетичних. Переважним є і те, що фармакологічний ефект препаратів рослинного походження зумовлений не однією речовиною, а комплексом природних сполук різного походження.

Необхідність комплексного використання рослин і наявність достатньої сировинної бази пояснює інтерес до вивчення плодово-ягідних культур. Завдяки наявності важливих груп біологічно активних речовин (БАР), ці рослини використовують з харчовими, дієтичними та лікувальними цілями. У зв'язку з цим, за об'єкт дослідження нами була обрана рослина – виноград культурний (Vitis vinifera L.) родини виноградні (Vitaceae). Тому комплексні фармакогностичні і фармакологічні дослідження деяких представників цієї родини та створення на їх основі нових лікарських засобів є актуальними.

З літературних даних відомо, що виноград містить різні БАР: вуглеводи, органічні кислоти, вітаміни, макро- та мікроелементи, фенольні та інші природні сполуки, які зумовлюють широкий спектр його фармакологічної дії. Найбільш вивченими є плоди винограду культурного, листя ж вивчені недостатньо. Тому об'єктом наших досліджень були обрані листя винограду культурного йорданських (палестинських) сортів Шамі, Дабугі та Бейруті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблем МОЗ України (№ державної реєстрації 0198U007008) і проблемної комісії „Фармація” МОЗ України.

Мета та задачі дослідження. Мета даної роботи – вивчення БАР листя деяких найбільш поширених сортів винограду культурного флори Палестини, виділення з них комплексів БАР і створення на їх основі нових лікарських засобів, розробка аналітичної нормативної документації на лікарську рослинну сировину та отриманий з неї лікарський фітозасіб.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

• провести попереднє фітохімічне дослідження листя йорданських (палестинських) сортів винограду культурного;
• виділити в індивідуальному стані речовини і встановити їх структуру;
• розробити технологію отримання фармакологічних засобів з листя сортів винограду культурного;
• провести кількісне визначення різних груп БАР в листі йорданських (палестинських) сортів винограду культурного та фармакологічних засобів, які отримані на їх основі;
• встановити основні анатомо-діагностичні ознаки рослинної сировини – листя винограду культурного та місця локалізації в них основних груп БАР;
• розробити аналітичну нормативну документацію (АНД) на сировину і фармакологічні засоби.

Об'єктом дослідження були фенольні сполуки, які зумовлюють фармакологічну активність багатьох лікарських засобів природного походження, та лікарська рослинна сировина, яка накопичує їх, - листя деяких йорданських (палестинських) сортів винограду культурного (Шамі, Дабугі і Бейруті).

Предметом дослідження стало виявлення, виділення і встановлення структури флавоноїдів, оксикоричних кислот, кумаринів, фосфоліпідів і стероїдів в листі винограду культурного; вивчення фармакологічної активності сумарного поліфенольного і полісахаридного комплексів; вивчення морфолого-анатомічних ознак і гістохімічні дослідження листя і черешків винограду культурного сорту Дабугі, як найбільш перспективного.

Методи дослідження. Якісний склад і кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами, використовували тонкошарову (ТШХ) та паперову хроматографію. Для виділення суми БАР з сировини використовували колонкову хроматографію на силікагелі і поліаміді та препаративну хроматографію на папері. Хімічну будову виділених сполук встановлювали на основі даних УФ-, ІЧ- та ПМР-спектрів та їх хімічних перетворень. Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo. Анатомічне і гістохімічне вивчення та фотографування зрізів листя та черешків, а також препаратів з поверхні досліджуваних об'єктів проводили за допомогою мікроскопів МБР-1 і МБІ-6 та фотоапаратом „ФЕД-5В” на плівці „Мікрат-200”, „Мікрат-300” та кольоровій „Кодак-200”.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне фітохімічне вивчення БАР листя деяких йорданських (палестинських) сортів винограду культурного. Встановлено наявність в них амінокислот, вуглеводів, фосфоліпідів, стероїдів, фенольних сполук (оксикоричних кислот, оксикумаринів, флавоноїдів, дубильних речовин), ліпофільних речовин (хлорофілів, жирних кислот, каротиноїдів). З листя винограду культурного в індивідуальному стані виділено і досліджено 20 речовин: 4 оксикоричні кислоти, 3 оксикумарини, 11 флавоноїдів, 1 фосфоліпід та 1 стероїд. Дані сполуки вперше виділені з листя винограду культурного сорту Дабугі.

Вперше розроблена технологія отримання фармакологічного засобу з листя винограду культурного сорту Дабугі. Вивчена фармакологічна активність сумарного поліфенольного комплексу з листя винограду під умовною назвою „Флавітин”, який має виражену противиразкову, антиоксидантну, діуретичну, протизапальну, анальгетичну та жарознижуючу активності. Подана заявка на видачу патенту України на винахід (приоритетна справка № 2002119121 від 15.11.02) „Спосіб одержання поліфенольного комплексу „Флавітин” з протизапальною, анальгетичною, противиразковою і антиоксидантною активністю”.

Вперше вивчена цитопротекторна активність полісахаридного і сумарного поліфенольного комплексу з листя винограду культурного сорту Дабугі.

Вперше визначено кількісний вміст полісахаридів, оксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, аскорбінової кислоти, хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот в листі винограду культурного йорданських (палестинських) сортів Дабугі, Шамі і Бейруті.

Вперше встановлено основні морфолого-анатомічні ознаки листя і черешків винограду культурного сорту Дабугі. Гістохімічними реакціями встановлено місце локалізації основних БАР в черешках і листі винограду культурного сорту Дабугі.

Показана можливість використання листя деяких сортів винограду культурного (Шамі, Дабугі та Бейруті) для отримання нових фітозасобів.

Практичне значення роботи. Розроблена технологія отримання нового фармакологічного засобу з листя винограду культурного сорту Дабугі противиразкової, протизапальної, анальгетичної і жарознижуючої дії (умовна назва „Флавітин”). Розроблені проекти аналітичної нормативної документації (АНД) на „Листя винограду культурного сорту Дабугі”, „Сухий екстракт „Флавітин”. Результати досліджень впроваджені в навчальний процес кафедр фармакогнозії та ботаніки Національного фармацевтичного університету та Тернопільського медичного університету ім.. І.Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача:

• проведено аналіз літературних даних про розповсюдження, хімічний склад і використання рослин роду виноград;
• визначені основні групи БАР: оксикоричні кислоти, оксикумарини, флавоноїди, фосфоліпід, стероїд, ці сполуки виділені в індивідуальному стані і встановлено їх будову;
• обгрунтована і розроблена технологія отримання з листя винограду культурного сорту Дабугі сухого екстракту "Флавітин", що являє собою сумарний поліфенольний комплекс;
• вивчено анатомічну будову листя винограду культурного сорту Дабугі;
• розроблені проекти АНД на „Листя винограду культурного сорту Дабугі”, „Сухий екстракт „Флавітин”.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на науково-практичній конференції „Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000); республіканській науковій конференції „Научные направления в создании лекарственных средств в фармацевтическом секторе Украины” (Харків, 2000); конференції, яка присвячена 100-річчу від дня народження Ю.Г. Борисюка „Сучасні напрямки розвитку фармакогнозії” (Харків, 2001); всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні проблеми фармацевтичної науки і практики” (Харків, 2001); всеукраїнській науково-практичній конференції „Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових робіт, з них 5 статей у журналах, 1 заявка на патент і 4 тези доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, шести розділів, загальних висновків, списку літературних джерел. Дисертація викладена на 197 сторінках машинописах, ілюстрована 4 схемами, 41 рисунком і 32 таблицями. Перелік використаних літературних джерел вміщує 216 найменувань, з них 58 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Рослини роду виноград та перспективи їх використання

Проведений аналіз літературних даних свідчить, що рослини роду виноград завдяки багатому вмісту біологічно активних речовин і широкому спектру використання в народній та науковій медицині є перспективними джерелами для отримання нових лікарських засобів. Найбільш вивченими є плоди винограду. В значно меншому обсязі проводилося вивчення вегетативних органів винограду культурного як в хімічному, так і в фармакологічному відношенні. Все це виправдовує доцільність поглибленого фітохімічного вивчення рослин роду Vitis.

2. Виділення і фітохімічне вивчення біологічно активних речовин

з листя винограду культурного

Об'єктами наших досліджень були зразки листя винограду культурного, які заготовлені після збору врожаю плодів на території Палестини в 1999-2001 роках.

За результатами якісних реакцій і хроматографічного аналізу в листях винограду культурного сортів Дабугі, Шамі і Бейруті встановлено наявність вуглеводів, азотистих сполук, оксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, кумаринів, сапонінів, органічних кислот та макро- і мікроелементів.

Проведено визначення кількісного вмісту полісахаридів, амінокислот, оксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, аскорбінової кислоти, макро- і мікроелементів.

Для виділення БАР і розділення їх на індивідуальні компоненти використовували методи рідинно-рідинної екстракції, колонкової хроматографії на силікагелі та поліаміді, препаративної хроматографії на папері і в тонкому шарі сорбенту, дробної кристалізації.

У результаті з листя винограду культурного сорту Дабугі вперше виділено в індивідуальному стані 20 речовин: 4 оксикоричні кислоти, 3 оксикумарина, 11 флавоноїдів, 1 речовину фосфоліпідної і 1 стероїдної природи (таблиця 1).

Таблиця 1.

Деякі фізичні властивості речовин, які виділені

з листя винограду культурного сорту Дабугі

Продовження таблиці 1.

Продовження таблиці 1.

Примітка: А – н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2);

  Б – 15 % оцтова кислота;

  В – 3 % оцтова кислота;

  Г – хлороформ-25 % формамід.

3. Хімічне вивчення виділених сполук

Структуру виділених речовин встановлено на підставі фізичних, хімічних, фізико-хімічних та біохімічних методів аналізу.

Оксикоричні кислоти. Речовини 2.17-2.20 за флуоресценцією плям на хроматограмах у фільтрованому УФ-світлі та якісними реакціями віднесені до гідроксикоричних кислот, що підтверджується даними УФ-спектрів.

В продуктах лужної деструкції речовини 2.17 (п-кумарова кислота) знайдено n-оксибензойну кислоту, речовини 2.19 (ферулова кислота) – ванілінову кислоту. Лужний гідроліз речовин 2.18 (кофейна кислота) та 2.20 (хлорогенова кислота) приводить до утворення еквімолекулярних кількостей кофейної та D-хінної кислот. Місце приєднання кофейної кислоти до D-хінної встановлено за результатами лактонізації цих сполук (таблиця 1).

На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками речовини 2.17-2.20 відповідно ідентифіковані з 4-гідроксикоричною (п-кумаровую), 3,4-дігідроксикоричною (кофейною), 3-гідрокси-4-метоксикоричною (Федуловою) та 5-О-кофеїл-D-хінною (хлорогеновою) кислотами, які вперше знайдені в листях винограду культурного сорту Дабугі.

Кумарини. Здатність розщеплюватися під дією йодистоводороної кислоти у середовищі рідкого фенолу та оцтового ангідриду до кумарину дозволило віднести речовини 2.03-2.05 до похідних кумарину.

В ІЧ-спектрах досліджуваних речовин є смуги поглинання гідроксильних груп в області 3350-3225 см-1, а також метоксигруп – в області 2985-2843 см-1 для речовини 2.03. За даними фізико-хімічних властивостей, молекулярної маси, елементного складу, УФ- та ІЧ-спектрів, а також властивостей продуктів ацетилування, метилування та дезметилювання речовина 2.03 ідентифікована з 6-метокси-7-оксикумарином (скополетином), речовина 2.04 – з 7-оксикумарином (умбеліфероном), речовина 2.05 – з 6,7-діоксикумарином (ескулетином) (таблиця 1).

Флавоноїди. Флавоноїдна природа речовин 2.06-2.16 підтверджується результатами якісних реакцій та даними спектрального аналізу. В ІЧ-спектрах цих сполук присутні смуги поглинання, характерні для флавоноїдів: в області 3400-2900 см-1 (фенольні гідроксили), 1665-1615 см-1 (карбонільна група γ-пірону), 1640-1450 см-1 (валентні коливання ароматичних кілець).

Результати якісних реакцій та УФ-спектроскопії свідчили про належність досліджуваних речовин до похідних флавонову.

За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників, а також за результатами ціанідинової реакції за Бріантом речовини 2.06, 2.07, 2.09, 2.10 віднесені до агліконів, а речовини 2.08, 2.11-2.14 та 2.16 – до глікозидів.

Схема хімічних перетворень на прикладі речовини 2.14 представлена на рисунку 1.

Речовина 2.14 являє собою кристали жовто-зеленого кольору з температурою топлення 236-2400С (етанол). Темне забарвлення плями на хроматограмі в УФ-світлі дозволяє припустити, що ця сполука є флавон або флавоном, у якого заміщена оксигрупа при С-3.

Кислотний гідроліз речовини 2.14 відбувався у відносно м’яких умовах (3 % сірчана кислота, 1000С, 2 години), що вказувало на можливість приєднання вуглеводного компоненту при С-3 флавоноїдного ядра. Речовина 2.14 не гідролізувалася 0,5 % розчином лугу, що також підтверджувало вище наведене припущення. В гідролізаті знайдено D-галактозу та аглікон, який за фізико-хімічними властивостями ідентичний кверцетину. Отримані при кислотному гідролізі еквімолекулярні кількості аглікону і цукрового компоненту характеризували досліджуєму речовину як монозид.

Для підтвердження будови речовини 2.14 нами було проведено ацетилювання. Ацетилування проводили оцтовим ангідридом в присутності кислих і основних каталізаторів (концентрованої сірчаної кислоти, піридину або ацетату натрію). При ацетилуванні флавоноли не змінюються і в процесі реакції всі вільні ОН-групи заміщуються ацетильними радікалами. Це було використано нами для хімічних перетворень при встановленні структури виділених речовин (речовина 2.14 – гіперозид).

Місце приєднання вуглеводного залишку встановлювали порівнянням УФ-спектрів глікозиду та аглікону. Відсутність у спектрі глікозиду батохромного зсуву максимуму першої смуги поглинання в присутності цирконілу нітрату та лимонної кислоти і наявність його в агліконі в аналогічних умовах підтверджує, що D-галактоза зв’язана з агліконом через оксигрупу при С-3.

Відщеплення D-галактози при ферментативному гідролізі глікозиду рамнодіастазою, негативний показник питомих обертань самого глікозиду ([α]20D – 58,90, етанол), а також наявність в ІЧ-спектрі трьох смуг поглинання в області 1100-1010 см-1 і смуг при 890 см-1 дозволило припустити наявність β-глікозидного зв’язку та піранозного циклу в D-галактозі.

Рис. 1. Схема хімічних перетворень флавонолів на прикладі гіперозиду (2.14).

Для підтвердження структури речовини 2.14 був отриманий ПМР-спектр його триметилсиланового ефіру. В глікозиді 2.14 відмічалися сигнали протонів: С – 6’ (два дублети з J = 2,5 Гц, δ 7,82 і 7,68 м.ч.); С – 2’ (дублет з J = 2,5 Гц, δ 7,31 м.ч.); С – 5 (дублет з J = 9 Гц, δ 6,74 м.ч.); Н – 8 ( дублет з J = 2,5 Гц, δ 6,26 м.ч.); Н – 6 (дублет з J = 2,5 Гц, δ 6,12 м.ч.); С – 5 (сін глет протону гідроксилу, δ 12,44 м.ч.). Аналіз ПМР-спектру свідчить, що замісники у речовині 2.14 знаходяться у С-3, С-5, С-7, С-3’, С-4’. В області 3,39-3,0 м.ч. проявляється характерна група сигналів вуглеводного залишку. При цьому інтегральний розрахунок показав наявність тільки шести протонів, що підтвердило монозидну природу досліджує мого глікозиду.

Сигнал аномірного протону D-галактози сильно зміщений в область слабкого поля 5,53 м.ч. і проявлявся у вигляді дублету, який чітко виражений та має константу розщеплення 7 Гц для D-галактози. Чіткий дублет характерний для протону С-1 β-D-галактози, яка приєднується у положенні С-3, і константа розщеплення 7 Гц характеризує аксиалаксиальну взаємодію протону та підтверджує β-конфігурацію глікозидного зв’язку.

Таким чином, дані ПМР-спектру повністю співпадали з результатами фізико-хімічних досліджень і дозволили охарактеризувати речовину 2.14 як 3-О-β-D-галактопіранозид 5,7,3’,4’-тетраоксифлавон або гіперозид.

Структуру виділених агліконів (речовини 2.06, 2.07, 2.09, 2.10) та глікозидів (речовини 2.08, 2.11, 2.12, 2.13, 2.16) встановлювали аналогічно речовині 2.14.

в-Ситостерин та лецетин. На підставі фізико-хімічних властивостей та хроматографічного аналізу з вірогідними зразками речовини 2.01 та 2.02 були ідентифіковані як лецетин та в-ситостерин, відповідно.

4. Отримання та дослідження ліпофільної фракції з листя винограду культурного сорту Дабугі

Для отримання ліпофільної фракції були експериментально підібрані умови екстрагування листя винограду культурного сорту Дабугі. Отримання ліпофільної фракції проводили двома методами. В першому методі подрібнену сировину вичерпно екстрагували хлороформом в апараті Сокслету. Хлороформний екстракт упарювали до видалення екстрагенту та після зважування залишку визначили відсотковий вміст ліпофільної фракції у досліджуваній сировині, який склав 11,7 %. При використанні наступного методу досліджувану сировину екстрагували 50 % етанолом методом мацерації. Спирто-водний екстракт упарювали до водного залишку і вичерпно екстрагували хлороформом. Хлороформну фракцію упарювали на ротаційному уварювачі до видалення хлороформу. Кількісний вміст ліпофільної фракції, яка була отримана другим методом, склав 11,26 %. Отриманий ліпофільний екстракт являв собою густу в’язку масу темно-зеленого кольору зі специфічним рослинним запахом, який не розчиняється у воді, легко розчиняється в 96 % етанолі, хлороформі, гексані.

Вивчено якісний вміст БАР ліпофільної фракції, яка містить хлорофіли, кумарини, каротиноїди, жирні кислоти.

Кількісний вміст хлорофілів проводили фото колориметричним, а каротиноїдів – спектрофотометричним методом. Їх вміст склав 9,9 % та 832 мг%, відповідно.

В листях винограду культурного сортів Шамі, Дабугі та Бейруті методом газорідинної хроматографії виявлено 17 (Дабугі) і 16 (Шамі та Бейруті) вільних жирних кислот, з яких серед насичених жирних кислот переважають пальмітинова і стеаринова, а серед ненасичених – ліноленова, лінолева, олеїнова, ерукова, арахідонова та докозадієнова кислоти. На відміну від листя винограду культурного сорту Дабугі, в листях винограду сортів Шамі та Бейруті не виявлено маргаринову кислоту, а в слідових кількостях присутні каприлова, капронова, лауриновата міристинова кислоти (таблиця 2).

Таблиця 2.

Жирнокислотний склад листя винограду культурного сортів

Дабугі, Шамі та Бейруті

5. Розробка технології отримання, стандартизація фармакологічного

засобу „Флавітин” і вивчення його біологічної активності

На підставі проведених досліджень нами розроблено технологію отримання суми поліфенольних сполук з листя винограду культурного сорту Дабугі (рисунок 2.). Основу даної технології складали експериментально підібрані умови екстрагування суми біологічно активних речовин, яка включала такі параметри: екстрагент – 50 % етанол (для фенольних сполук), ступінь подрібнення сировини – 2-3 мм, співвідношення сировина-екстрагент – 1:10, температурний режим – 20-220С. Вихід сухого екстракту склав 15,8 %.

Фармакологічні дослідження проводили на кафедрі біохімії НФаУ під керівництвом професора Вороніної Л.М. та доцента Набоки О.І. В результаті було встановлено, що „Флавітин” має виражену противиразкову, анальгетичну, антиоксидантну, протизапальну активності (таблиця 3).

Гостра токсичність при внутрічеревному введенні LD50 складає більше ніж 7500 мг/кг, що дозволяє віднести його до практично нетоксичних субстанцій.

Рис. 2. Технологічна схема отримання фармакологічного засобу „Флавітин”.

Таблиця 3.

Фармакологічна активність сумарного полі фенольного комплексу

з листя винограду культурного сорту Дабугі – „Флавітин”

Примітка: * - вірогідність різниць по відношенню до даних контрольної групи (р < 0,05);

  ** - вірогідність різниць по відношенню до CCl4 (р < 0,05).

6. Морфолого-анатомічне та гістохімічне вивчення

листя винограду культурного сорту Дабугі

Вивчена анатомічна будова листової пластинки та черешка листя винограду культурного сорту Дабугі. Визначені мікро діагностичні ознаки для черешка і листової пластинки: наявність одно-багатоклітинних простих гострокінцевих і войлочних волосків; велика кількість клітин-ідиобластів з рафідами та друзами; багато пучковий черешок і крупні бокові жилки листа; наявність продихів, які при піднімаються над епідермісом, тонкостінна епідерма зі складчастою кутикулою; анізоцитний тип продихового апарату.

Гістохімічні дослідження дозволили встановити локалізацію у тканинах листа фенольних сполук: гідролізуємих дубильних речовин, катехінів, деяких груп флавоноїдів.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено комплексне фітохімічне дослідження листя винограду культурного йорданських (палестинських) сортів Шамі, Дабугі, Бейруті. Встановлено наявність різних груп БАР: вуглеводів, амінокислот, оксикоричних кислот, флавоноїдів, кумаринів, дубильних речовин, сапонінів, фосфоліпідів, стероїдів, органічних кислот, аскорбінової кислоти, макро- та мікроелементів.
2. Визначено кількісний вміст деяких груп БАР в листі винограду культурного сортів Дабугі, Шамі та Бейруті: флавоноїдів – 3,35 %, 2,97 % і 3,30 %; гідроксикоричних кислот – 2,81 %, 2,76 % і 4,33 %; дубильних речовин – 7,01 %, 15,40 % і 9,53 %; аскорбінової кислоти – 0,42 %, 0,43 % і 0,38 %; полісахаридів – 22,0 %, 19,3 % і 20,4 %, відповідно.
3. Вперше з листя винограду культурного сорту Дабугі виділено в індивідуальному стані 20 речовин: 4 гідроксикоричних кислоти, 3 оксикумарина, 11 флавоноїдів, 1 речовину фосфоліпідної і 1 стероїдної природи. На основі фізико-хімічних властивостей вихідних речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії, порівняння з вірогідними зразками ідентифіковані: 2.01 – фосфотидилхолін (лецетин); 2.02 – в-ситостерин; 2.03 – 6-метокси-7-гідроксикумарин (скополетин), 2.04 – 7-гідроксикумарин (умбеліферон), 2.05 – 6,7-дігідроксикумарин (ескулетин); 2.06 – 5,7,3’,4’-тетрагідроксифлавон (лютеолін), 2.07 – 3,5,7,4’-тетрагідроксифлавон (кемпферол), 2.08 – кемпферол-3-О-β-D-глюкопіранозид, 2.09 – 3,5,7,3’,4’-пентагідроксифлавон (кверцетин), 2.10 – 3,5,7,3’,4’,5’-гексагідроксифлавон (мірицетин), 2.11 – кверцетин-3-О-β-D-глюкопіранозид (ізокверцитрин), 2.12 – кверцетин-3-О-β-D-глюкопіранозидо-3-О-α-L-рамнопіранозид (кверцетин-3-рутинозид, рутин), 2.14 – кверцетин-3-О-β-D-галактопіранозид (гіперозид), 2.15 – 3,5,7,3’,4’-пентагідроксифлаван (катехін), 2.16 – кемпферол-3-О-β-D-глюкопіранозил-7-О- β-D-глюкопіранозид; 2.17 – 4-гідроксикорична кислота (п-кумарова), 2.18 – 3,4-дігідроксикорична (кофейна), 2.19 – 3-гідрокси-4-метоксикорична (ферулова), 2.20 – 5-О-кофеїл-D-хінна (хлорогенова) кислота.
4. Вперше визначено якісний склад і кількісний вміст амінокислот, макро- та мікроелементів в листях винограду культурного сортів Шамі, Дабугі, Бейруті.
5. Вперше отримана ліпофільна фракція з листя винограду культурного сорту Дабугі та встановлено її якісний склад.
6. Вперше встановлено кількісний вміст хлорофілів, каротиноїдів в листях винограду культурного сорту Дабугі та вільних жирних кислот в листях винограду усіх досліджуємих йорданських (палестинських) сортів.
7. Вперше розроблено технологію отримання фармакологічного засобу „Флавітин” з листя винограду культурного сорту Дабугі.
8. Вивчена фармакологічна активність „Флавітину”. Встановлено, що він виявляє виражену протизапальну, анальгетичну, проти виразкову, репаративну, антиоксидантну та є практично нетоксичним.
9. Проведено вивчення цитопротекторної активності полісахаридного комплексу з листя винограду культурного сорту Дабугі. Встановлено, що даний комплекс має виражену цитопротекторну активність (73,4 %).
10. Вперше визначено анатомічні діагностичні ознаки для черешка та листової пластинки, що використано при розробці проекту АНД на „Листя винограду культурного”.
11. Вперше проведено гістохімічне вивчення листя та черешків винограду культурного сорту Дабугі і встановлено місце локалізації основних БАР: дубильних речовин, катехінів, флавоноїдів.
12. Розроблено проекти АНД на „Листя винограду культурного сорту Дабугі” і „Сухий екстракт „Флавітин”. Результати роботи впроваджені в учбовий процес Національного фармацевтичного університету та Тернопільської медичної академії ім. І.Я. Горбачевського.

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Кисличенко В.С. Новосел О.М., Адель Ахмад Халіль Абуюсеф. Вивчення полісахаридів плодово-ягідних рослин – яблуні домашньої і винограду культурного // Фізіологічно активні речовини. – 2001. - № 1 (31). С. 70-73. (особистий внесок – отримання та дослідження полісахаридного комплексу з листя винограду культурного).
2. Кисличенко В.С., Адель Ахмад Халіль Абуюсеф, Король В.В. Дослідження біологічно активних речовин у листі деяких йорданських сортів винограду // Фізіологічно активні речовини. – 2001. - № 2(32). – С. 72-76. (особистий внесок – проведення фітохімічного аналізу та кількісного визначення БАР листя деяких йорданських сортів винограду культурного).
3. Вивчення амінокислотного та мікро елементного складу рослин роду виноград і їх використання в медичній практиці / В.С. Кисличенко, Адель Ахмад Халіль Абуюсеф, О.В. Криворучко, В.В. Король // Фізілогічно активні речовини. – 2002. - № 1(33). – С. 64-70. (особистий внесок – проведено огляд літратури та вивчено амінокислотний та мікроелементний склад).
4. Вивчення ліпофільних сполук, отриманих з листя винограду / В.С. Кисличенко, А.А. Халіль Абуюсеф, В.В. Король, О.В. Криворучко // Медична хімія. – 2002. – Т. 4. - - № 3. – С. 75-77. (особистий внесок – розробка технології отримання ліпофільних екстрактів з листя винограду культурного та вивчення їх якісного складу та кількісного вмісту БАР).
5. Виділення флавоноїдів з листя винограду сорту Дабугі та вивчення біологічної активності сумарного полі фенольного комплексу на їх основі / Кисличенко В.С., Вороніна, Л.М., Адель Ахмад Халіль Абуюсеф та ін. // Фармац. журн. – 2002.- № 3. – С. 87-91. (особистий внесок – виділення флавоноїдів, встановлення їх структури, отримання полі фенольного комплексу та вивчення його біологічної активності).
6. Рішення про встановлення дати подання заявки на патент України на винахід МПК А 61К35/78. „Спосіб одержання полі фенольного комплексу „Флавітин” з протизапальною, анальгетичною, проти виразковою та антиоксидантною активністю” / Кисличенко В.С., Адель Ахмад Халіль Абуюсеф, Кузнєцова В.Ю., Вороніна Л.М., Король В.В., Набока О.І. – Заявка № 2002119121 від 15.11.02.
7. Кисличенко В.С., Адель Ахмад Халиль Абуюсеф, Ковалев В.Н. Виноград культурный – новый источник биологически активних веществ // Тез. докл. науч.-практич. конф. „Вчені України – вітчизняній фармації”. – Харків, 2000. – С. 143-144. (особистий внесок – проведено огляд літератури та досліджено ряд біологічно активних сполук винограду).
8. Кисличенко В.С., Адель Ахмад Халиль Абуюсеф, Маркова В.М. Изучение цитопротекторной активности полисахаридного комплекса из листьев винограда // Сб. тез. науч. конф. „Научные направления в создании лекарственных средств в фармацевтическом секторе Украины”. – Харьков, 2000. – С. 17-18. (особистий внесок – отримано полісахаридний комплекс та вивчено його цитопротекторну активність).
9. Адель Ахмад Халіль Абуюсеф, В.С. Кисличенко. Про встановлення наявності лецитину та β-ситостерину в листі винограду культурного сорту Дабугі // Тез. доп. Всеукраїнської наук.-практич. конф. „Фармація ХХІ століття”. – Харків: Вид-во НФаУ, „Золоті сторінки”, 2002. – С. 73. (особистий внесок – проведено якісне дослідження лецетину та в-ситостерину).
10. Вплив сумарного полі фенольного комплексу з листя винограду культурного сорту Дабугі на процеси ПОЛ в умовах гострого гепатиту у щурів / Вороніна Л.М., Набока О.І., Кисличенко В.С., Адель Ахмад Халіль Абуюсеф та ін. // Тез. доп. Всеукраїнської наук.-практич. конф. „Фармація ХХІ століття”. – Харків: Вид-во НФаУ, „Золоті сторінки”, 2002. – С. 134-135. (особистий внесок – отримано сумарний полі фенольний комплекс та вивчено його вплив на процеси ПОЛ в умовах гострого гепатиту).