|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
БОРЗОВА НАТАЛІЯ ВІКТОРІВНА
УДК 577.152.32:577.151.5:582
α-Ν-АЦЕТИЛГАЛАКТОЗАМІНІДАЗА ТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗА
ASPERGILLUS NIGER 185ш
03.00.07 — мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ — 2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів
доктор біологічних наук, професор, Костерін Сергій Олексійович, Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, завідувач відділом біохімії м’язів
Провідна установа: Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова
Захист відбудеться "19" березня 2003 р. о 1000 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154).
Автореферат дисертації розіслано "_13_" лютого 2003 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. α-N-ацетилгалактозамінідаза та α-галактозидаза є ферментами, високоспецифічними щодо термінальних залишків α-N-ацетилгалактозаміна та α-D-галактози, які присутні в природних глікокон’югатах та синтетичних глікозидах. Ці властивості ферментів дозволяють використовувати їх у двох основних напрямках досліджень:
1) теоретичному — для встановлення структури, а також для модифікації природних олігосахаридів, гліканів та глікокон’югатів;
2) практичному — а) в зв’язку з можливістю їх використання в медицині для трансформації еритроцитів крові груп А(ІІ) та В(ІІІ) в уніфіковані за АВО-специфічністю еритроцити О-типу. За даними американських дослідників, економічний ефект від застосування такої трансформованої крові може складати 2-3 млрд доларів на рік. Такі універсальні еритроцити можна переливати без урахування групової приналежності реципієнтів, що є вкрай важливим в екстремальних ситуаціях; б) для лікування хвороб людини (Шиндлера та Фабрі), обумовлених спадковою відсутністю цих глікозидаз, що супроводжується порушеннями глікопротеїнового обміну; в) в ксенотрансплантації для пригнічення реакції антиген-антитіло шляхом інактивації α-галактозних глікотопів під дією α-галактозидази; г) в розробці тест-систем для діагностики СНІДу, оскільки в останні роки виявлено наявність α-галактозних та α-N-ацетилгалактозамінних епітопів у вірусу імунодефіциту людини; д) у харчовій промисловості: для одержання соєвого молока підвищеної якості, для переробки меласи з метою створення безвідходної технології одержання цукру.
На сьогодні відомо декілька джерел α-галактозидази необхідної специфічності (α-галактозидаза зелених бобів кави та продуценти родів Absidia, Mortierella, Streptomyces), однак досі не знайдено високопродуктивного та технологічно ефективного продуцента α-N-ацетилгалактозамінідази. Описані у літературі продуценти мікробного походження Clostridium perfringens, Acremonium sp., Ruminococcus torques мають ряд серйозних недоліків, що робить їх непридатними до використання. З огляду на це, пошук нових, більш ефективних продуцентів високоспецифічних та стабільних α-N-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази лишається актуальним. Найбільш технологічними джерелами ферментів є мікроорганізми, завдяки їх високій швидкості розмноження та здатності до контрольованого синтезу біологічно активних речовин.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного в рамках проведення досліджень за темами: „Вивчення залежності біологічної активності глікополімерів мікробної клітини від фізико-хімічних та структурних особливостей. Розробка нових стратегій використання глікополімерів” (1998-2002 рр., № держ. Реєстр. 0198V008078, шифр теми за планом інституту 07.20), “Вивчити фізико-хімічні та біологічні властивості α-Ν-ацетилгалактозамінідази” (2000 – 2001 рр., шифр теми за планом інституту 2.30.5.2), „Дослідження фізико-хімічних властивостей та субстратної специфічності α-галактозидази та α-Ν-ацетилгалактозамінідази активних штамів продуцентів мікроміцетів” (2002 р., шифр теми за планом інституту 2.30.5.2).
Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було одержання високоочищених препаратів α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази, вивчення їх фізико-хімічних та каталітичних властивостей, субстратної специфічності для розробки основ практичного застосування цих ферментів.
Відповідно до поставленої мети задачами наших досліджень були:
- пошук серед представників різних таксономічних груп високоефективних продуцентів α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази;
- підвищення вихідної активності ферментів шляхом оптимізації умов культивування продуцента;
- вивчення впливу індукторів різної хімічної природи на синтез та активність ферментів;
- розробка методів одержання ферментів у гомогенному стані;
- вивчення фізико-хімічних і каталітичних властивостей ферментного препарату, специфічності його дії;
- дослідження функціональних груп у активному центрі ферменту.
Об’єктами дослідження були позаклітинні ферменти α-Ν-ацетилгалактозамінідаза (α-2-ацетамідо-2-дезокси-D-галактозид ацетамідо-дезоксигалактогідролаза — КФ 3.2.1.49) та α-галактозидаза (α-D-галактозид галактогідролаза — КФ 3.2.1.22) Aspergillus niger Thom (185ш).
Предметом дослідження було вивчення умов біосинтезу ферментів, вивчення їх фізико-хімічних властивостей, деяких каталітичних та кінетичних параметрів, специфічності дії.
Матеріали та методи дослідження. Задачі дослідження реалізувалися цілим комплексом засобів, які включали мікробіологічні, біохімічні, імунохімічні методи, а також методи ензимології, препаративної біохімії, хімічної та біохімічної кінетики.
Наукова новизна отриманих результатів.
1. Вперше виявлений штам A. niger, здатний одночасно синтезувати високоактивні α-N-ацетилгалактозамінідазу та α-галактозидазу. Розроблено наукові засади одерження високоочищеного ферментного препарату.
2. Вперше встановлено, що гуанідингідрокарбонат, нітроаміногуанізон саліцилового та диметиламінобензальдегідів, кооординаційні сполуки германію з янтарною та оксіетилімінодіоцтовою кислотами здатні активувати синтез досліджуваних ферментів на 50-200 %.
3. Встановлено, що оптимальними умовами для прояву α-Ν-ацетилгалактозамінідазної та α-галактозидазної активності є температура 60 оС, рН 3,5-4,1. Ферментний препарат стабільний в діапазоні рН від 3,0 до 7,0, при t від 0 до 20 оС.
4. Показана субодинична структура молекули ферменту, його молекулярна маса за даними гель-фільтрації на сефарозі 6В становить 430 кДа, за даними ДСН-ПААГ - 70 кДа. В молекулі наявні до 30% гідрофобних та 20% кислих амінокислот, а також присутній вуглеводний компонент, який представлений манозою, галактозою, глюкозаміном та двома неідентифікованими гексозамінами.
5. Встановлено, що каталітично активними групами ферментного препарату A. niger 185ш, які відповідають за прояв α-Ν-ацетилгалактозамінідазної та α-галактозидазної активності, є карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти (можливо аспарагінової або глутамінової) та імідазольна група гістидину.
6. Вперше встановлено серологічну спорідненість між глікозидазами A. niger 185ш та Cladosporium cladosporioides 189.
7. Показано, що ферментний препарат є пірогенним (0,04 мг/кг ваги), але нетоксичним (500 мг/кг ваги).
Практичне значення одержаних результатів. Розробка ефективних методів виділення і очистки досліджуваних глікозидаз з метою одержання гомогенних препаратів ферментів, систематичне та комплексне дослідження їx фізико-хімічних та каталітичних властивостей дають можливість вирішити важливі та актуальні питання інженерної ензимології та біохімії грибних глікозидаз. Дослідження особливостей механізму дії α-галактозидази та α-N-ацетилгалактозамінідази на синтетичні та природні субстрати, зокрема складні глікокон’югати, що містять термінальні нередукуючі залишки α-D-галактози та α-N-ацетилгалактозаміну, які, зокрема, є групоспецифічними детермінантами еритроцитів А(ІІ) і В(ІІІ)-типу, відповідно, а також є основними глікотопами органотрансплантантів та вірусу СНІДу, є фундаментальною основою застосування високоспецифічних глікозидаз в медико-технологічних процесах, зокрема для створення універсальної донорської крові на основі біоконверсії еритроцитів типу А(ІІ) і В(ІІІ), розробці тест-систем для діагностики СНІДу, нейтралізації α-галактозних глікотопів трансплантантів при ксенотрансплантації. Поряд з цим, встановлення зв'язку між специфічністю та механізмом дії досліджуваних глікозидаз, з одного боку, та будовою їx активних центрів, з іншого, дозволить встановити детермінанти активності біополімерів. Все це створює передумови для впровадження в Україні новітніх біотехнологій.
Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під керівництвом д.б.н., с.н.с. Л.Д.Варбанець.
Комплексоутворюючі похідні гуанідину та координаційні сполуки германію отримані від д.х.н., проф. І.І. Сейфулліної, к.х.н. С.В. Зубкова, аспірантів Е.Е. Марцинко, О.А. Батракової (Одеський національний університет ім. І.І. Мечнікова). В постановці деяких завдань та обговоренні їх результатів приймала участь к.б.н. В.М. Маланчук. Штами мікроорганізмів для скринінгу продуцентів α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази були надані співробітниками відділів промислових мікроорганізмів (к.б.н., с.н.с. С.С. Нагорною) і фізіології та систематики мікроміцетів (к.б.н., с.н.с. О.В. Соколовою, м.н.с. О.С. Харкевич, к.б.н., н.с. Т.І. Редчиць, к.б.н., н.с. О.Т. Школьним, д.б.н., проф. Н.М. Ждановою) ІМВ НАНУ.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались та обговорювались на конференціях експериментальних робіт Інституту мікробіології і вірусології НАН України (Київ, 1999, 2000, 2002 рр.), ІІ з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000); на міжнародних конференціях „Микробиология и биотехнология на рубеже ХХI столетия” (Мінськ, 2000); ХХ Чугаєвській конференції по координаційній хімії (Ростов-на-Дону, 2001); XVI симпозіумі по глікокон’югатам (Гаага, 2001); 11 Європейському симпозіумі з вуглеводів Eurocarb XI (Лісабон, 2001); Міжнародній науково-практичній школі для молодих учених і спеціалістів „Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 2001), VІІІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002)
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, з них 5 статей (4 - у фахових виданнях) та 5 тез.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 174 сторінках машинописного тексту і складається з розділів "Вступ", "Огляд літератури", "Матеріали та методи досліджень", "Результати досліджень та їх обговорення", "Заключення", "Висновки", "Список використаних джерел", який містить 225 посилань, в тому числі 178 іноземних авторів. Робота містить 2 схеми, 22 таблиці, 49 рисунків.
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з 5-ти підрозділів, в яких висвітлені питання щодо поширення α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази у природі, їх біологічної ролі та особливостей біосинтезу. Охарактеризовані традиційні та сучасні підходи щодо виділення та очистки грибних глікозидаз, розглянуто фізико-хімічні властивості глікозидаз різного походження, їх субстратну специфічність. Наведені дані щодо вивчення функціональних груп активного центру ферментів з метою керування каталізом, висвітлено деякі аспекти їх практичного застосування.
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктами дослідженнь були позаклітинні ферменти α-Ν-ацетилгалактозамінідаза (α-2-ацетамідо-2-дезокси-D-галактозид ацетамідо-дезоксигалактогідролаза — КФ 3.2.1.49) та α-галактозидаза (α-D-галактозид галактогідролаза — КФ 3.2.1.22) Aspergillus niger Thom (185ш).
Культивування мікроміцета здійснювали періодичним способом в умовах качалок (n=220 об/хв) при температурі 25 ± 1 оС на середовищі такого складу (г/л): соєве борошно - 25,0; (NH4)2SO4 -0,8 (або пептон - 7,5); KH2PO4 - 2,0; CaCl2 - 0,3; MgSO4 × 7 H2O - 0,3.
Вивчення впливу різних сполук на синтез та активність ферментів здійснювали на адаптованому за джерелами азоту та вуглецю середовищі, досліджувані речовини вносили у концентраціях: природні сполуки (суха бичача кров, вуглеводи) — 0,01-10 %; синтезовані речовини (похідні гуанідину, координаційні сполуки германію) — 0,01 та 0,1 %.
При визначенні глікозидазних активностей використовували відповідні синтетичні субстрати: п-нітрофеніл-2-ацетамідо-2-дезокси-α-D-галактопіранозид, п-нітрофеніл-2-ацетамідо-2-дезокси-β-D-галактопіранозид; п-нітрофеніл-2-ацетамідо-2-дезокси-α- та β-D-глюкопіранозид (“Koch-Light”, Великобританія); п-нітрофенил-α- та β-D-галактопіранозид; п-нітрофеніл-α- та β-D-глюкопіранозид; п-нітрофеніл-β-D-ксилопіранозид; п-нітрофеніл-α та β-D-манопіранозид; п-нітрофеніл-α-D-фукопіранозид (“Sigma”, США). Ступінь гідролізу нітрофенільних субстратів визначали колориметричним методом (Chaplin, 1986).
При виявленні α-галактозидазної активності з використанням природних субстратів кількість глюкози (еквівалентна кількості галактози), вивільненої внаслідок гідролізу мелібіози, визначали глюкозооксидазним методом (Білай, 1982); кількість галактози, що утворилась внаслідок гідролізу рафінози, - методом Somogyi (1952).
Інвертазну активність оцінювали за допомогою глюкозооксидазного методу (Білай, 1982). Визначення протеолітичної активності здійснювали за методом Ансона в модифікації Петрової (Петрова, 1966).
За одиницю активності α-галактозидази та інших глікозидаз приймали таку кількість ферменту, яка каталізує гідроліз 1 мкмоля субстрату за хвилину в стандартних умовах досліду (температура 37 оC, рН 5,2).
Білок визначали за методом Lowry et al. (1951), вміст нуклеїнових кислот за методом Спірина (1958), вміст нейтральних цукрів за методом Dubois et al. (1955). Ідентифікацію нейтральних моносахаридів здійснювали методом газо-рідинної хроматографії на приборі “Chrom-5”, Чехія, препарати аналізували у вигляді ацетатів поліолів (Albersheim et al, 1976). Вміст амінокислот та гексозамінів визначали на аналізаторі амінокислот "Hitachi KLA-5" (Японія).
Для виділення та очистки α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази застосовували осадження (NH4)2SO4 при 30 % та 90% насичення, хроматографію на нейтральних (Toyopearl HW-60, “Toyo Soda”, Японія) та заряджених (Fractogel DEAE-650-s, "Merck", Німеччина) TSK-гелях та гель-фільтрацію на Sepharose 6B. Гомогенність ферментних препаратів визначали в системі ДСН-ПААГ за Laemmli (1970). Молекулярну масу в нативній системі оцінювали на Sepharose 6B (Andrews, 1964) з використанням білків-маркерів фірми "Pharmacia", Швеція: альдолази (158 кДа), каталази (232 кДа), ферітину (440 кДа) та тіроглобуліну (669 кДа)..
Максимальну швидкість реакції і константу Михаеліса визначали за методом Лайнуівера-Берка (Корниш-Боуден, 1979). Для ідентифікації функціональних груп активного центру застосовували метод інгібіторного аналізу з використанням аніонів, іонів металів та специфічних хімічних реагентів. Кінетичний аналіз даних по впливу іонів металів (Ag+ та Hg2+) та n-хлормеркурібензоату на α-галактозидазну активність здійснювали за методами Діксона та Лайнуівера- Берка (Корниш-Боуден, 1979).
Пірогенність ферментного препарату A. niger 185ш визначали на кролях шляхом внутрішньовенного введення встановленої мінімальної пірогенної дози препарату з подальшою термометрією тварин протягом 3 год.
Токсичну дію препарату досліджували на мишах при внутрішньовенному та внутрішньочеревинному введенні.
Серологічну спорідненість між ферментними препаратами A. niger 185ш та C. cladosporioides 189 вивчали, застосовуючи метод подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні (1962).
Результати дослідів обробляли статистично з використанням критерію Ст’юдента.
РОЗДІЛ 3. СКРИНІНГ ПРОДУЦЕНТІВ α-Ν-АЦЕТИЛГАЛАКТОЗАМІНІДАЗИ
В результаті скринінгу, який проводився серед 1514 штамів мікроорганізмів різних таксономічних груп (32 роди мікроміцетів, 14 родів дріжджів та 6 родів бактерій), встановлено, що фермент більш поширений серед мікроміцетів (20 % активних штамів) – представників родів Aspergillus, Fusarium, Penicillium (табл.1).
Таблиця 1
Скринінг продуцентів α-N-ацетилгалактозамінідази
Примітка: * в таблиці представлені лише найбільш чисельні за дослідженими штамами роди
На підставі результатів щодо вивчення спектру глікозидазних активностей та здатності ферментів стабільно працювати у фізіологічних умовах (37 оС; рН 6,0, 7,0) для подальших досліджень було відібрано 4 штами A. niger , які характеризувалися найбільш високим рівнем α-Ν-ацетилгалактозамінідазної (0,128 – 0,142 Е/мл) та α-галактозидазної (0,45 – 0,66 Е/мл) активностей у культуральній рідині.
Цінною властивістю відібраних штамів слід вважати відсутність α-фукозидазної активності, що виключає можливість інактивації Н-антигенів при використанні препаратів ферментів для біотрансформації еритроцитів крові.
РОЗДІЛ 4. ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ A. NIGER 185ш ДЛЯ СИНТЕЗУ α-Ν-АЦЕТИЛГАЛАКТОЗАМІНІДАЗИ ТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗИ
Широкий спектр глікозидаз, які синтезуються грибними продуцентами, дозволяє отримувати з цього природнього джерела величезну кількість різноманітних за своїми властивостями та специфічністю дії ферментів, а також їх ізоформ. Оскільки відомо, що аспергіли є поліферментними продуцентами, то існує реальна можливість регуляції їх біосинтетичної активності фізіологічними факторами. Відомо, що одним із шляхів активації синтезу є оптимізація поживного середовища за мінеральними компонентами та джерелами вуглецевого та азотного живлення.
Оптимізацію здійснювали з використанням більш перспективного, за даними скринінгу, штаму A. niger 185ш. Як базове нами було використане адаптоване раніше у повному факторному експерименті мінеральне середовище, яке містило оптимальне співвідношення катіонно-аніонних компонентів для синтезу глікозидаз (у г/л): КН2РО4 - 2,0; МgSO4×7Н2О - 0,3; CaCl2 - 0,3; (NH4)2SO4 - 0,6; сечовина - 0,4; рН 5,2 (Буглова, 1993). Було показано, що всі досліджені джерела вуглецю (в тій чи в іншій мірі) позитивно впливали на ріст культури, але лише кукурудзяне та соєве борошно сприяли синтезу α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази. Встановлено, що найбільш придатним джерелом вуглецю є саме соєве борошно в концентрації 25 г/л. Щодо джерел азоту показано, що оптимальним є вирощування культури на середовищі, що містить пептон у концентрації 7,5 г/л або сульфат амонію – 0,8 г/л. Також були встановлені оптимальні параметри культивування штаму-продуцента (25 оС, рН 6,0, Кs 16,76 мг О2/л×год, швидкість перемішування 220 об/хв). Максимальний рівень активності обох ферментів спостерігався на 6-8 добу культивування. В результаті оптимізації вдалося підвищити рівень активності позаклітинних α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази у культуральній рідині в 1,5 та 2 рази, відповідно.
РОЗДІЛ 5. ІНДУКЦІЯ СИНТЕЗУ ГЛІКОЗИДАЗ A. NIGER 185ш
Відомо, що концентрація деяких ферментів у клітині може суттєво змінюватися при варіюванні складу поживного середовища. Це в першу чергу стосується індуцибельних ферментів. Як правило такі ферменти присутні в клітині у слідових кількостях, однак їх концентрація може швидко зростати, якщо у середовищі з’являється відповідний субстрат. Деякі мікроорганізми мають здатність утворювати індуцибельні ферменти у відповідь на додавання найрізноманітніших речовин, як безпосередніх субстратів, так і взагалі нефізіологічних сполук. Наші дослідження дозволили виявити ряд природних та синтетичних речовин, здатних активувати біосинтез ферментів (рис.1). Це суха бичача кров, глюкоза, мальтоза та сахароза, гуанідин карбонат, нітроаміногуанізон саліцилового та диметиламінобензальдегідів, координаційні сполуки германію з янтарною та оксіетилімінодіоцтовою кислотами. Додавання цих сполук до середовища росту збільшувало секрецію α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази на 50 – 200 %.
Рис. 1. Індукуюча дія деяких сполук на секрецію α-N-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази культурою A. niger 185ш
Механізм індукуючої дії досліджених сполук ймовірно є різним. Активуючий вплив сухої бичачої крові обумовлений скоріш за все наявністю термінальних α-зв’язаних D-галактоз та Ν-ацетилгалактозамінів у глікопротеїнах крові (Yomamoto, 1990). Дія похідних гуанідину може бути пов’язана як з активацією метаболізму клітини взагалі, так і з безпосередньою дією на активні центри ферментів. Спираючись на отримані дані можна припустити, що для індукції глікозидаз суттєвою є наявність саме гуанідинової групіровки, а положення, при якому одна з аміногруп вільна, а інша заміщена фенільним залишком, є вагомою для прояву α-Ν-ацетилгалактозамінідазної та α-галактозидазної активностей. Цікавим здається виявлений нами вперше активуючий вплив комплексів германію (ІV) з органічними кислотами на синтез та активність глікозидаз. Результати цих досліджень дозволяють зробити припущення про те, що ефективність цих сполук у більшій мірі пов’язана з присутністю іону германію, ніж його лігандів. Використання перерахованих сполук дозволило нам підвищити активність α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази у культуральній рідині майже у 3 рази (їх активність склала 0,6 та 2,2 Е/мл, відповідно).
РОЗДІЛ 6. ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИСТКА α-Ν-АЦЕТИЛГАЛАКТОЗАМІНІДАЗИ ТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗИ A. NIGER 185ш
Для виділення та очистки ферментів з культуральної рідини A. niger 185ш були використані такі методи очистки: фракціонування сульфатом амонію, гель-фільтрацію та аніонообмінну хроматографію (рис.2). Очистку здійснювали під контролем електрофорезу в ДСН-ПААГ.
Рис. 2. Схема виділення та очистки препарату A. niger 185ш з електрофореграмою ферментного препарату на різних етапах очистки:
1) після фракціонування сульфатом амонію;
2) після гель-фільтрації на TSK-гелі HW-60;
3) після рехроматографії;
М) маркери молекулярних мас
Таким чином, був отриманий очищений в 600 разів, порівняно з культуральною рідиною, ферментний препарат, який проявляв лише α-Ν-ацетилгалактозамінідазну та α-галактозидазну активності (10,5 та 25 Е/мг білка, відповідно). В препараті були відсутні інвертазна та протеолітичні активності. Специфічна активність препарату відповідає рівню відомих на сьогодні продуцентів та промислових препаратів α-галактозидази, але дещо поступається α-Ν-ацетилгалактозамінідазі з печінки курчат (фірма "Sigma").
Таким чином, нами розроблені наукові засади одержання з A. niger 185ш конкурентноздатного препарату з α-N-ацетилгалактозамінідазною та α-галактозидазною активностями.
РОЗДІЛ 7. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТУ A. NIGER 185ш
Дослідження властивостей ферменту проводили на очищеному препараті, який був гомогенним за даними гель-фільтрації на сефарозі 6В, а його молекулярна маса складала 430 кДа. Молекулярна маса ферменту за даними електрофорезу в ДСН-ПААГ складала 70 кДа, що може свідчити про субодиничну структуру молекули. Це припущення також підтверджується даними досліджень щодо впливу денатуруючих агентів таких як сечовина та гуанідингідрохлорид. На сьогодні вже відомі грибні глікозидази олігомерної будови, хоча наявність високомолекулярних ферментів є більш характерною для бактеріальних продуцентів.
Ферментний препарат містить 20 % кислих та 30 % гідрофобних амінокислот, а також вуглеводний компонент, який представлений нейтральними (маноза, галактоза) та зарядженими (глюкозамін та 2 неідентифіковані гексозаміни) моносахаридами (рис.3).
А Б
Рис. 3. Амінокислотний (А) та моносахаридний (Б) склад ферментного препарату A. niger 185ш
Термо- та рН-оптимуми гідролізу синтетичних субстратів п-нітрофеніл-Ν-ацетил-α-D-галактопіранозиду та п-нітрофеніл-α-D-галактопіранозиду ферментним препаратом A. niger 185ш знаходились при 60 оС та рН 3,5 і 4,1, відповідно. Однак у діапазоні значень від 3,0 до 6,0 спостерігалося до 70 % від максимальної активності. Фермент був стабільним у діапазоні рН від 3,0 до 7,0 та при 37 оС протягом 90 хв. Не спостерігали зменшення α-Ν-ацетилгалактозамінідазної та α-галактозидазної
Таблиця 2
Субстратна специфічність ферментних препаратів A. niger 185ш та C. cladosporioides 189
Таблиця 3
Деякі властивості глікозидаз A. niger 185ш та С.cladosporioides 189
активностей препарату при зберіганні у 3 М розчині сульфату амонію протягом 2 років та ліофільно висушеного препарату - протягом 6 місяців (4 оС). Висока стабільність препарату ферменту може бути пов’язана як із значним вмістом гідрофобних амінокислот, так і з присутністю вуглеводного компонента.
Вивчення каталітичних властивостей ферментного препарату показало, що відповідні синтетичні нітрофенільні субстрати конкурентно інгібують α-Ν-ацетилгалактозамінідазну та α-галактозидазну активності ферменту A. niger 185ш. Наші результати узгоджуються з аналогічними даними щодо більшості досліджених α-галактозидаз. Відповідні дані щодо α-Ν-ацетилгалактозамінідаз, на жаль, відсутні у літературі. Також було показано, що α-Ν-ацетилгалактозамінідазна та α-галактозидазна активності препарату A. niger 185ш конкурентно інгібуються продуктом реакції - Ν-ацетилгалактозаміном та D-галактозою, відповідно.
Ферментний препарат A. niger 185ш виявляв вузьку специфічність щодо глікону: серед багатьох глікозильних залишків він виявляв здатність відщеплювати від нітрофенільного субстрату тільки α-зв’язані Ν-ацетилгалактозамін та D-галактозу (Km 1,25 та 1,19 мМ, Vmax 10,5 та 25 мкмоль/хв/мг білка, відповідно). Препарат виявився також нездатним гідролізувати такі природні субстрати, як мелібіоза, рафіноза та стахіоза, які містять термінальну α-1,6-зв’язану D-галактозу (табл.2). Причиною цього, як нам здається, може бути нездатність ферменту або атакувати природний субстрат взагалі, або гідролізувати α-1,6-зв’язки. За специфічністю дії глікозидаза A. niger 185ш значно відрізняється від α-галактозидази C. cladosporioides 189, яка крім α-D-галактозидів гідролізує β-D-глюкозиди, а також нітрофенільні похідні аміноцукрів в β-конфігурації, хоча дуже близька за своїми фізико-хімічними властивостями та компонентним складом молекули ферменту (табл.3).
РОЗДІЛ 8. ДОСЛІДЖЕННЯ ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ГРУП В АКТИВНОМУ ЦЕНТРІ α-Ν-АЦЕТИЛГАЛАКТОЗАМІНІДАЗИ ТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗИ
Хоча фізико-хімічні властивості глікозидаз досить добре вивчені, питання щодо специфічності їх дії ще не вирішене. Причиною цього є недостатнє вивчення механізму каталізу, що не дозволяє створити узагальнюючу концепцію дії цих ферментів та наблизитися до розшифровки їх специфічності. Важливим підходом до вирішення цієї проблеми є ідентифікація функціональних груп активного центру ферменту, який бере участь у каталізі. Однак цей підхід ускладнюється тим, що фізико-хімічні властивості групи, що ідентифікується, можуть суттєво змінюватися під дією близько розташованих до неї інших дисоціюючих груп молекули ферменту. Надійний висновок можна зробити лише у разі співпадання результатів, отриманих різними способами. Саме такий підхід і було використано у роботі.
Аналіз кінетичних кривих залежності швидкості α-галактозидазної та α-Ν-ацетилгалактозамінідазної реакції від величини рН дозволив встановити наявність двох груп, що іонізуються в активному центрі ферменту A. niger 185ш із значеннями рК 2,2 і 2,8 та 5,9 і 6,2, які відповідають карбоксильній групі С-кінцевої амінокислоти та імідазольній групі гістидину. Участь імідазольної групи гістидину та карбоксильної групи аспарагінової кислоти в реакції, що каталізується α-галактозидазою показано для ферментів з насіння Vicia faba та манго, а також α-галактозидаз C. cladosporioides, P. canescens. Присутність саме цих груп було підтверджено величинами знайденої теплоти іонізації (ΔН). Слід зазначити, що величина ΔН є важливим критерієм ідентифікації груп. Так деякі автори вважають, що достатньо встановити величину рК та теплоту іонізації групи, щоб однозначно визначитися з її хімічною природою (Edsall, 1958). Наявність імідазольної групи гістидину також була підтверджена нашими дослідами з фотоокислення в присутності метиленового синього. Нами спостерігалася фотоінактивація, яка зростала в часі та при зменшенні концентрації Н+-іонів у середовищі, що є характерним саме для цієї групи.
Для виявлення інших функціональних груп, що можуть впливати на каталіз, було застосовано інгібіторний аналіз α-Ν-ацетилгалактозамінідазної та α-галактозидазної реакції з застосуванням іонів металів та аніонів, а також специфічних хімічних агентів.
α-Ν-ацетилгалактозамінідаза та α-галактозидаза відносяться до групи ферментів, для яких присутність металу не є обов’язковою умовою прояву активності, але вона може впливати на конформацію молекули ферменту і робити активні центри більш доступними для субстрату, при цьому змінюватися можуть також групи, які знаходяться на великій відстані від активного центру. При вивченні впливу різних металів на активність ферментного препарату A. niger 185ш було показано, що досліджувані ефектори не виявляють значного впливу на його активність, крім декількох випадків. При цьому дія на α-Ν-ацетилгалактозамінідазну та α-галактозидазну активність суттєво відрізнялися. Так показана активація (в 2 рази) α-Ν-ацетилгалактозамінідазної активності іонами германію на фоні значного зниження (на 50 %) α-галактозидазної. Значне пригнічення α-галактозидазної активності препарату спостерігалось також в присутності іонів срібла та ртуті. Аналогічні дані одержано для α-галактозидаз з інших мікроміцетів: Cephalosporium acremonium, Absidia ramosa, A. awamori, в той час як інактивація α-Ν-ацетилгалактозамінідази іонами ртуті відмічалася тільки у ферменту з Acremonium sp. Вважається, що інгібування ферментів іонами срібла та ртуті є наслідком їх взаємодії з сульфгідрильними, карбоксильними або імідазольними групами білка. Дослідження впливу на ферментативну активність препарату таких металозв’язуючих агентів, як ЕДТА, о-фенантролін, а також азид натрію, показало (табл.4), що вони не впливають на швидкість α-Ν-ацетилгалактозамінідазної та α-галактозидазної реакції. Ці результати дозволяють зробити висновок, що в каталізі, який здійснюється ферментом з A. niger 185ш не беруть участь групи, що містять атоми металів, а фермент є металонезалежним. Це узгоджується з літературними відомостями щодо α-галактозидаз інших мікроорганізмів (Улезло, 1989).
Виявились неактивними щодо ферментного препарату реагенти, які здатні відновлювати дисульфідні зв’язки (табл.4). Можливо, в молекулі ферменту відсутні дисульфідні групи, або ж вони глибоко занурені у білковій глобулі та недоступні впливу цих реагентів.
Таблиця 4
Вплив деяких хімічних реагентів на α-Ν-ацетилгалактозамінідазну та
α-галактозидазну активність ферментного препарату A. niger 185ш
Примітка: час експозиції 60 хв
Дослідження дії інших специфічних хімічних агентів показало (табл.4), що α-галактозидазна реакція інгібується п-хлормеркурібензоатом та вже згаданими іонами срібла і ртуті. Інгібування цими речовинами носило неконкурентний характер. Зважаючи на відсутність захисного ефекту D-галактози на молекулу ферменту, а також на дані щодо кінетики реактивації тіоловими реагентами, можна припустити, що в молекулі ферменту, але не в його активному центрі, присутні SH-групи, які не беруть участі у каталітичному акті, але важливі для прояву α-галактозидазної активності, оскільки виконують функцію додаткових зв’язків, необхідних для орієнтації і зв’язування потрібним чином молекули субстрату з активним центром ферменту, обумовлюючи тим самим специфічність дії α-галактозидази. Слід відмітити, що на α-Ν-ацетилгалактозамінідазну активність ці реагенти не впливають. Як α-галактозидазна, так і α-Ν-ацетилгалактозамінідазна активності інгібувалися сульфітом натрію, який, як відомо, також є специфічним агентом щодо SH-груп. Відомо, що для сполук, які містять близько розташовані SH-групи (дитіоли), характерна висока спорідненість до арсеніту натрію, в результаті чого утворюються циклічні дитіоарсеніти. Було показано, що в концентрації 10-3 М арсеніт лише в дуже незначній мірі впливав на активність ферментів (табл. 4). Цей
факт дозволяє припустити, що у найближчому оточені SH-групи, важливої для прояву активності α-галактозидази, відсутні сусідні сульфгідрильні групи.
Таким чином, наші результати дають підстави вважати, що каталітично активними групами у ферменті A. niger 185ш є карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти (можливо аспарагінової або глутамінової) та імідазольна група гістидину. Також на деякій відстані від активного центру можуть розташовуватися сульфгідрильні групи, які не беруть безпосередньої участі у каталізі, але необхідні для прояву α-галактозидазної активності ферментного препарату A. niger 185ш. В той же час, вони є несуттєвими для α-Ν-ацетилгалактозамінідазної реакції.
РОЗДІЛ 9. ВИЗНАЧЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ ТА ПІРОГЕННОСТІ ПРЕПАРАТУ A. NIGER 185ш
Оскільки ферментний препарат A. niger 185ш може знайти використання у медико-технологічних процесах, доречним було дослідити його токсичність та пірогенність.
При внутрішньочеревинному та внутрішньовенному введенні піддослідним тваринам препарату ферменту в концентрації 5, 50, 250 та 500 мг/кг ваги препарат не виявляв токсичного ефекту.
Визначення пірогенної дії ферментного препарату A. niger 185ш проводили на кролях. Результати термометрії показали (рис.4), що підвищення температури у експериментальних тварин більше ніж на 0,45 оС виникало при введенні 100 мкг препарату/кроля в непірогенному ізотонічному розчині. Таке збільшення виходить за межі фізіологічної норми здорової тварини. У літературі відсутні дані щодо пірогенної дії α-галактозидаз та α-Ν-ацетилгалактозамінідаз з інших джерел. Виявлений нами пірогенний ефект потребує більш детального дослідження в перспективі подальшого впровадження ферменту в медичну практику.
Рис.4. Пірогенна дія ферментного препарату A. niger 185ш.
РОЗДІЛ 10. ВИЗНАЧЕННЯ СЕРОЛОГІЧНОЇ СПОРІДНЕНОСТІ ГРИБНИХ ГЛІКОЗИДАЗ
Для встановлення серологічних зв’язків між глікозидазами, ізольованими з різних продуцентів (A. niger 185ш та C. cladosporioides 189), була одержана антисироватка до ферментного препарату A. niger 185ш і в реакції подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні було показано серологічну спорідненість між ферментами A. niger 185ш та C. cladosporioides 189 (рис.5).
Результати досліджень з сироваткою, виснаженою α-галактозидазою C. cladosporioides 189 (рис.6), показали, що така сироватка серологічно інертна щодо препарату A. niger 185ш.
Ці дослідження дозволяють припустити, що одержаний нами препарат представлений лише одним ферментом, який проявляє α-Ν-ацетилгалактозамінідазну та α-галактозидазну активності.
Рис. 5. Подвійна імунодифузія в агарі за Оухтерлоні
1 – препарат A. niger 185ш; 2,3 – препарат С.cladosporioides 189;
С – сироватка до препарату A. niger 185ш
Рис. 6. Подвійна імунодифузія в агарі за Оухтерлоні
Ф – препарат A. niger 185ш; НС–нативна сироватка до препарату A. niger 185ш; ВС – сироватка, виснажена препаратом α-галактозидази С.cladosporioides 189
ВИСНОВКИ
- В результаті скринінгу серед 1514 культур мікроорганізмів — представників 32 родів мікроміцетів, 14 родів дріжджів та 6 родів бактерій, α-Ν-ацетилгалактозамінідазна активність була виявлена у штамів, що належали до родів Aspergillus, Eurotium, Penicillium та Arthrobacter. Відібрано штам Aspergillus niger 185ш, який відрізнявся високим рівнем активності α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази (0,142 та 0,7 Е/мл, відповідно).
- Внаслідок оптимізації умов культивування штаму Aspergillus niger 185ш вдалося підвищіти рівень активності α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази в культуральній рідині в 1,5 та 2,0 рази, відповідно.
- Вперше встановлено, що ряд природних (суха бичача кров, глюкоза, мальтоза, сахароза) та синтетичних (гуанідин карбонат, нітроаміногуанізон саліцилового та диметиламінобензальдегідів, координаційні сполуки германію з янтарною та оксіетилімінодіоцтовою кислотами) речовин здатні активувати синтез α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази на 50 - 200 %.
- Розроблено методи виділення з культуральної рідини та очистки ферментного препарату, які включають фракціонування сульфатом амонію, аніонообмінну та гель-фільтрацію на TSK-гелях. Питома α-Ν-ацетилгалактозамінідазна та α-галактозидазна активність очищеного в 600 разів препарату складає 10,5 та 25 Е/мг білка, відповідно.
- Встановлено, що оптимальними умовами для гідролізу відповідних синтетичних субстратів ферментним препаратом є значення рН 3,5-4,1, температури 60 оС. Ферментний препарат стабільний при t від 0 до 20 оС в діапазоні рН від 3,0 до 7,0. Показана субодинична структура молекули ферменту, його молекулярна маса за даними гель-фільтрації на сефарозі 6В становить 430 кДа, за даними ДСН-ПААГ - 70 кДа. В молекулі ферменту переважають кислі (20 %) та гідрофобні (30 %) амінокислоти, а також присутній вуглеводний компонент, представлений манозою, галактозою, глюкозаміном та двома неідентифікованими гексозамінами.
- Встановлено, що ферментний препарат A. niger 185ш проявляє вузьку специфічність відносно глікону.
- Показано, що фермент A. niger 185ш є металонезалежним, в його молекулі відсутні іони металів. Досліджені іони металів не впливали на ферментативну активність препарату, за винятком іонів Ge4+, який мав активуючу дію щодо α-Ν-ацетилгалактозамінідази, але одночасно інгібував α-галактозидазну активність.
- Встановлено, що каталітично активними групами ферментного препарату A. niger 185ш, які відповідають за прояв α-Ν-ацетилгалактозамінідазної та α-галактозидазної активності, є карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти (можливо аспарагінової або глутамінової) та імідазольна група гістидину. Виявлено наявність поза активним центром ферменту SH-груп, важливих для прояву α-галактозидазної активності, але не суттєвих для α-Ν-ацетилгалактозамінідазної.
- Вперше встановлено серологічну спорідненість між глікозидазами A. niger 185ш та C. cladosporioides 189.
- Показано, що препарат ферменту є нетоксичним (500 мг/кг ваги), але пірогенним (0,04 мг/кг ваги).
- Одержання високоактивного ферментного перпарату з α-Ν-ацетилгалактозамінідазною та α-галактозидазною активностями та дослідження його властивостей створює передумови для впровадження в Україні новітніх медичних біотехнологій.
|
