|
КАБІНЕТ МІНІСТРІВ УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
БУЧКО Оксана Михайлівна
УДК 636.4: 577.15: 591.8: 546.23: 546.72
СИСТЕМА АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ В ТКАНИНАХ
СВИНЕЙ В РАННІЙ ПОСТНАТАЛЬНИЙ ПЕРІОД
03.00.04 - біохімія
А в т о р е ф е р а т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті землеробства і біології тварин УААН (м.Львів)
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член- кореспондент УААН, Заслужений діяч науки і техніки України СНІТИНСЬКИЙ Володимир Васильович, Львівський державний аграрний університет, ректор
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор ЗАХАРЕНКО Микола Олександрович, Національний аграрний університет, декан зооінженерного факультету, завідувач кафедри гігієни і екології тварин;
доктор біологічних наук, професор ВОЙЦІЦЬКИЙ Володимир Михайлович, кафедра біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка
Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, відділ біохімії сенсорних і регуля- торних систем, м. Київ
Захист відбудеться “_4___“ червня 1999 р. о 14годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 252041, м.Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. № 65.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 252041, м.Київ-41, вул. Героїв Оборони, 11, навчальний корпус № 10.
Автореферат розісланий “30” квітня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Цвіліховський М. І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. З’ясування біохімічних механізмів постнатальної адаптації новонароджених організмів є однією з найбільш актуальних наукових проблем в галузі біології тварин [Аршавский И.А., 1982; Илюха В.И., 1995]. Вирішення цього питання можливе лише на основі глибокого пізнання молекулярних механізмів, які детермінують рівень субстратного і кисневого забезпечення тканин організму в умовах переходу від пре- до постнатального періоду онтогенезу [Sies H. et al., 1985; Saugstad O.D., 1990; Львова С.П., Абаева Е.М., 1996]. Відомо, що найбільш суттєві зміни фізіологічних функцій та біохімічних процесів відбуваються в період адаптації новонароджених до нових умов існування. Цей перехід характеризується значними метаболічними зрушеннями, пов’язаними із зміною маси тіла, гормонального статусу, окисно-відновних процесів, інтенсифікацією процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) [Русанов С.Ю. и др., 1985; Kanner J. et al., 1987; Halliwell B. et al., 1993]. Важлива роль, при переході організму від пре- до постнатального розвитку, що характеризується зміною кисневого режиму і виникненням стану гіпероксії, належить системі антиоксидантного захисту (АОЗ), яка зумовлює інактивацію продуктів пероксидації, запобігає їх нагромадженню та сприяє відновленню, виникаючих у цей період життя, окиснених сполук [Sies H. et al., 1991; Smith C.V. et al., 1993; Дубинина Е.Е. и др., 1997]. Однак на сьогодні практично відсутні дослідження, які б в повній мірі характеризували процеси прооксидантної системи та АОЗ в тканинах новонароджених поросят, що має крім теоретичного і важливе практичне значення.
Відомо, що накопичення в тканинах тварин продуктів ПОЛ є передумовою для виникнення гіпоксії, анемії тощо. За даними [Prakash M.O. et al., 1988; Miroguchi Hideaki, 1992], анемія є одним із найбільш розповсюджених захворювань новонароджених поросят, що наносить значні економічні збитки [Карелин А.И., 1983; Снитинский В.В., Янович В.Г., 1984]. Однією з основних причин анемії є нестача заліза в організмі новонароджених поросят. З метою стимуляції еритропоезу в кровотворних органах поросятам-сисунам вводять сполуки заліза, зокрема залізодекстранові препарати [Калашников А.П. и др., 1985; Przala F. et al., 1988]. Очевидно, при цьому в тканинах новонароджених тварин посилюються процеси утворення вільнорадикальних компонентів, що зумовлюють нагромадження в клітині продуктів ПОЛ, зміну метаболічних процесів та фізіологічних функцій [Владимиров Ю.В., Арчаков А.И., 1972; Белоус В.А., Конник К.Т., 1991]. Вказана наукова проблема на сьогодні практично не досліджена, що не дає можливості в повній мірі охарактеризувати біохімічні механізми адаптації новонароджених поросят до нових умов існування та оцінити метаболічну відповідь організму на введення залізовмісних препаратів. Поряд з цим, поза увагою залишились питання вивчення прооксидантної дії декстроферу в тканинах новонароджених поросят, вплив препарату селену на ПОЛ та систему АОЗ, як одного з ефективних антиоксидантних препаратів [Neve I., 1991; Снітинський В.В., Антоняк Г.Л., 1994; Simoni J. et al., 1995].
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом наукової теми UA № 0196ИО10486, шифр 0201 "Молекулярні механізми формування системи регуляції метаболізму, гемопоезу та імунної функції у свиней і великої рогатої худоби на ранніх етапах постнатального онтогенезу", що виконувалась в лабораторії ендокринної регуляції Інституту землеробства і біології тварин УААН.
Мета і завдання дослідження. Головною метою роботи було дослідити стан процесів ПОЛ і антиоксидантної системи (АОС) в тканинах новонароджених поросят та з’ясувати вплив сполук Fe і Se на окремі ланки АОС.
У зв’язку з цим ставилось завдання:
– вивчити показники АОС в тканинах печінки, серцевого та скелетного м’язів, легень, нирок і селезінки поросят на початку постнатального періоду онтогенезу;
– дослідити інтенсивність процесів ПОЛ у тканинах печінки, серцевого та скелетного м’язів, легень, нирок і селезінки новонароджених поросят;
– з’ясувати вплив декстроферу та селеніту натрію на процеси ПОЛ та стан АОС в тканинах поросят в ранній період постнатального онтогенезу.
Hаукова новизна одержаних результатів. Досліджено динаміку показників системи АОЗ в тканинах поросят в період раннього постнатального онтогенезу. Виявлено, що інтенсивність процесів ПОЛ та стан АОС в різних тканинах поросят змінюється в динаміці перших 10 діб після народження.
Встановлено, що співвідношення між процесами ПОЛ та станом АОС в тканинах поросят після народження зміщено в сторону активації процесів пероксидації. Пристосування новонароджених тварин до нових умов існування на протязі перших 10 діб пов’язане з активацією ферментів АОС і зниженням інтенсивності процесів ПОЛ в тканинах. Виявлено основні біохімічні механізми впливу сполуки заліза (декстроферу) і селеніту натрію на процеси ПОЛ та АОЗ в тканинах поросят у перші 10 діб після народження.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розкривають деякі аспекти механізмів адаптації новонароджених тварин до нових умов існування, показують вплив заліза та селену на процеси ПОЛ та АОЗ в тканинах поросят, що може бути теоретичною основою застосування існуючих і розробки нових профілактичних заходів та лікувальних засобів у ветеринарній медицині. Результати досліджень можуть бути використані при вивченні фізіології і біохімії онтогенезу та в курсах біохімії і фізіології тварин.
Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальних досліджень, статистичній обробці результатів, підборі та обробці даних наукової літератури, а також в участі у підготовці публікацій, аналізі та інтерпритації одержаних результатів, написанні роботи.
Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на: VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997); науковій конференції, присвяченій 100-річчю кафедри фізіології Львівського медичного інституту (Львів, 1995); XV з’їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк–Львів, 1998); XVII conf. “Dni fyziologie hospodarskych zvierat” (Kosice, 1997); науковій конференції молодих вчених Інституту фізіології і біохімії тварин УААH (Львів, 1997); III міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1998); міжнародній науково-практичній конференції "Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва" (Львів, 1997); міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених: "Hаукові досягнення в галузі ветеринарної медицини" (Харків, 1997); II міжнародній конференції “Проблеми неінфекційної патології тварин” (Біла Церква, 1998); міжнародній конференції “Біологічні основи живлення сільськогосподарських тварин” (Львів, 1998).
Публікації результатів досліджень. За результатами досліджень опубліковано 20 наукових робіт, включаючи 5 статей.
Структура та об’єм дисертації. Дисертація містить 138 сторінок машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалу і методики досліджень, власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків та списку літератури, який включає 322 джерела. У дисертації міститься 11 таблиць, 5 рисунків та 1 додаток.
ВИБІР НАПРЯМКІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ
ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Робота виконана з використанням 40 новонароджених поросят віком від 1 до 10 діб, середньою живою масою 1–3 кг, одержаних від свиноматок великої білої породи на племінній фермі дослідного господарства Бучацького радгоспу-технікуму Тернопільської області. Поросята утримувались під свиноматками, годівля яких здійснювалася згідно загальноприйнятих у тваринництві норм [Калашников А.П. и др., 1985].
Проведено дві серії біохімічних досліджень. У першій серії дослідів вивчали інтенсивність процесів ПОЛ та захисної дії АОС в тканинах паренхіматозних органів поросят протягом перших 10-ти діб після народження. У другій серії експериментів досліджували вплив препарату Fe – декстроферу та сполуки Se – селеніту натрію на процеси ПОЛ та АОС в тканинах.
Піддослідних тварин ділили за принципом аналогів на три групи. Тваринам першої дослідної групи на третю добу життя внутрішньом’язово вводили 2 мл декстроферу 100 (залізодекстранового фармакопейного препарату, виробництва ГХО “ФАРМАХИМ” – Болгарія), 1 мл якого містить 100 мг Fe3+, з розрахунку
2 мл/кг маси тіла. Тваринам другої дослідної групи на другу добу життя внутрішньом’язово вводили розчинений в дистильованій воді селеніт натрію (Na2SeO3) з розрахунку 0,075 мг селену/кг маси тіла і на третю добу життя внутрішньом’язово – 2 мл декстроферу. Тваринам контрольної групи вводили 2 мл 0,9%-ного розчину NaCL на 3-ю добу життя.
Об’єктом досліджень були тканини печінки, серцевого та скелетного м’язів, легень, нирок і селезінки тварин, отримані на 1–, 3–, 5–, 10–у доби життя. Органи виділяли після декапітації та обезкровлення поросят. В надосадовій рідині, одержаній при центрифугуванні гомогенатів тканин, визначали каталітичну активність ферментів АОС, вміст малонового диальдегіду, гідроперекисів ліпідів та відновленого глутатіону.
Активність супероксиддисмутази – СОД (перекис: перекис оксидоредуктаза, КФ 1.15.1.1) визначали за рівнем гальмування ферментом процесу відновлення нітросинього тетразолію в присутності NAD⋅H і феназинметасульфату за методом Дубініної Є.Є. і ін. (1983) у нашій модифікації. Активність глутатіонпероксидази – ГП (глутатіон: перекис водню оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.9) визначали за швидкістю окиснення глутатіону в присутності гідроперекису третинного бутилу за методом Моіна В.М. (1986) у нашій модифікації, глутатіонредуктази – ГР (NADP⋅H: окислений глутатіон оксидоредуктаза, КФ 1.6.4.2) – за швидкістю відновлення глутатіону в присутності NADP⋅H [Антоняк Г.Л., 1998]. Вміст відновленого глутатіону (GSH) визначали за рівнем утворення тіонітрофенільного аніону в результаті взаємодії SH – груп глутатіону з 5,5-дитіобіс-2-нітробензойною кислотою [Tietze F., 1969].
Вміст малонового диальдегіду (МДА) визначали за методом в основі якого лежить реакція між МДА і тіобарбітуровою кислотою [Коробейников Э.Н., 1989], гідроперекисів ліпідів – за допомогою тіоцианату амонію [Мирончик В.В., 1984].
Концентрацію білку в гомогенатах тканин визначали методом Lowri O.H. et al. (1951). Статистичну обробку одержаних результатів досліджень проводили за допомогою комп’ютера IBM-486 за спеціально складеною програмою. Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами використовували критерій Стьюдента (t).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ
Активність ферментів антиоксидантної системи в тканинах. Перехід організму тварин від внутрішньочеревного розвитку до самостійного життя пов’язаний зі значними змінами метаболічних процесів, що супроводжується інтенсифікацією окисно-відновних процесів і активною генерацією вільних радикалів, рівень яких контролюється АОС організму [Русанов С.Ю. и др., 1985; Saugstad O.D., 1990]. СОД – один з ключових ферментів цієї системи, яка знешкоджує О.2 (супероксидний аніон) [MrCord J., Fridovich I., 1988; Дубинина Е.Е., 1989].
Проведеними дослідженнями встановлено, що активність СОД у тканинах 1-добових поросят знаходиться на досить високому рівні і змінюється в різних тканинах в межах 5,77–8,8 ум.од./хв х мг білка. Однак, вже на 3-ю добу активність ферменту в печінці знижується в середньому на 61%, в серцевому і скелетному м’язах відповідно – на 64 і 67%, в нирках – на 60%, в легенях – на 78% і в селезінці – на 71% в порівнянні з аналогічними даними у тварин на 1-у добу життя (табл. 1).
Таблиця 1 – Активність супероксиддисмутази в тканинах (M±m; n=3–4; ум.од./хв х мг білка)
Примітка. У цій і наступних таблицях * – вірогідність відмінностей у значеннях показників порівняно з групою 1-добових тварин (* Р≤0,05).
В тканинах тварин на 5-у добу життя активність СОД також залишається нижчою приблизно в 3,5–4,5 рази в порівнянні з 1-добовими тваринами. Крім того, зареєстровано подальше зниження активності ферменту в печінці, серці, скелетному м’язі, нирках і легенях 5-добових поросят у порівнянні з її активністю в 3-добовому віці. На 10-у добу життя активність СОД в усіх досліджуваних тканинах зростає до рівня цих показників у 1-добових тварин, що є метаболічною відповіддю на зміну парціального тиску О2 та інтенсивності процесів ПОЛ, проявом "оксидаційного стресу" та постнатальної адаптації [Curtis S.E., 1974; Лукьянова Л.Д. и др., 1982; Калитка В.В., Донченко Г.В., 1995].
Таблиця 2 – Активність глутатіонпероксидази в тканинах (M±m; n=3–4;
нмоль GSH/хвмг білка)
Аналіз даних, представлених в табл. 2 свідчить про те, що найвища активність ГП – ключового ферменту АОС в усіх досліджуваних органах, за виключенням серця та скелетних м’язів, спостерігається на 3–5-у добу життя. Так, активність ГП в тварин на 3-ю добу вища в легенях більш як у 10 разів, селезінці – в 2,8 рази в порівнянні з показниками активності у поросят на 1-у добу життя. Причому в печінці найвищу активність ферменту зареєстровано на 3-ю, у серцевому м’язі – на 10-у добу. Активність ГП у тварин на 5-у добу збільшувалась в нирках і селезінці, не змінювалась – в печінці, серці та скелетних м’язах і знижувалась в легенях в порівнянні з 3-добовими тваринами. Досить високою залишалась активність ферменту і в тканинах тварин на 10-у добу життя (див. табл. 2). Ймовірно, висока активність ГП в досліджуваних органах пов’язана з продукцією NADP⋅H-кофактора, необхідного для поповнення пула GSH – регулятора активності ферменту [Flohe L., Gunzler W.A., 1974; Іскра Р.Я. і ін., 1997].
ГР каталізує процес відновлення GSSG у GSH і у комплексі з ГП формує редокс-цикл тіолової АОС [Avitabile M. et al., 1991; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1993]. Дослідженнями показано, що максимальна активність ГР у всіх досліджуваних тканинах тварин спостерігається на 3-ю добу після народження (табл. 3). Активність ферменту в цей період, порівнюючи з поросятами на 1-у добу, вища: в легенях – в середньому в 4,2; в серці – в 4,1; в скелетних м’язах – в 4,7; в нирках – в 6,0; в селезінці – в 6,1 і в печінці – в 6,8 разів. Зростання активності ГР в тканинах тварин, очевидно, зумовлене компенсаторною реакцією глутатіонової системи АОЗ на різке зниження активності СОД і посилення генерації активних О.2 радикалів [Дубинина Е.Е., 1989; Снітинський В.В. і ін., 1998].
Таблиця 3 – Активність глутатіонредуктази в тканинах (M±m; n=3–4;
нмоль NADP⋅H/хвмг білка)
Hайвища активність ГР, протягом всього періоду досліджень спостерігалась в нирках тварин у порівнянні з іншими органами, що пов’язано з різким зростанням обміну речовин і формоутворюючих процесів у цій тканині в ранній постнатальний період [Мещишен И.Ф. и др., 1978]. Hайнижча активність ГР виявлена в скелетних м’язах, що пояснюється (тією ж причиною, що і в випадку з ГП) відсутністю необхідності в підтриманні високої антиоксидантної активності в даній тканині в зв’язку з посиленням в ній гліколітичних процесів [Львова С.П., 1996].
Відновлений глутатіон разом з ГП і ГР утворюють єдину глутатіонову систему, яка ефективно захищає організм від пероксидного стресу [Dolphin D. et al., 1989; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990]. Рівень GSH у печінці тварин на 3-ю добу життя (2,15 мкмоль/г тканини) порівнюючи з тваринами на 1-у добу (0,43 мкмоль/г тканини) вищий майже в 5,0 разів, що пов’язано з посиленням синтезу цієї тіолової сполуки. Менш суттєві зміни зареєстровано у серці. Значне підвищення вмісту GSH відмічено в печінці та серці тварин 10-добового віку, що пояснюється активацією глутатіонової системи АОЗ організму поросят [Русанов С.Ю. и др., 1985].
Процеси перекисного окиснення ліпідів у тканинах. Дані представлені в табл. 4 свідчать про те, що найвищий рівень МДА спостерігається в серці та легенях 1-добових поросят і майже удвоє нижчий в інших органах. На 3-у добу його вміст у серці і легенях знизився, в нирках, селезінці та скелетних м’язах не змінився, а в печінці зріс в порівнянні з 1-добовими тваринами. В подальшому спостерігали суттєве зниження концентрації МДА у всіх досліджуваних тканинах в середньому в 1,5–6,0 рази. Підвищений рівень цієї речовини в органах поросят у перші три доби життя може бути пов’язаний з високою концентрацією поліненасичених жирних кислот в молозиві свиноматок, що призводить до активації процесів вільнорадикального окиснення [Данчук В.В., 1994; Снітинський В.В. і ін., 1996].
Таблиця 4 – Вміст малонового диальдегіду в тканинах (M±m; n=3–4;
нмоль/г тканини)
Різке зниження вмісту МДА до 10-ї доби в усіх досліджуваних органах новонароджених тварин може вказувати на посилення в цей період ферментативних і неферментативних механізмів АОС захисту організму [Дещекина М.Ф. и др., 1989; Ledwozyw A., Kadziolka A., 1989].
Таблиця 5 – Вміст гідроперекисів ліпідів у тканинах (M±m; n=3–4; Е/г тканини)
Вміст гідроперекисів ліпідів у тканинах тварин практично не змінювався протягом перших 10-ти діб постнатального розвитку (табл. 5). Деяке зниження концентрації згаданих речовин спостерігається в 3-добовому віці поросят у легенях в середньому на 27%. Мінімальний рівень гідроперекисів ліпідів у нирках поросят, стосовно інших тканин, в усі досліджувані періоди свідчить про високу активність ферментів глутатіонового ряду в цьому органі [Аvissar Nelly et al., 1994].
Вплив сполук заліза і селену на показники антиоксидантної системи. Відомо, що для попередження виникнення анемії новонародженим поросятам вводять залізовмісні препарати [Карелин А.И., 1983; Калашников А.П. и др., 1985]. Однак є дані, що залізо, як елемент, ініціює процеси ПОЛ [Белоус А.М., Конник К.Т., 1991; Shainkin-Kestenbaum R. et al., 1991]. Тому, для зниження стимулюючої дії Fe3+ на ПОЛ поросятам 2-ої дослідної групи вводили антиок | 
