|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
Коваленко Марина Олексіївна
УДК 579.841: 577.114
СИНТЕЗ МІКРОБНОГО ЕКЗОПОЛІСАХАРИДУ ЕТАПОЛАНУ НА СУМІШІ РОСТОВИХ СУБСТРАТІВ
03.00.07 – мікробіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі біології газоокислюючих мікроорганізмів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного
Національної академії наук України
Науковий керівник: доктор біологічних наук Пирог Тетяна Павлівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Іутинська Галина Олександрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач відділу загальної та грунтовоі мікробіології.
доктор біологічних наук, професор Ставська Софія Стефанівна, Національний технічний університет України (КПІ) Міністерства освіти і науки України, професор кафедри технології целюлозо-паперових виробництв та промислової екології.
Провідна організація: Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна Національної академії наук України, м. Київ
Захист відбудеться 19 листопада 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154
Автореферат розісланий 09 жовтня 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.
Актуальність проблеми. На сьогоднішній день, коли біосинтез практично важливих продуктів реалізується у промисловому масштабі, питання, що стосуються використання дешевої сировини, забезпечення економії вуглецевих субстратів, зниження енергетичних витрат на процес мікробного синтезу, а також проблеми більш повної трансформації вуглецевих субстратів в практично цінні метаболіти, набувають особливої актуальності. Вирішення даних питань потребує глибоких знань фізіології, біохімії та енергетики продуцентів. Розробка на основі цих знань принципів регуляції енергетичного та конструктивного метаболізму дозволить реалізувати біотехнологічні процеси з найбільш високою ефективністю.
У природних місцях існування мікроорганізми, як правило, розвиваються за наявності декількох вуглецевих субстратів, в той час як у лабораторних умовах для їх культивування використовуються моносубстрати як єдине джерело вуглецю та енергії. Разом з тим відомо, що значна частина деяких субстратів витрачається на окиснення до СО2 для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму (наприклад, на глюкозі - 40%). Поряд з цим відомі роботи, якими доведено здатність мікроорганізмів використовувати суміші двох (чи більше) субстратів і вивчено деякі аспекти регуляції таких процесів (Eggeling, Sahm, 1981; Linton et al., 1981; Mьller et al., 1983). Проте, ці дослідження стосуються використання змішаних субстратів лише для підвищення виходу біомаси. У літературі відсутні дані про можливість одержання вторинних метаболітів, зокрема мікробних екзополісахаридів (ЕПС), в умовах міксотрофного росту продуцента.
На наш погляд, теоретичною основою досліджень по підвищенню ефективності синтезу вторинних метаболітів на суміші декількох ростових субстратів може слугувати концепція "допоміжного" субстрату, розроблена Бабелем (Babel, 1979) з метою підвищення виходу біомаси. В основу цієї концепції покладена "енергетична класифікація субстратів", згідно з якою всі субстрати поділяються на енергетично-надлишкові та енергетично-дефіцитні (Babel, Mьller, 1985). Центральним вуглецевим попередником (ключовим інтермедіатом) синтезу всіх клітинних компонентів є 3-фосфогліцеринова кислота (ФГК). Якщо кількість АТФ і відновлювальних еквівалентів, що утворюються на шляху від субстрату до ФГК, є достатньою для синтезу біомаси, такий субстрат класифікується як енергетично-надлишковий. Енергетично-дефіцитними є субстрати, частина яких повинна бути окиснена до СО2 для одержання енергії, необхідної для синтезу клітинних компонентів. Знаючи метаболічні шляхи перетворення вуглецевого субстрату в ФГК, можна визначити "енергетичну цінність" субстрату.
Відомо, що комбінація енергетично-нерівноцінних субстратів дає змогу уникнути непродуктивних втрат вуглецю та енергії, які мають місце при використанні мікроорганізмами моносубстрату, та підвищити ефективність трансформації вуглецю субстратів у біомасу (Eggeling, Sahm, 1981; Linton et al., 1981; Mьller et al., 1983; Babel, 1979). На нашу думку, такий підхід може бути застосований не лише для підвищення виходу біомаси (як запропоновано Бабелем), але й для інтенсифікації синтезу вторинних метаболітів (з урахуванням додаткових енергозатрат на їх утворення).
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно з планом науково-дослідних робіт відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології НАН України за темами "Вивчення екології метилотрофних бактерій і регуляції синтезу практично важливих метаболітів" (№ 0196U003717), "Біологія і біотехнологічні аспекти практичного використання бактерій, які ростуть на С1-С2-субстратах" (№ 0101U003059).
Мета і задачі досліджень. Мета роботи полягала в дослідженні інтенсифікації синтезу мікробного ЕПС етаполану (продуцент – штам Acinetobacter sp. ІМВ В-7005) на основі визначення біохімічних та енергетичних аспектів використання бактеріями суміші енергетично-нерівноцінних субстратів, встановлення механізмів регуляції синтезу вторинних метаболітів на цих субстратах та вивчення біологічної активності етаполану.
Для виконання роботи необхідно було вирішити наступні завдання:
- встановити можливість синтезу ЕПС штамом Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на вуглеводних субстратах та дослідити особливості його С6-метаболізму;
- визначити потенційні енергетично-дефіцитні та енергетично-надлишкові ростові субстрати для продуцента етаполану;
- визначити енергетичні потреби синтезу біомаси та ЕПС на енергетично-дефіцитному субстраті та розрахувати співвідношення концентрацій енергетично-нерівноцінних субстратів при вирощуванні бактерій на їх суміші;
- встановити характер споживання суміші субстратів (міксотрофія, диауксія);
- розробити шляхи інтенсифікації синтезу етаполану на суміші енергетично-нерівноцінних субстратів;
- визначити активність ключових ферментів С2-С6-метаболізму при вирощуванні бактерій на суміші ростових субстратів та встановити механізми, що забезпечують підвищення синтезу ЕПС в умовах міксотрофного росту продуцента;
- визначити хімічний склад, молекулярну масу та дослідити реологічні властивості розчинів етаполану, синтезованого на моно- та змішаному субстратах;
- дослідити антифітовірусну активнісь етаполану, синтезованого на різних джерелах вуглецевого живлення.
Об’єкт дослідження – процес синтезу мікробного ЕПС етаполану на суміші енергетично-нерівноцінних субстратів.
Предмет дослідження – штами Acinetobacter sp. ІМВ В-7005, Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ), мікробний полісахарид етаполан.
Методи дослідження – мікробіологічні, вірусологічні, біохімічні, фізико-хімічні, хімічні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено можливість інтенсифікації синтезу вторинних метаболітів (на прикладі мікробного ЕПС етаполану) на суміші енергетично-нерівноцінних ростових субстратів.
На основі аналізу шляхів енергетичного та конструктивного метаболізму С2-С6-сполук у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1НГ) визначено енергетично-надлишковий (етанол) та енергетично-дефіцитний (глюкоза) субстрати. На основі теоретичних розрахунків енергетичних потреб синтезу біомаси та ЕПС на енергетично-дефіцитному субстраті визначена "доповнююча" концентрація енергетично-надлишкового субстрату, яка дозволяє поповнити втрати вуглецю глюкози при окисненні її до СО2 з метою одержання енергії для процесів конструктивного метаболізму. Встановлено міксотрофний характер споживання етанолу та глюкози при вирощуванні продуцента на їх суміші.
Визначено умови культивування Acinetobacter sp. ІМВ В-7005, (співвідношення концентрацій енергетично-нерівноцінних субстратів, концентрація джерела азотного живлення, спосіб приготування посівного матеріалу, відсутність катіонів натрію в середовищі), які дозволяють уникнути непродуктивних втрат вуглецю та енергії, що мають місце при використанні моносубстратів та забезпечують максимально повну трансформацію вуглецю обох субстратів в ЕПС.
Показано, що активність ключових ферментів С2-метаболізму при вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1НГ) на суміші субстратів знижувалась, а ферментів циклу трикарбонових кислот (ЦТК) – підвищувалась у порівнянні з культивуванням на етанолі. Встановлено, що інтенсифікація синтезу ЕПС на суміші енергетично-нерівноцінних субстратів обумовлена посиленням глюконеогенезу, про що свідчило одночасне функціонування двох анаплеротичних шляхів (гліоксилатного циклу та піруваткарбоксилазної реакції) та підвищення в 1,5 рази активності фосфоенолпіруват(ФЕП)-синтетази.
Показано, що етаполан, синтезований на суміші етанолу та глюкози, характеризується підвищеним вмістом жирних кислот та більш високою молекулярною масою у порівнянні з одержаним на моносубстратах, що супроводжується покращенням його реологічних властивостей.
Вперше встановлено антифітовірусну активність полісахаридних препаратів етаполану, синтезованих на моно- та змішаних субстратах.
Практична значимість роботи. На основі експериментальних даних розроблено технологію одержання етаполану, що дозволяє підвищити майже у 2 рази максимальну швидкість росту продуцента, кількість синтезованих ЕПС, їх вихід по відношенню до біомаси та вихід ЕПС від субстрату, а також скоротити тривалість культивування та покращити реологічні властивості розчинів ЕПС, що визначають його практичну цінність.
Одержані дані є основою для створення принципово нових технологій одержання практично цінних вторинних метаболітів на суміші енергетично-нерівноцінних ростових субстратів.
Дослідження антифітовірусної активності показало, що етаполан може бути використаний для розробки препаратів, що індукують стійкість рослин до вірусних інфекцій.
Конкретна особиста участь автора в отриманні результатів. Експериментальна робота виконана особисто автором. Визначення молекулярно-масового розподілу ЕПС здійснювали спільно з к.б.н. Воцелко С. К. (ІМВ НАН України). Дослідження антифітовірусної активності етаполану проводили спільно з д.б.н. Коваленко О.Г. (ІМВ НАН України)
Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на науковій конференції-конкурсі молодих вчених ІМВ НАН України (2000, 2001), 3-ій Міжнародній конференції "Біоресурси і віруси" (Київ, 2001), 24-му Міжнародному симпозіумі з біотехнології палива і хімічних продуктів (США, 2002), Міжнародній конференції "Микробиология и биотехнология ХХІ столетия" (Мінськ, 2002), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), І Міжнародному конгресі "Биотехнология – состояние и перспективы развития" (Москва, 2002), 69-й науковій конференції молодих вчених, аспірантів та студентів Національного університету харчових технологій (Київ, 2003).
Публікації. По темі дисертації опубліковано 9 наукових праць, із них – 4 статті у фахових виданнях та 5 тез конференцій.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (2 розділи), експериментальної частини (5 розділів), обговорення результатів, висновків, списку цитованої літератури, який включає 188 найменувань (з яких 153 - іноземні). Робота викладена на 136 стор. машинописного тексту, ілюстрована 6 рисунками і 26 таблицями.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
РОЗДІЛ 1. Типи трансформації ростових та неростових субстратів у мікроорганізмів
Розглянуто такі поняття, як "ростовий" та "неростовий" субстрат, а також сутність та механізми шляхів використання мікроорганізмами суміші ростових та неростових субстратів (міксотрофія, диауксія, неростове окиснення, кометаболізм, синтаболізм).
РОЗДІЛ 2. Інтенсифікація росту мікроорганізмів на суміші субстратів
Наведено основні положення концепції допоміжного субстрату та сутність енергетичної класифікації субстратів Бабеля. Представлено літературні дані про вплив умов культивування (концентрація субстратів, їх співвідношення, спосіб культивування мікроорганізмів, швидкість розведення при безперервному культивуванні та ін.) на характер споживання суміші субстратів, а також використання змішаних субстратів з метою інтенсифікації росту мікроорганізмів.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
РОЗДІЛ 3. Матеріали та методи досліджень
Характеристика використаних у роботі бактерій. Основним об’єктом досліджень був штам бактерій Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 - продуцент комплексного полісахаридного препарату етаполану (Гринберг и др., 1987). Для проведення ензиматичних і полярографічних досліджень використовували мутантний штам Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ), що не утворює ЕПС і який був одержаний з вихідного штаму за допомогою нітрозогуанідінового мутагенезу (Пирог и др., 2000).
Культивування бактерій. Бактерії вирощували на мінеральному середовищі Кодама (1977) (середовище N 1), а також на середовищі N 2, в якому КOH та КCl були замінені на еквімолярні кількості NaOH і NaCl. У середовища додатково вносили 0,5% (за об’ємом) дріжджового автолізату та 0,0006% пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовували етанол в концентрації 0,5; 1,0; 1,5; 1,7% (за об’ємом), глюкозу в концентрації 0,5; 1,0; 1,35; 1,5% (мас.), а також суміш цих субстратів у співвідношенні 1:2; 1:1; 2:1 (% етанолу за об’ємом : мас. % глюкози). При вивченні здатності продуцента етаполану синтезувати ЕПС на вуглеводних субстратах як джерело вуглецю та енергії використовували також манозу, фруктозу, арабінозу, галактозу, рамнозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, гідролізовані мелясу та крохмаль ДЕ-60. При дослідженні впливу концентрації азоту на утворення ЕПС вміст NH4NO3 у середовищі складав 0,3; 0,45 та 0,6 г/л.
Культивування бактерій здійснювали в колбах на качалці (220 об/хв) при 30°С, рН 6,8-7,0 впродовж 16-96 год.
Концентрацію біомаси визначали за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху вагу клітин у відповідності з калібрувальним графіком. Питому швидкість росту культури та ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС (вихід ЕПС від субстрату, ЕПС-синтезуюча здатність) розраховували за загальноприйнятими методами (Перт, 1978). Кількість синтезованих полісахаридів встановлювали ваговим методом (Williams, Wimpenny, 1978) та за концентрацією вуглеводів, що визначалась колориметричним методом за реакцією з фенолом і сірчаною кислотою (Dubois et al, 1956).
Концентрацію етанолу в культуральній рідині визначали за методом газо-рідинної хроматографії. Концентрацію глюкози визначали за глюкозооксидазним методом (Лукомская, Городецкий, 1961). Концентрацію піровиноградної кислоти (ПВК) в культуральній рідині визначали за методом, описаном у роботі (Sloneker, Orentas, 1962).
Аналіз активності ферментів С2-С6-метаболізму. Визначення активності ферментів здійснювали в безклітинних екстрактах (клітини руйнували ультразвуком, одержаний дезінтеграт центрифугували, супернатант використовували як безклітинний екстракт). Для одержання безклітинних екстрактів використовували клітини з середини експоненційної фази росту.
Активність 6-фосфофруктокінази (КФ 2.7.1.11), 6-фосфоглюконатдегідратази (КФ 4.2.1.12), ФЕП-карбоксилази (КФ 4.1.1.31), піруваткарбоксилази (КФ 6.4.1.1), аконітатгідратази (КФ 4.2.1.3.), ФЕП-синтетази (КФ 2.7.9.1), глюкозодегідрогенази (КФ 1.1.1.118 та КФ 1.1.1.119), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.2.2),  -кетоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2), малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.38 і КФ 1.1.1.37), алкогольдегідрогенази (КФ 1.1.1.1), ацетальдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3 і КФ 1.2.1.4), ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42) визначали за реакцією окиснення/відновлення НАД(Ф)Н+/ НАД(Ф)+, відповідно, при 340 нм. Активність глюкозодегідрогенази (КФ 1.1.99.10) і сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1) визначали за реакцією відновлення дихлорфеноліндофенолу в присутності феназин-метасульфату при 600 нм. Активність ацетил-КоА-синтетази (КФ 6.2.1.1) та ацетаткінази (КФ 2.7.2.1) аналізували по утворенню ацетил-КоА і ацетилфосфату, що утворюють з гідроксиламіном ацетилгідроксамат. Продукт реакції ацетил-гідроксамату з хлорним залізом визначали спектрофотометрично при 540 нм. Активність ізоцитратліази (КФ 4.1.3.1) встановлювали за швидкістю утворення, а малатсинтази (КФ 4.1.3.2) – за швидкістю поглинання фенілгідразону гліоксилату при 324 нм. Активність фумарази (КФ 4.2.1.2) аналізували по утворенню або поглинанню фумарату при 300 нм.
Визначення швидкості окиснення субстратів інтактними клітинами. Швидкість окиснення субстратів інтактними клітинами штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) встановлювали за швидкістю поглинання кисню у реакційній суміші полярографічним методом за допомогою електроду закритого типу на полярографі ППТ-1.
Встановлення складу і фізико-хімічних властивостей етаполану.
Етаполан виділяли з культуральної рідини осадженням ізопропанолом після попереднього відокремлення клітин продуцента та діалізу. Для дезацилювання здійснювали обробку ЕПС NaOH у присутності NaBH4. Вміст вуглеводів в ЕПС встановлювали за методом Dubois (1956), піровиноградної кислоти - за методом Sloneker і Orentas (1962), уронових кислот - за методом Dische (1947), жирних кислот - ваговим методом після дезацилювання розчинів ЕПС (Tako, Nakamura, 1984). Для визначення вмісту мінеральних компонентів у складі етаполану здійснювали його обробку катіонітом КУ-2-8 (Н+). Визначення нейтральних моносахаридів здійснювали на вуглеводному аналізаторі "Biotronik LC-2000". Молекулярно-масовий склад ЕПС визначали за допомогою методу аналітичного градієнтного центрифугування в розчині хлористого натрію (Воцелко, Пирог, 1989). Властивості розчинів етаполану оцінювали за зміненням їх в’язкості в присутності 0,1 М КCl, при рН 4-4,5 (за умови переведення ЕПС в Н+-форму), в системі Cu2+ - гліцин. В’язкість розчинів етаполану вимірювали на скляному капілярному віскозиметрі Оствальда при 20° С.
Визначення антифітовірусної активності препаратів етаполану.
Вплив очищених препаратів етаполану на інфекційність вірусів рослин досліджували, додаючи їх у концентрації 10-1000 мкг/мл до суспензії вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ, штам U1) або Х-вірусу картоплі (місцевий ізолят) та інокулюючи сумішами листя рослин-індикаторів: дурману (Datura stramonium L.) та гомфрени (Gomphrena globosa L.). Здатність ЕПС індукувати у рослин стійкість щодо ВТМ-інфекції вивчали, ін’єкуючи водні розчини полісахариду (100-2000 мкг/мл) в листя надчутливого до цього вірусу сорту тютюну (Nicotiana tabacum L.) Імунний 580, N. sanderae hort або дурману за 2 доби до інокуляції. Ступінь пригнічення вірусної інфекції оцінювали за кількістю локальних некрозів на дослідній і контрольній (обробленій водою) половинках листка.
Статистичну обробку експериментальних даних проводили за Лакіним (1990). Достовірність результатів досліджень оцінювали згідно з t-критерієм Стьюдента при 5%-му рівні значимості.
РОЗДІЛ 4. Особливості С6-метаболізму штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ)
Встановлено, що Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 росте та синтезує ЕПС на широкому наборі вуглеводних субстратів (моно-, ди- та полісахаридах).
Ензимологічні дослідження показали, що катаболізм глюкози у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) здійснюється за шляхом Ембдена-Мєйєргофа-Парнаса (гліколіз, 1,6-фруктозобіфосфатний шлях) та Ентнера-Дудорова (КДФГ-шлях) (табл. 1), про що свідчила висока активність ключових ферментів (6-фосфофруктокінази та 6-фосфоглюконатдегідратази, відповідно). Піруват залучається до метаболізму за участю піруватдегідрогенази. Наявність  -кетоглутаратдегідрогеназної активності свідчить про те, що в клітинах даних бактерій, очевидно, функціонує повний ЦТК. Поповнення пулу інтермедіатів для реакцій конструктивного метаболізму відбувається за участю піруваткарбоксилази (табл. 1).
При культивуванні бактерій на середовищі без пантотенової кислоти, активність піруватдегідрогенази (цей фермент потребує наявності коензиму А) була вдвічі нижчою, ніж у присутності В5. При цьому спостерігалось зниження рН культуральної рідини, обумовлене накопиченням пірувату (40-45 мМ). Таким чином, С6-метаболізм у Acinetobacter sp. лімітований коензимом А.
Дослідження швидкості дихання інтактних клітин Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) показало, що клітини, вирощені на етанолі, окиснювали глюкозу,
Таблиця 1
Активність ключових ферментів С6-метаболізму
штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ), вирощеного на глюкозі (1%)
Примітка: ПХХ- піролохінолінхінон.
а вирощені на глюкозі, були здатні окиснювати також етанол, ацетальдегід та ацетат калію. Активність ключових ферментів метаболізму глюкози при культивуванні бактерій на етанолі та ключових ферментів трансформації етанолу при вирощуванні на глюкозі виявилась досить високою, за винятком активності ізоцитратліази, що, можливо, пов'язано з тим, що індукторами ізоцитратліази є С2-сполуки. Ці результати навели нас на думку, що можна інтенсифікувати синтез ЕПС при внесенні в середовище з глюкозою С2-сполук. Дійсно, за наявності етанолу (0,01%-1%) та ацетату калію (0,02%) у середовищі з глюкозою (1%) активність ізоцитратліази (ферменту, що бере участь у поповненні пулу С4-дикарбонових кислот – попередників глюконеогенезу) збільшувалась в 2 - 15 разів, причому найбільш висока активність цього ферменту відзначена при низьких концентраціях С2-субстратів.
При культивуванні Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на середовищі з глюкозою (1%) внесення етанолу (0,01%-0,5%) призвело до збільшення кількості синтезованих ЕПС та їх виходу по відношенню до біомаси (табл. 2).
Слід зазначити, що при вирощуванні бактерій на суміші етанолу та глюкози не спостерігалося катаболітної репресії, тобто обидва субстрати поглинались одночасно (рис. 1). Крім того, на змішаному субстраті суттєво скорочувався час досягнення максимальної швидкості росту і практично була відсутня лаг-фаза.
Таблиця 2
Утворення екзополісахаридів при рості штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005
на глюкозі у присутності етанолу
Примітка: як посівний матеріал використовували культуру, вирощену на МПА.
Рис. 1. Накопичення біомаси та споживання субстратів при вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на суміші етанолу (0,5%, за об'ємом) і глюкози (0,5%, мас.): 1 – етанол; 2 – глюкоза; 3 – біомаса.
РОЗДІЛ 5. Енергетичні та біохімічні аспекти підвищення синтезу етаполану на суміші ростових субстратів
Раніше було показано, що окиснення етанолу та ацетальдегіду у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) каталізується НАД+- і НАДФ+-залежними ферментами (Пирог и др., 2002); катаболізм глюкози здійснюється за шляхом Ембдена-Мєйєргофа-Парнаса та Ентнера-Дудорова (див. розділ 4). Згідно “енергетичною” класифікацією субстратів Бабеля етанол є енергетично-надлишковим, а глюкоза – енергетично-дефіцитним субстратом. Наступний етап досліджень полягав у визначенні оптимального співвідношення концентрацій двох енергетично-нерівноцінних субстратів. При розрахунку концентрацій етанолу та глюкози нами були прийняті наступні припущення: 1) етанол використовується головним чином як джерело енергії, а на синтез біомаси та ЕПС витрачається вуглець глюкози; 2) 50% глюкози катаболізується за шляхом Ембдена-Мєйєргофа-Парнаса і 50% за шляхом Ентнера-Дудорова; 3) співвідношення Р/О дорівнює 2; 4) ЕПС містить 50% ацильованого полісахариду (АП) та 50% неацильованого полісахариду (НАП); 5) у складі повторюваної ланки АП міститься два залишки жирних кислот – лауринової (С12Н24О2) і пальмітинової (С16Н32О2); 6) НАДФН, що утворюється при катаболізмі етанолу та глюкози, є джерелом відновлювальних еквівалентів, які окиснюються до води через дихальний ланцюг.
На рис. 2. представлена передбачувана схема синтезу повторюваної ланки ацильованого полісахариду у випадку КДФГ-шляху катаболізму глюкози у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005. При утворенні етаполану енергія витрачається на синтез моносахаридів та жирних кислот, а генерується під час синтезу ПВК, глюкуронової кислоти та ацетил-КоА. Енергетичні потреби мікробного синтезу АП і НАП у перерахунку на моль використаної глюкози представлені в табл. 2.
Таким чином, генерація енергії при синтезі ЕПС з глюкози складає 1,42 моль АТФ/моль використаної глюкози (табл. 2).
Cинтез біомаси з ФГК (при використанні амонійного джерела азоту) можна представити у вигляді рівняння (Babel, 1979):
4 ФГК + NH3 + 29 АТФ + 5,5 НАД(Ф)Н → (С4H8O2N1)3, (1)
де (С4H8O2N1)3 – формула моля біомаси.
Сумарні реакції перетворення етанолу та глюкози в ФГК відображаються наступними рівняннями:
2 С2Н5ОН +3 АТФ → ФГК + 6 НАД(Ф)Н + ФАДН2 + СО2 (2)
С6Н12О6 → 2 ФГК + 2 НАД(Ф)Н (гліколіз) (3)
С6Н12О6 + 2 АТФ → 2 ФГК + 2 НАД(Ф)Н (КДФГ-шлях) (4)
З наведених вище рівняннь можна розрахувати, що при рості на глюкозі потреба в АТФ для синтезу біомаси (в розрахунку на моль глюкози) складає 17
Глюкоза
Глюкозо-1-Ф АТФ
УТФ
Фруктозо-6-Ф Глюкозо-6-Ф
↓ НАДФН
ІДФ-Глюкоза ← УДФ-Глюкоза → УДФ-Галактоза Манозо-6-Ф
2 НАД(Ф)Н ↓ Глюконо-δ-лактон-6-Ф
Манозо-1-Ф ↓
ГТФ 6-Фосфоглюконат
УДФ-Глюкуронова кислота ↓
ГДФ-Маноза 2-Кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат
↓ ↓
ГДФ-Рамноза Гліцеральдегід-3-Ф
НАДН
1,3-Діфосфогліцерат
АТФ
3-Фосфогліцерат
↓
Фосфоенолпіруват
АТФ
2 Піруват
НАДН
2 Ацетил-КоА
↓
Цикл Кребса
Рис. 2. Схема синтезу повторюваної ланки ацильованого полісахариду штамом Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 при катаболізмі глюкози за КДФГ-шляхом (сірим кольором виділено літературні дані). Ац – ацильна група.
Таблиця 2
Енергетичні потреби синтезу ацильованого та неацильованого полісахаридів штамом Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 з глюкози
молей. Ми припустили, що ця енергія може бути одержана з етанолу. З огляду на те, що при синтезі ЕПС з глюкози генерується 1,42 моль АТФ/моль використаної глюкози, за рахунок етанолу повинно бути отримано 17-1,42 = 15,58 моль АТФ. З рівняння перетворення етанолу в ФГК виходить, що для одержання такої кількості АТФ необхідно 3,12 моль етанолу. Отже, молярне співвідношення етанолу та глюкози в середовищі повинно складати 3,12:1 (наприклад, при концентрації глюкози в середовищі 1 мас. % концентрація етанолу повинна складати 1 % за об'ємом).
З даних табл. 3 видно, що при культивуванні продуцента на суміші субстратів кількість синтезованих ЕПС була вищою, ніж на моносубстратах. Але тільки при теоретично розрахованому співвідношенні концентрацій цих субстратів спостерігалось суттєве збільшення не тільки кількості синтезованих ЕПС, але й їхньго виходу по відношенню до біомаси та від субстрату.
При вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на суміші етанолу та глюкози відмічали також інтенсифікацію росту бактерій і синтезу ними ЕПС, про що свідчило підвищення рівня біомаси, ЕПС та в'язкості культуральної рідини через 24 год культивування.
Таким чином, у результаті проведених досліджень вперше показана можливість інтенсифікації синтезу мікробних ЕПС в умовах міксотрофного росту продуцента на суміші енергетично-нерівноцінних субстратів.
Таблиця 3
Утворення етаполану при вирощуванні Acinetobacter sp. ІМВ В-7005
на суміші етанолу та глюкози
| 
