Библиотечный каталог авторефератов Украины

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Кургалюк Наталія миколаївна

УДК 577.12:612.014.

Роль Інтермедіатів циклу трикарбонових кислот у процесах енергозабезпечення та антиоксидантного захисту клітин при дії на організм екстремальних факторів

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор 

РИБАЛЬЧЕНКО Володимир Корнійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач відділу цитофізіології

Офіційні опоненти:         доктор біологічних наук, професор

Цудзевич Борис Олександрович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця                                                                                    МОЗ України (м.Київ), професор кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Тугай Василь Андрійович

Інститут біохімії імені О.В.Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України

Захист відбудеться “27” жовтня 2003 р. о 14годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національному університеті Імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м.Київ, пр. Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ -33, вул.Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м.Київ, вул.Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “19” вересня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради __________________________Матишевська О.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення кисень-залежних процесів (окиснювальне фосфорилювання, мікросомне окиснення, перекисне окиснення ліпідів) під впливом негативних чинників (гіпоксія, емоційний стрес, іонізуюче опромінення) є одним з актуальних питань біохімії і фізіології. Зниження інтенсивності синтезу АТФ за цих умов пов’язане з порушеннями функцій дихального ланцюга мітохондрій, зростанням вмісту активних форм кисню та змінами у системі антиоксидантного захисту (Skulachev, 1996; Лукьянова, 2000; Кондрашова, 1985-2000). В основі патологічного процесу вони як єдина функціонально-метаболічною система є модуляторами споживання кисню. У реалізації цього механізму беруть участь чисельні процеси, однак провідне значення належить компонентам циклу трикарбонових кислот (ЦТК) – α-кетоглутарату і сукцинату (Долиба и др., 1997; Бабский и др., 1997). Крім того, було показано, що через α-кетоглутарат (КГЛ) реалізуються ефекти медіатора парасимпатичної нервової системи ацетилхоліну (АХ) (Доліба і ін., 1993), а через сукцинат (СК) – катехоламінів (КА) (Бабский и др., 1997). Тому без детального дослідження механізмів дії негативних чинників довкілля на кисень-залежні процеси організму, що супроводжуються порушеннями функціональної активності клітин і їх органел, мітохондрій (МХ), зокрема, неможливе спрямоване здійснення корекції енергетичного обміну за участю таких метаболітів як КГЛ і СК.

В основі метаболітної корекції інтермедіатами циклу Кребса за умов стресу лежить регуляція функцій і підтримання метаболізму життєво важливих органів та систем (Рибальченко та ін., 2000). У літературі наведені дані про антигіпоксичний (Маевский, 2001) і радіомодифікаційний ефекти СК (Ивницкий, Штурм, 1990). Однак застосування СК у якості антигіпоксичного препарату дає позитивний результат не в усіх випадках, ймовірно, через низьку проникливість його у клітину. На сьогодні активно досліджується можливість використання при ішемії міокарда метаболічних попередників, зокрема КГЛ. З’ясовано, що з ЦТК функціонально пов’язаний цикл оксиду азоту (NO) (Реутов и др., 1998). NO попереджує розвиток порушень електронтранспортного ланцюга МХ (Brown, 1992-1999; Giulivi, 1998) та має широкий спектр регуляторних впливів в організмі ссавців (Moncada et al., 1991; Сагач, Ткаченко, 1995; Brown, 1995; Малышев, Манухина, 1998; Ванин, 2001; Шевчук, Рибальченко, 2001; Ignarro et al., 2001). Стає зрозумілим, що вивчення основних кисень-залежних процесів організму за умов дії інтермедіатів циклу трикарбонових кислот та метаболічного попередника оксиду азоту L-аргініну є важливим для з’ясування та оцінки розвитку адаптаційних реакцій і має фундаментальне значення для біології та прикладне – для медицини і ветеринарії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана як частина комплексних НДР Львівського національного університету імені Івана Франка: “Нейрогормональні механізми адаптації клітинної енергетики при дії на організм шкідливих факторів довкілля” № держреєстрації 0196U017377 (1994-1996); “Дослідження впливу α-кетоглутарату на енергетичні процеси в міокарді і скелетних м’язах при їх функціональному перенапруженні” № держреєстрації 0195U015518 (1995-1997); “Дослідження адаптогенного впливу на організм субстратів циклу Кребса для підвищення його резистентності до хронічної дії малими дозами іонізуючої радіації” № держреєстрації 0197U018118 (1997-1999); “Кальцієвий гомеостаз і енеpгетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів” (№ держреєстрації 0100U0011452) (2000-2002). Окремий розділ роботи виконувався у відділі по вивченню гіпоксичних станів Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України згідно теми “Роль перебудови структурно-функціональних взаємовідносин у газотранспортних системах організму в розвитку гіпоксичних станів при екзо- та ендогенних впливах (2001-2004) за № держреєстрації № 0101U002633. Фрагменти дисертаційної роботи виконувалися у рамках грантів для підтримки молодих вчених Західно-Українським Біомедичним дослідницьким центром (Україна-США): “Modulation of resistance to chronic action of low doses by means of α-ketoglutarate” (1998-1999), “The influence of L-arginine on mitochondrial respitation and antioxidant enzyme activities under ionizing radiation” (2000-2001).

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення механізмів участі сукцинату і α-кетоглутарату у реалізації кисень-залежних процесів за умов гіпоксії, емоційного стресу, іонізуючого опромінення та у взаємозв’язку із системою оксиду азоту і різною резистентністю тварин до гіпоксії.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

Дослідити продукцію оксиду азоту за умов гострої гіпоксії під впливом екзогенних інтермедіатів циклу Кребса сукцинату і α-кетоглутарату натрію на процеси окиснювального фосфорилювання, мікросомного окиснення, перекисного окиснення ліпідів, системи антиоксидантного захисту.

З’ясувати дозо-часові ефекти впливу екзогенного L-аргініну та інгібітора синтази оксиду азоту Nщ-нітро-L-аргініну на функціонування мітохондрій печінки щурів, інтенсивність процесів ліпопероксидації та стан системи антиоксидантного захисту.

Дослідити механізми коригуючої дії L-аргініну та інгібітора синтази оксиду азоту Nщ-нітро-L-аргініну на функціональний стан мітохондрій печінки щурів, їх кальцієву ємність, вміст катехоламінів, інтенсивність процесів ліпопероксидації та стан системи антиоксидантного захисту за умов емоційного стресу залежно від резистентності до гіпоксії.

Охарактеризувати показники мітохондріального енергозабезпечення, стан системи антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів ліпопероксидації та вміст медіаторних речовин за умов гострої гіпоксії й дії екзогенного L-аргініну у щурів і мурчаків.

Вивчити вплив α-кетоглутарату натрію і L-аргініну на показники динамічної витривалості до фізичного навантаження у щурів із різною резистентністю до гіпоксії.

На основі отриманих даних (щодо модифікуючої дії L-аргініну за умов гострої гіпоксії на систему оксиду азоту) з’ясувати механізм коригувальної дії адаптації до гіпоксії в інтервальному режимі, екзогенного L-аргініну та Nщ-нітро-L-аргініну на кисень-залежні процеси мітохондріального енергозабезпечення у щурів і мурчаків.

Дослідити функціонування мітохондрій печінки, інтенсивність процесів ліпопероксидації, стан системи антиоксидантного захисту і показники периферичної крові щурів за умов рентгенівського опромінення у низьких дозах, введення α-кетоглутарату натрію, L-аргініну і Nщ-нітро-L-аргініну.

Об’єкт дослідження: процеси АДФ-стимульованого дихання у мітохондріях печінки і міокарда щурів і мурчаків, мікросомного окиснення, перекисного окиснення ліпідів та активність ферментів системи антиоксидантного захисту.

Предмет дослідження: механізми регуляції за участю сукцинату, α-кетоглутарату та L-аргініну кисень-залежних процесів у мітохондріях печінки і міокарда у щурів лінії Вістар і мурчаків.

Методи дослідження: біохімічні, фізико-хімічні (полярографічний, потенціометричний, спектрофлуориметричні) і статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено системне дослідження дії основних інтермедіатів ЦТК СК і α-кетоглутарової кислот на метаболізм оксиду азоту у крові і тканинах щурів за умов гострої гіпоксії. Встановлено більш виражений вплив α-кетоглутарату порівняно з сукцинатом на вміст нітрит-аніона у печінці за умов гострої гіпоксії. Зниження інтенсивності процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) за цих умов є важливим чинником протекторного ефекту α-кетоглутарату натрію. Встановлено важливу роль NO у регуляції кисень-залежних процесів у клітині при гострій гіпоксії, яка полягає у підвищенні ефективності і спряженості енергетичних реакцій функціонування МХ.

Встановлено зв’язок між процесами енергозабезпечення, інтенсивності ліпопероксидації, активності ферментів антиоксидантного захисту та продукції NO у мітохондріях. Отримані результати засвідчують модифікацію процесів акумуляції кальцію  та енергозабезпечення під впливом екзогенних регуляторів L-аргініну та інгібітора NO-синтази L-NNA. Встановлено, що активація синтезу NO підвищує адаптаційний потенціал організмів з низькою резистентністю до гіпоксії, у тварин з високою резистентністю корекція процесів енергозабезпечення за умов стресу здійснюється під впливом інгібітора NO-синтази. Виявлено, що спрямований вплив на активацію системи NO може виявитися перспективним засобом профілактики гіпоксичних станів і обов’язково повинен враховувати індивідуальний стан фізіологічної реактивності. Це стосується організмів з переважанням холінергічних механізмів регуляції, яким вже притаманний потенціал адаптаційних можливостей – щурі з високою резистентністю до гіпоксії та мурчаки.

Показано, що вплив КГЛ і L-аргініну викликає зростання динамічної витривалості до фізичного навантаження у щурів з високою і низькою резистентністю до дії гіпоксичного чинника. Про взаємообумовленість цих процесів засвідчує нівелювання ефектів L-аргініну та КГЛ під впливом інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA. Посилення холінергічної ланки регуляції при введенні КГЛ, що опосередковує свої ефекти через NO, можна розглядати як природний механізм посилення відновних процесів, що спрямований на обмеження дії шкідливих чинників (гіпоксії, емоційного стресу, іонізуючого опромінення) та значних концентрацій КА, що інтенсифікують процеси ПОЛ при стресі.

З’ясовано, що рівень активації мітохондріального окиснення, викликаного гострою гіпоксією, знижується у тварин після проведеного курсу адаптації. Інтервальна гіпоксія (ІГ), гальмуючи процеси ПОЛ у тканинах та крові під впливом гострої гіпоксії, обумовлює підвищення ефективності енергетичних реакцій МХ печінки і міокарда та опосередковується зростанням ролі NO у формуванні механізмів адаптації. ІГ супроводжується посиленням холінергічних регуляторних впливів та обмеженням інтенсивності процесів ліпопероксидації.

Показано, що ефекти екзогенного КГЛ та інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA у ранні терміни після іонізуючого опромінення пов’язані із зростанням ефективності окиснення КГЛ у реакціях переамінування, зниженням інтенсивності процесів ліпопероксидації на фоні активації системи антиоксидантного захисту (АОЗ).

Практичне значення одержаних результатів. Одержані експериментальні дані поглиблюють знання про біохімічні механізми впливу інтермедіатів циклу Кребса і оксиду азоту на функціонування кисень-залежних процесів організму. Вони розширюють базу даних, необхідних для розробки як нефармакологічних, так і фармакологічних методів підвищення стійкості організму до негативних проявів гіпоксії, стресу та малих доз іонізуючого опромінення. Результати цих досліджень використовуються у загальних курсах з біохімії та фізіології людини і тварин, спецкурсах з екологічної фізіології та фізіології екстремальних станів, які читаються у Львівському національному університеті імені Івана Франка. Результати досліджень мають значення для кращого розуміння причин і біохімічних закономірностей розвитку патологічних станів травних залоз і міокарда та розробки методів їх фармакологічної корекції, а отже, є важливими для біології, медицини, ветеринарії та екології. Вони можуть бути використані для підготовки спеціалістів у вищих учбових закладах медико-біологічного профілю.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні обсягу експериментальної частини дисертації, плануванні, статистичній обробці результатів, підборі і опрацюванні даних літератури, а також в аналізі і інтерпретації одержаних результатів, оформленні наукових публікацій. Деякі експерименти було виконано у відділі по вивченню гіпоксичних станів Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України спільно з Т.В.Серебровською. Окремі експериментальні роботи виконувались за участю співавторів публікацій, які були співвиконавцями науково-дослідних тем.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації та основні положення були представлені на: 9-й Європейській біоенергетичній конференції (1996), 17-й Міжнародній конференції з біохімії і молекулярної біології (Сан-Франциско, 1997), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), 3-му з’їзді з радіаційних досліджень (Москва, 1997), Міжнародній конференції “Гіпоксія: деструктивна та конструктивна дія” (Київ, 1998), 6-му Міжнародному симпозіумі з біологічно активних сполук (Париж, 2000), Третій Парнасівській конференції (Львів, 2000), ІІІ Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одеса, 2000), II Міжнародній науковій конференції “Амінокислоти і їх похідні у біології і медицині” (Гродно, 2001), Всеукраїнській наукової конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001), конференції до 100-річчя з дня народження І.Буланкіна (Харків, 2001), IV Міжнародній конференції “Гіпоксія в медицині” (Женева, 2001), ХIV з’їзді фізіологів України (Вінниця, 2002), 4-й Парнасівській конференції (Вроцлав, 2002), Міжнародній конференції “Астроеко – 2002” (Терскол, Росія, 2002), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), Міжнародній конференції, присвяченій пам’яті проф. І.В. Шостаковської (Львів, 2002), ІІІ Міжнародній конференції “Гіпоксія: механізми, адаптація, корекція” (Москва, 2002), щорічних наукових конференціях Львівського національного університету (1996-2003).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені у 48 публікаціях, у тому числі 29 статтях (з них – 13 одноосібних), які опубліковані у наукових фахових виданнях, та у 19 тезах доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису об’єкта і методів досліджень, викладу отриманих результатів, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел (434 назви). Робота викладена на 282 сторінках основного тексту, містить 53 таблиці, 39 рисунків.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проводили на МХ печінки і міокарда, мікросомах печінки та крові щурів-самців лінії Вістар (n=6-8) і самців-мурчаків (n=6).

Окремі серії досліджень проведені на щурах з високою (ВР) і низькою (НР) резистентністю до гіпоксії, поділених за методом В.Я. Березовського (1975) враховуючи час їхнього перебування на “висоті” 12 000 м (“підйом” у барокамері) до появи другого агонального вдиху або судом. Після поділу тварин використовували у дослідженнях не раніше ніж за 14 діб адаптації. Цим тваринам вводили внутрішньоочеревинно у кількості 1 мл: фізіологічний розчин, L-аргінін (600 мг/кг) або інгібітор синтази оксиду азоту Nщ-нітро-L-аргінін (35 мг/кг). Час дії препаратів складав 30 хв, після чого тварин декапітували під ефірним наркозом.

Для дослідження впливу гострої гіпоксії тварин на 30 хвилин поміщали в обладнану камеру, яку вентилювали газовою сумішшю з 7% кисню в азоті. Як дослідні використовували групи щурів, яким вводили: 1 мл фізіологічного розчину, сукцинат (50 мг/кг), α-кетоглутарат (200 мг/кг), L-аргінін (600 мг/кг), інгібітор синтази оксиду азоту Nω-нітро-L-аргінін (35 мг/кг) перед кожним сеансом гострої гіпоксії. Час дії препаратів становив 30 хв.

Окрема серія досліджень проведена на тваринах з різною резистентністю до гіпоксії за умов емоційного стресу. Для цього щурів поміщали на 30 хв у закриту сіткою клітку, де відстань від води до сітки становила 5 см (Бондаренко и др., 1999). Перед дослідом кожній групі вводили у кількості 1 мл L-аргінін (600 мг/кг) або L-NNA (35 мг/кг). Інші групи тварин використовували у дослід після курсу 14-денної ІГ. Кожного дня тварин поміщали у камеру, яку почергово вентилювали газовою сумішшю з 10 % кисню в азоті (15 хв) та кімнатним повітрям (15 хв). Кількість таких циклів становила 5 на день. Щоденно за 30 хв до гіпоксичного тренування цим щурам парентерально вводили: 1 мл фізіологічного розчину, L-аргініну (600 мг/кг) або інгібітора синтази оксиду азоту Nω-нітро-L-аргініну L-NNA (35 мг/кг). На наступний день після останнього тренування тварин піддавали гострій гіпоксії (7% кисню в азоті, 30 хв), після чого декапітували під ефірним наркозом. Вивчали показники функціонування МХ у щурів з ІГ після припинення адаптації на 30, 60 і 180 доби.

Для з’ясовування ролі холіно- і адренорецепторів у реалізації ефектів екзогенних інтермедіатів циклу Кребса, L-аргініну, L-NNA за умов гострої гіпоксії, ІГ та наступного тестуючого подразнення гострою гіпоксією за 30 хв до ін’єкції основного препарату вводили блокатори адренорецепторів фентоламін (2 мг/кг) і обзидан (2 мг/кг), блокатори холінорецепторів атропін (5 мг/кг) і бензогексоній (10 мг/кг). Час дії блокаторів рецепторних структур складав 30 хв.

Окрему серію досліджень проводили з метою з’ясування показників динамічної витривалості до фізичного навантаження під впливом КГЛ, L-аргініну і інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA. Динамічну витривалість оцінювали за часом плавання щурів у воді при 37°С до знемоги, про яку свідчило 5-секундне перебування тварин під водою (Дардымов, 1985). Також вивчали дію α-кетоглутарату за умов посилення динамічного навантаження, коли тваринам додатково під’єднували вантаж (7% від маси тіла тварин). Тваринам як з ВР, так і з НР вводили внутрішньоочеревинно КГЛ, L-аргінін або L-NNA за 30 хв до досліджуваного впливу. Декапітацію тварин проводили одразу після плавання.

З метою дослідження радіомодифікаційних ефектів екзогенних КГЛ, L-аргініну або L-NNA тварин щоденно в однакові години доби піддавали рентгенівському опроміненню у дозі 0,259 мКл/кг на апараті РУМ-17 до досягнення сумарних доз 2,59 (10 діб), 5,18 (20 діб) та 7,77 (30 діб) мКл/кг. Умови опромінення: напруга – 110 кВ; сила струму – 4 мА, фільтр Сu 0,5 + Al 1, віддаль від джерела опромінення – 0,4 –2 м залежно від умов експерименту, потужність дози – 0,0518 мКл/кг/хв, час опромінення – 5 хв. При введенні 1 мл КГЛ, L-аргініну або L-NNA і досягненні вказаних сумарних доз проводилась декапітація тварин у кожній конкретній серії досліджень одразу після опромінення. Дію L-аргініну або L-NNA досліджували також після щоденного фракційного рентгенівського опромінення на 30 хв після введення препаратів. Отже, тварини, які досягли сумарної дози опромінення 2,59 мКл/кг, отримали 2 г/кг, 5,18 мКл/кг – 4 г/кг, 7,77 мКл/кг – 6 г/кг КГЛ відповідно. Доза L-аргініну впродовж 10 діб опромінення (доза 2,59 мКл/кг) становила: 6 г/кг маси щурів, 5,18 мКл/кг –12 г/кг маси, а 7,77 мКл/кг – 18 г/кг відповідно. Для контролю інтактним щурам і опроміненим тваринам кожної підгрупи вводили фізрозчин.

Загальний аналіз крові проводили через добу після останнього введення КГЛ і L-аргініну або L-NNA. Кров із хвостової вени брали під ефірним наркозом. Після проведення аналізу крові, який включав дослідження кількості лейкоцитів, еритроцитів, лейкоцитарної формули, концентрації гемоглобіну та визначення кольорового показника, тварин декапітували, щоб зібрати кров для отримання відмитих еритроцитів. Підрахунок лейкограми проводили у фіксованих мазках крові, які фарбували за методом Д.Л.Романовського у модифікації Крюкова-Папенгейма (1975). Стійкість еритроцитів до гемолізу вивчали методом І.Терскова та І.Гітельзона (1957).

Виділення мітохондрій із печінки і міокарда щурів й мурчаків проводили за допомогою методу диференційного центрифугування за схемою досліду, що дозволяє зберігати нативність ізольованих органел (Kondrashova et al., 2001). Середовище гомогенізації містило для печінки (в ммоль): KCl – 120, HEPES – 10, EGTA – 1, pH 7,2. Концентрацію білка вимірювали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Середовище для виділення  МХ міокарда містило (в ммоль): KCl – 180, 0,5% бичачий сироватковий альбумін, HEPES – 10, EGTA – 10, pH 7,2 (Lass et al., 1997). Дихання і окиснювальне фосфорилювання (ОФ) у МХ вивчали полярографічним методом (Chance, Williams, 1955) з використанням закритого електроду Кларка і полярографa LР-7. Середовище інкубації містило (в ммоль): тріс-HCl – 30, KCl – 125, NaCl – 10, KH2PO4 – 5, MgCl2 – 1,5, EGTA – 3, pH 7,2 (Borutaite, Brown, 1996). Субстратами окиснення слугували: 0,35 мМ сукцинат натрію, 1 мМ α-кетоглутарат натрію, 3 мМ глутамат, 3 мМ піруват, 2,5 мМ малат. Проведений інгібіторний аналіз включав: інгібітор мітохондріального ферментного комплексу (МФК І) – ротенон (10 мкМ), сукцинатдегідрогенази – малонат (2 мМ), цитохромоксидази – азид натрію (50 мкМ), процесів переамінування – амінооксиацетат (1 мМ). АДФ додавали до кінцевої концентрації 200 мкМ. За отриманими полярограмами розраховували: стан відносного спокою (V2), швидкість фосфорилюючого (у метаболічному стані 3 за Чансом, V3) та контрольованого (в метаболічному стані 4, V4) дихання МХ, дихальний контроль за Чансом (V3/V4), коефіцієнт ефективності фосфорилювання АДФ/О та швидкість фосфорилювання (Chance, Williams, 1956).

рН-метричне дослідження функціонування мітохондрій печінки здійснювали за допомогою рН-метричної установки, складеної на базі водневого електроду ЭСЛ-43-07, універсального іономіра ЭВ-74, самозаписувача КСП-4, магнітної мішалки для розмішування суспензії та скляної термостатованої відкритої комірки об’ємом 2 мл. Середовище інкубації містило (ммоль): KCl – 120, KH2PO4 – 2, HEPES – 10, pH 7,2. У середовище вносили 4-5 мг мітохондріального білка. Відповідно до умов інкубації додатково вносили СК (0,35 мМ), КГЛ (1 мМ), піруват (3 мМ), глутамат (3 мМ), малат (2,5 мМ) і малонат (2 мМ). Температура інкубації становила 260С. Кількість протонів, які виділялись МХ, розраховували із урахуванням буферної ємності середовища інкубації шляхом його титрування 0,01 М НCl. При визначенні кальцієвої ємності МХ на основі рН-метричних записів у їх суспензію послідовно вносили CaCl2 (по 100 нмоль). Величину кальцієвої ємності (нмоль Са/мг білка) реєстрували після настання швидкого виходу Са2+ з МХ у середовище інкубації, яке супроводжується його залужненням. Показник кальцієвої ємності МХ визначали у нмоль Са2+/мг білка. В основу розрахунку виходу протонів з МХ печінки була покладена стехіометрія 1Н+/1 Са2+(Nicholls, Akerman, 1982).

Дослідження активності функціонування мікросомної фракції печінки проводили шляхом оцінки активності амінопіридиндеметилази (КФ 1.6.2.4), яку визначали за модифікованим методом (Карузина, Арчаков, 1977), заснованому на вимірюванні утвореного в результаті реакції формальдегіду з реактивом Наша. Інкубаційне середовище містило: НАДФН2 (3 мМ), тріс-буфер (0,25 М), амінопірин (8 мМ) і MgCl2 (5 мМ). Активність ензиму виражали в нмолях утвореного формальдегіду за хвилину на мг білка.

Визначення концентрації метаболітів та активності ферментів. Активність ферментів АОЗ проводилось з використанням наступних методів: супероксиддисмутази (СОД, КФ 1.15.1.1) у реакції з кверцетином (Костюк и др., 1990), каталази (КАТ, КФ 1.11.1.6) у реакції з молібдатом амонію за Королюк и др. (1988), глутатіонредуктази (ГР, КФ 1.6.4.2) у реакції відновлення окисненого глутатіону за зниженням вмісту НАДФН2 (Путилина, 1982), глутатіонпероксидази (ГП, КФ 1.11.1.9) у реакції з реактивом Елмана згідно (Моин и др., 1986), церулоплазміну (ЦП, КФ 1.16.3.1) у кольоровій реакції з пара-фенілендіаміном за Колбом і Камишніковим (1982). Стан системи ПОЛ оцінювали за вмістом продуктів, які реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактивних продуктів)у крові, за допомогою методу (Гаврилова и др., 1987) та тканинах – методу (Тимирбулатов, Селезнев, 1986), кон’югації ненасичених жирних кислот за методом Стальної (1977).

Концентрацію стабільного метаболіту оксиду азоту нітрит-аніона (NO2-) у крові (плазма, еритроцити) та печінці вимірювали за допомогою реактиву Грісса, використовуючи метод Гріна (Green et al., 1982). Вміст NO3- визначали у реакції з бруциновим реактивом (Bank, Aynedjian, 1993), карбаміду – зa реакцією з диметилмонооксимом (Колб, Калашникова, 1982), а вміст поліамінів визначали за кількістю путресцину, використовуючи 2,4-динітрофторбензол (Сятин, Березов, 1980). Концентрацію білка вимірювали за допомогою методу Bradford (1976).

Активність аланін- (АлАТ, КФ 2.6.1.2) і аспартатамінотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1) визначали за методикою Осадчої (1982) у реакції з 2,4-динітрофенілгідразином, сукцинатдегідрогенази (СДГ, КФ 1.3.99.1) – за методом (Ещенко, Вольский, 1982) у реакції відновлення ферриціаніду. Загальну холінестеразну активність (ХЕ, КФ 3.1.1.8) та концентрацію ацетилхоліну визначали за методом (Меньшиков, 1987), адреналіну та попередників катехоламінів – методом (Осинська, 1957; Jacobowich, Richardson, 1979). Для визначення співвідношення лактат/піруват у крові використали метод Герасимова і Плаксіної (2000).

Використовували реактиви виробництва “Союзреактив” класифікації х.ч., а також АДФ, сукцинат, α-кетоглутарат, піруват, глутамат, малат, амінооксиацетат, ротенон, L-аргінін, Nщ-нітро-L-аргінін, кверцетин, глутатіон окиснений, глутатіон відновлений, тріс, НЕРЕS, EGTA фірми “Sigma” (США).

Варіаційно-статистичну обробку одержаних результатів проводили за Стьюдентом. Дисперсійний та кореляційний аналіз отриманих результатів здійснювали з використанням пакету програм “Statgraf”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ та їх обговорення

1. Вплив інтермедіатів ЦТК на показники функціонального стану мітохондрій, систему оксиду азоту та інтенсивність процесів ліпопероксидації за умов гострої гіпоксії. Відомо, що функціонування ЦТК пов’язане з карбамідом і NO, який синтезується з L-аргініну (Block et al., 1995; Boucher et al., 1999). Саме співвідношення цих шляхів метаболічних перетворень значною мірою залежить від гіпоксії й здатності системи до біосинтезу NO (Su, Block, 1995), який за умов зниженого вмісту кисню може виконувати регуляторну роль акцептора електронів у дихальному ланцюгу МХ, тим самим підтримуючи функціональну здатність останніх (Реутов и др., 1998). Гостра гіпоксія (7% кисню в азоті, 30 хв) супроводжувалася зниженням вмісту його стабільного метаболіту нітрит-аніона на 34% (P<0,05) і нітрат-аніона на 70% (P<0,01). Вірогідного зниження зазнавали також вміст карбаміду і поліамінів. Таким чином, різке зменшення вмісту кисню у вдихуваному повітрі, що супроводжується вираженими ознаками тканинної гіпоксії (Маньковская и др,. 1985; Середенко и др., 1992), вірогідно знижує продукцію NO у печінці. Але при цьому зростає співвідношення NO2-/NO2-+NO3- (рис.1). Парентеральні ефекти СК за умов гострої гіпоксії cупроводжувалися зростанням вмісту нітрит-аніона у крові і печінці. Відсоток зростання під впливом КГЛ (371%, P<0,01) концентрації нітрит-аніона у печінці був значно вищим порівняно з введенням СК (281%, P<0,01).

Функціонування МХ за умов гострої гіпоксії обумовлене помітним зростанням показників АДФ-стимульованого дихання при використанні як субстрату окиснення СК порівняно з КГЛ. Ефекти СК за умов гострої гіпоксії пов’язуються із активацією дихання у стані V3, підвищенням ефективності фосфорилювання на 31,4% (P<0,01) та швидкості фосфорилювання АДФ при окисненні СК. За цих умов окиснення КГЛ супроводжувалося вірогідним зниженням значення АДФ/О порівняно із величинами при гострій гіпоксії. Вплив екзогенного КГЛ за умов гострої гіпоксії пов’язаний із зниженням ефектів окиснення СК, зростанням дихального коефіцієнта за Чансом і АДФ/О. Окиснення ендогенного КГЛ супроводжувалося зниженням дихання у стані V3, ефективності процесу фосфорилювання та його швидкості. Зазначені зміни відбувалися при збереженні високого значення спряженості дихання і фосфорилювання, яке становило 46% (P<0,01) від показників при гіпоксії (рис. 2).

Таким чином, різноскеровані зміни окиснення двох зазначених субстратів ЦТК окреслені реципрокними механізмами їх впливу: введення СК за умов гострої гіпоксії знижує ефекти окиснення КГЛ, а вплив останнього, у свою чергу, обмежує ефекти СК на процеси мітохондріального енергозабезпечення. Досліджено, що КГЛ обумовлював зростання продукції оксиду азоту, що може виступати важливим лімітуючим чинником інтенсифікації реакцій ПОЛ і викликаної цим надмірної активації СДГ. Це опосередковується підвищенням ролі аланін- (АлАТ) і аспартатамінотрансфераз (АсАТ).

Показано, що введення КГЛ при гіпоксії призводить до вірогідного зростання активності ферментів системи АОЗ, зокрема, СОД, КАТ, концентрації ЦП. СК призводить до зростання активності СОД у більшій мірі ніж КГЛ і виявляє захисну роль на першому рівні АОЗ, посилюючи оксидазні властивості крові, оцінювані за зростанням концентрації ЦП. Для КГЛ досліджено вищий ефект дії на активність КАТ. Зазначені зміни супроводжуються також вірогідним зниженням вмісту дієнових кон’югатів та ТБК-реактивних продуктів у крові та печінці (рис. 3).

Зміни співвідношення медіаторних речовин у крові щурів за умов гострої гіпоксії і впливу СК і КГЛ засвідчують помітне збільшення вмісту катехоламінів (КА), АХ (на 135%, Р<0,01) з вірогідним збільшенням активності фермента його інактивації. Так, введення КГЛ супроводжується посиленням холінергічних регуляторних впливів, пов’язаних із вірогідним збільшенням у крові вмісту АХ на фоні зниження холінестеразної активності. Це засвідчує посилення адаптаційних механізмів при дії гіпоксичного чинника (Доліба та ін., 1996). Ефекти КГЛ за умов гострої гіпоксії пов’язані із зниженням вмісту КА та попередників їх біосинтезу: адреналіну (АД) – на 30% (P<0,05), норадреналіну (НА) – на 34% (P<0,05) і дофаміну (ДА) – на 68% (P<0,001) порівняно з гострою гіпоксією. Під впливом СК за цих умов досліджено вірогідне зниження вмісту лише АД (на 44%, P<0,01) та ДА (на 53%, P<0,001). Отже, ефекти КГЛ за умов гострої гіпоксії пов’язані з роллю холінергічних механізмів регуляції і опосередковуються оксидом азоту. Посилення за умов гіпоксії ролі КГЛ у регуляції основних кисень-залежних процесів справляє стабілізуючий вплив на функціональний стан клітин.

2. Дозо-часова залежність впливу екзогенного L-аргініну та інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA на мітохондріальне енергозабезпечення та інтенсивність процесів ліпопероксидації у щурів. Показано, що парентеральне введення L-аргініну викликало зростання у печінці вмісту нітрит-аніона. Якщо у контролі концентрація нітрит-аніона становила 241,1±31,8 пмоль/мг білка, то під впливом L-аргініну у дозі 600 мг/кг впродовж 30 хв вона зросла до величини 351,0±31,3 пмоль/мг білка (P<0,05), що узгоджується з даними (Ванин и др., 1991).

Досліджено, що вплив екзогенного L-аргініну залежить від його дози. Отримані нами зміни можуть бути зворотними за умов парентерального введення препарату у дозі 450-600 мг/кг впродовж 30 хв. Зі збільшенням дози до 750 мг/кг зниження ефективності АДФ-стимульованого дихання за умов окиснення СК і глутамату з малатом стає найнижчим і незворотним на фоні зниження інтенсивності процесів ПОЛ (рис. 4). Таким чином, зниження вмісту ТБК-реактивних продуктів під впливом екзогенного L-аргініну засвідчує про значні антиоксидантні властивості продукованого під впливом NO-синтаз оксиду азоту, локалізованих у внутрішній мітохондріальній мембрані (Giulivi et al., 1998).

L-аргінін і L-NNA вводили іn vitro в інкубаційне середовище з МХ, що споживали кисень, до досягнення їх кінцевої концентрації 1, 10, 50, 100 мкМ при окисненні СК і КГЛ. Показано, що із зростанням дози екзогенного L-аргініну (з концентрації 10⋅мкМ) величина АДФ-стимульованого дихання МХ вірогідно знижувалася на фоні обмеження ефективності процесів окиснювального фосфорилювання (АДФ/О). Так, за умов окиснення СК під впливом 10 мкМ L-NNA досліджено вірогідне (P<0,01) зниження поглинання кисню у стані V3 на фоні обмеження ефективності процесів ОФ. За умов окиснення КГЛ вірогідні зміни поглинання кисню отримали лише у дозі 100 мкМ екзогенного L-NNA, що супроводжується також зниженням величини АДФ/О.

Це може відігравати важливу роль у модуляції ефектів дихання МХ при корекції шляхів надходження субстратів у дихальний ланцюг МХ, оскільки одні інгібуються у більшій мірі екзогенним L-аргініном, а інші – під впливом L-NNA (рис. 5). За цих умов досліджували також активність основних ферментів системи антиоксидантного захисту – СОД, КАТ і вміст ТБК-реактивних продуктів впродовж 15, 30 і 45 хвилин інкубації (37°С).

Інгібітор синтази оксиду азоту L-NNA у наростаючих концентраціях пригнічує активність ферментів АОЗ та інтенсифікує процеси ліпопероксидації, що, ймовірно, спричиняє порушення процесів енергозабезпечення при оксидативних стресах. Отже, спрямований вплив на генерацію оксиду азоту з метою модифікації процесів функціонування МХ може використовуватися з метою фармакологічної корекції станів, що супроводжуються генерацією активних форм кисню.

3. Зміни функціонального стану мітохондрій печінки щурів з різною резистентністю до гіпоксії під впливом L-аргініну та інгібітора синтази оксиду азоту Nщ-нітро-L-аргініну. Дослідження ефектів екзогенного L-аргініну у МХ печінки тварин з низькою (НР) і високою (ВР) резистентністю до гіпоксії засвідчило у контролі вищі величини функціонування цих органел за умов використання основних субстратів окиснення, системи АОЗ й ПОЛ, їхньої кальцієвої ємності. Ефекти впливу L-аргініну пов’язані зі зниженням поглинання кисню МХ при підтриманні величини дихального контролю, що свідчить про збереження їх функціональних властивостей, а зниження величини АДФ/О – про інгібуючий ефект оксиду азоту на цитохромоксидазу (ЦО). Показано, що інгібітор синтази оксиду азоту L-NNA за цих умов перешкоджає впливу екзогенного L-аргініну, підвищуюючи спряженість процесів дихання і фосфорилювання, АДФ/О та швидкість фосфорилювання до величин у контрольних щурів. У тварин з ВР продукований під впливом L-аргініну оксид азоту (Ванин и др., 1991) справляє інгібуючий вплив не тільки через ділянку дихального ланцюга МХ, пов’язану з ЦО, але й через модуляцію окиснення НАД- і ФАД-залежних субстратів. Відомо, що співвідношення НАДН- і сукцинатоксидазного шляхів дихального ланцюга МХ значною мірою може змінюватися за умов дії екстремальних навантажень і використовуватися як механізм регуляції активності СДГ (Лукьянова и др., 1985). Таким чином, основні показники функціонування МХ опосередковуються роллю NO-залежних механізмів та визначаються резистентністю організмів до гіпоксії.

Враховуючи той факт, що окиснення СК відбувається більш інтенсивно порівняно з іншими субстратами ЦТК, його наявність змінює характер реакцій і “маскує” вплив оксиду азоту на окиснення КГЛ (Кондрашова, 1989). Тому для оцінки “чистого” окиснення КГЛ проведено дослідження з інгібітором СДГ малонатом. Показано, що під впливом L-аргініну зміни функціонального стану МХ для щурів з ВР полягали у наступному: зростала спряженість процесів дихання і фосфорилювання (V3/V4) на 61,9% (P<0,01) та швидкість фосфорилювання на 42,4% (P<0,05). Вірогідне зниження швидкості фосфорилювання на 38,9% (P<0,05) встановлене для тварин з НР. Таким чином, за умов введення L-аргініну досліджена переважна активація окиснення КГЛ з малонатом для групи тварин з ВР, які є генетично детермінованими особинами з високим холінергічним статусом (Шостаковская и др., 1986; Маркова і ін., 1993). Раніше показано, що переважне окиснення КГЛ за умов активації холінергічної ланки регуляції справляє також і виражений холіноміметичний ефект (Долиба и др., 1997). Відомо, що NO може опосередковувати ефекти за участю холінорецепторів та АХ (Данилович, Тугай, 2001), які на рівні організму функціонально визначають високу резистентність до дії гіпоксичного та інших несприятливих чинників середовища (Дорофеев и др., 1978). Отже, L-аргінін можна використовувати як засіб корекції для особин з НР.

Утворення оксиду азоту в NO-синтазних реакціях пов’язане з роллю катіонів кальцію (Okada et al., 1996) і залежить від змін концентрацій енергетичних субстратів (КГЛ, піруват, глутамат – група НАД-залежних, і СК – ФАД-залежні). Різні шляхи надходження відновних еквівалентів до дихального ланцюга МХ визначають чутливість до гіпоксичного фактора і обумовлюють резистентність до різноманітних шкідливих чинників довкілля (Саакян и др., 2001). Зокрема, це стосується процесів транспорту катіонів кальцію під впливом L-аргініну або L-NNA на стан кальцієвої ємності МХ печінки щурів з ВР і НР за умов використання субстратів енергетичного обміну СК, КГЛ, КГЛ з малонатом, і суміші субстратів, які забезпечують переамінування глутамату з малатом та глутамату з піруватом. Основні ефекти впливу екзогенного L-аргініну та СК і КГЛ пов’язані з вірогідним підвищенням кальцієвої ємності МХ печінки щурів з НР до вихідного рівня в особин з ВР.

4. Корекція екзогенним L-аргініном стресових ушкоджень процесів функціонування мітохондрій, вмісту катехоламінів та інтенсивності процесів ліпопероксидації у щурів з різною резистентністю до гіпоксії. Вибраний нами метод стресу тварин засвідчив порушення системи біосинтезу КА, що супроводжується зростанням вмісту передусім АД (на 54%, P<0,05). Вплив L-аргініну за умов дії стресу викликає вірогідне зростання вмісту всіх досліджуваних показників КА, окрім ДА. Зміни функціонального стану МХ засвідчили про ушкоджуваність НАД-залежного шляху окиснення для двох груп тварин. Таким чином, у тварин з ВР вплив NO-ергічної ланки регуляції при стресі виявляється за умов переважного окиснення КГЛ через компенсаторні метаболічні потоки – аланін- і аспататамінотрансферазний механізм, оскільки інгібується під впливом амінооксиацетату. Відомо, що утворення КГЛ у цих реакціях виступає додатковим джерелом надходження відновних еквівалентів для підтримання функціональної активності МФК I. Так, для тварин з НР зниження величини спряженості процесів дихання і фосфорилювання за цих умов становило 40,4% (P<0,01), а для щурів з ВР – 23,4% (P<0,05).

4.1. Роль оксалоацетатного інгібування сукцинатдегідрогенази у мітохондріях печінки щурів з різною резистентністю до гіпоксії за умов стресу та його поєднання з парентеральним введенням L-аргініну або інгібітора синтази оксиду азоту Nщ-нітро-L-аргініну. Відомо, що інтенсивність процесу оксалоацетатного інгібування СДГ пов’язана з активацією метаболічних перетворень КА та інтенсифікацією процесів ПОЛ, які значно посилюються у щурів з НР під впливом стресу. У тварин з ВР оксалоацетатне інгібування СДГ не розвивається, оскільки екзогенний глутамат і глутамат у поєднанні з малатом посилюють спряженість процесів дихання і фосфорилювання на 20% (P<0,05) та 70,5% (P<0,05) відповідно. Зниження ефективності фосфорилювання АДФ у щурів з ВР при стресі супроводжується обмеженням інтенсивності процесів ліпопероксидації, що вказує на меншу ушкоджуваність процесів дихання у МХ від наростаючої концентрації АД. Коригуючий вплив екзогенного L-аргініну за умов стресу для особин з НР полягає у підвищенні спряженості процесів дихання і фосфорилювання на 44,4% (P<0,01) та 23,8% (P<0,05) без змін величини АДФ/О при розвитку оксалоацетатного інгібування СДГ. У щурів з ВР посилення ефектів окиснення СК досягається введенням інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA. Проте під впливом стресу розвиток оксалоацетатного інгібування СДГ, що усувається глутаматом і під впливом ротенону, у групі тварин з НР виражений значно сильніше: 29,8% (P<0,01) проти 12,6% для ВР. Таким чином, підтримання функціональної ролі НАД-залежного окиснення за умов стресу має принципове значення у формуванні індивідуальної резистентності і може модифікуватися під впливом чинників різної етіології. Зниження ролі НАД-залежного окиснення під впливом L-NNA і ротенону у ВР посилює неспряжене з синтезом АТФ окиснення, що активує ПОЛ, і виступає важливим чинником ушкодження процесів ОФ у МХ.

Під впливом стресу співвідношення лактат/піруват у крові щурів обох груп зростає, однак його відсоток для тварин з ВР є значно вищим (117,4% проти 82,6%, P<0,05 у НР відповідно). Вплив попередника біосинтезу NО для щурів з НР супроводжується зниженням співвідношення лактат/піруват, яке нівелювалося під впливом інгібітора синтази NO. У щурів з ВР вплив L-аргініну викликає зростання цього співвідношення, а інгібітор синтази NO його знижує. Це може засвідчувати про обмеження опосередкованих оксидом азоту токсичних ефектів у крові, викликаних продуктами окиснення КА та інтенсифікацією ПОЛ за умов стресу (рис.6).

Проведений дисперсійний і кореляційний аналіз показав високу залежність досліджуваних показників між вмістом КА і попередниками їх біосинтезу та величинами мітохондріального дихання (спряженість процесів дихання і фосфорилювання, АДФ/О тощо), станом системи АОЗ та інтенсивністю процесів ПОЛ. Зокрема, найвищі значення коефіцієнта кореляції отримано при введенні L-аргініну порівняно з L-NNA (r=0,55-0,84), а в обох групах тварин під впливом стресу і введення L-аргініну для активності ГП (r=0,81-0,96). Аналогічні значення ГП були кореляційно залежні (r=0,79-0,80) між основними величинами системи АОЗ в групі тварин з ВР у контролі і за умов стресу.

5. Порівняльний аналіз ефектів екзогенного L-аргініну та інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA на мітохондріальне дихання і інтенсивність процесів ліпопероксидації при гіпоксії у мурчаків і щурів. Важлива особливість функціонування NO полягає у тому, що обмеження гіперпродукції оксиду азоту здійснюється за принципом негативного зворотного зв’язку і рядом механізмів. Насамперед, це пов’язано з утворенням пероксинітриту (Castro et al., 1994; Boczkowski et al., 1999), що знижує інтенсивність мітохондріального окиснення (Radi et al., 1994), або 6-нітрокатехоламінів (Palumbo et al., 2001). Ймовірно, такі зміни можна пов’язати з високою початковою NO-реактивністю, що функціонує не тільки через холінергічні механізми регуляції, через які може здійснювати свій вплив екзогенний NO у мурчаків, а й ефективним використанням нітрит-редуктазних реакцій порівняно з NO-синтазними (Ванин, 2001). Відомо, що NO-синтазні механізми у більшій мірі залежать від нестачі кисню і інгібуються при гіпоксіях різного генезу (Реутов и др., 1998; Abu-Soud et al., 2000). Парентеральні ефекти L-NNA у мурчаків за умов гострої гіпоксії супроводжуються вірогідним зниженням дихання у стані V3 для СК і КГЛ. При збереженні дихального контролю в обох випадках досліджено значне зниження АДФ/О для СК і підвищення цього показника для КГЛ. Обмеження активації СДГ і перемикання процесів енергозабезпечення на переважне використання НАД-залежних субстратів, які супроводжуються вищими величинами ефективності фосфорилювання, призводить до зниження інтенсивності процесів ліпопероксидації. Цей ефект краще виявлявся у серці мурчаків – тварин з добре вираженим холінергічним статусом. Вказана активація окиснення КГЛ відбувається при незначному зниженні ефектів окиснення СК. При цьому зростає метаболічна роль редуктазних реакцій порівняно з оксидазними, пов’язаних з обмеженням негативних ефектів кисню і супероксиду за гіпоксійних умов.

6. Вплив α-кетоглутарату натрію і L-аргініну на показники динамічної витривалості до фізичного навантаження у щурів з різною резистентністю до гіпоксії. Дослідження процесів динамічної витривалості для високо- і низькорезистентних до гіпоксії щурів засвідчило, що екзогенні α-кетоглутарат і L-аргінін посилювали динамічну витривалість двох груп організмів, зокрема, для тварин з НР до рівня ВР у контролі. Зміни нівелювався під впливом блокаторів холінорецепторів (для КГЛ) та інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA (для L-аргініну). Показано, що посилення холінергічної ланки регуляції при введенні КГЛ обмежує негативні ефекти стресу та зростання концентрації КА, що інтенсифікують процеси ПОЛ при виснажливому м’язовому навантаженні, і краще виражені у групі тварин з НР.

7. Інтервальна гіпоксія і L-аргінін як засоби корекції процесів енергозабезпечення за умов гострої гіпоксії. Aналіз процесів функціонування МХ у процесі адаптації щурів методом інтервальної гіпоксії при використанні як субстратів окиснення СК і КГЛ засвідчив регуляторну роль NO-залежних механізмів на рівні окиснення субстратів дихального ланцюга МХ. Це може використовуватися як механізм модуляції активності α-кетоглутарат- і сукцинатдегідрогенази – провідних ферментів циклу Кребса. Викликана ІГ активація окиснення КГЛ під впливом інгібітора NO-синтази може розглядатися як ефективний шлях запобігання зниженню ролі НАДН-залежного окиснення та посилення нітритредуктазних механізмів, індукованих системою АХ-КГЛ-цГМФ при гострій гіпоксії. Остання ефективно не обмежує процеси інтенсифікації вільнорадикального окиснення. Можливо, збільшення концентрації NO у процесі ІГ сприяє обмеженню надходження відновних еквівалентів через МФК I порівняно з впливом на МФК II, визначаючи чутливість цієї ділянки дихального ланцюга МХ щодо інгібуючого впливу NO на дихання.

Як у тканині печінки, так і в міокарді за умов введення L-NNA впродовж ІГ виявлено значну активацію окиснення КГЛ при вірогідному зниженні окиснення СК. Отже, досліджені нами раніше особливості функціонування МХ міокарда і печінки пов’язані передусім із можливістю переходу на кисень-незалежні шляхи метаболізму, пов’язані з функціонуванням L-аргіназного шляху перетворень (Boucher et al., 1999). Зниження ролі кисень-залежних NO-синтазних механізмів при гіпоксії, що модифікуються домінуючим окисненням СК і підвищенням ролі СДГ, дозволяє переходити на L-аргіназні метаболічні шляхи, пов’язані із зростанням ролі КГЛ. Саме за умов формування адаптаційних змін активується холінергічний механізм регуляції і цГМФ-залежні реакції ефективного використання кисню (Кожемякин, Коростовцев, 1977; Гордій та ін., 1994). Тому окиснення КГЛ за умов введення інгібітора синтази оксиду азоту виявляє вищі значення ефективності процесів синтезу макроергів у дихальному ланцюгу МХ порівняно з ефектами окиснення СК.

Досліди з ІГ та введенням L-аргініну пов’язані із зростанням величин дихального контролю за Чансом (V3/V4) та АДФ/О у МХ печінки при окисненні СК і КГЛ. Зазначені параметри зберігалися на 180 добу після останнього сеансу адаптації (рис.7). Усі ці зміни супроводжувалися зниженням активності СДГ (на 24%, P<0,05) та концентрації ТБК-реактивних продуктів у крові, печінці і міокарді.

Таким чином, принципове значення у формуванні механізмів адаптації на дефіцит кисню має зростання ефективності функціонування НАДН-оксидазного шляху окислення. Хоча цей шлях окиснення є лімітуючим на початкових стадіях гіпоксії (Лукьянова, 2000) і пов’язаний з порушеннями енергосинтезуючої функції МХ, наші дослідження показали, що посилення ролі NO модифікує характеристики МФК І, а це, в свою чергу, сприяє формуванню тривалих адаптаційних реакцій. Ефективність методу ІГ, яка виявляється у впливі гострої гіпоксії, полягає у посиленні функціональної ролі окиснення НАД-залежних субстратів у дихальному ланцюгу МХ. А це виступає одним з механізмів підвищення резистентності за умов гострої кисневої нестачі. Реалізація ефектів екзогенного L-аргініну при ІГ супроводжується ефективною утилізацією АФК шляхом зростання активності ферментів АОЗ. Це може компенсуватися стимуляцією анаеробних шляхів утворення енергетичних субстратів, зокрема СК (Маевский и др., 1989-2001).

7.1. NO-залежні ефекти адаптації до гіпоксії в інтервальному режимі. Аналіз експериментальних даних при адаптації до ІГ показав, що вміст нітрит-аніону (NO2-) вірогідно зростає у крові і печінці. Гостра гіпоксія після курсу адаптації також супроводжується значним збільшенням його концентрації, про що свідчить зростання співвідношення концентрації нітрит-аніона до суми концентрацій нітрит- і нітрат-аніонів (рис. 8). Не виключено, що ІГ збільшує регуляторну роль депо NO (S-нітрозотіолів, динітрозольних комплексів заліза) за умов гострої кисневої нестачі (Ванин, 2001; Манухина и др., 2002). Нами показано, що ефективність ендогенного NO, як і модуляція його продукції під впливом гострої гіпоксії, значно зростає при додатковій метаболітній терапії L-аргініном в курсі ІГ. Саме за цих умов не встановлено вірогідного зростання нітратної компоненти циклу оксиду азоту. Це може опосередковано засвідчувати про ефективне його депонування, зниження окиснення нітрит-аніону до NO3- і виведення з організму (рис.8).

Отримані результати дають підставу вважати, що періодична активація механізмів адаптації при ІГ підвищує стійкість організму до наступного тестуючого гіпоксичного впливу. Реоксигенація, яка чергується з кожним гіпоксичним впливом при адаптації, стимулює вільнорадикальні процеси і збільшує ємність депо NО у ході адаптації, що запобігає негативній і проапоптичній дії надлишку оксиду азоту. Наші дослідження підтверджують висловлену В.Реутовим і співавт. (1998) та Ваніним (2001) концепцію щодо підвищення ролі нітритредуктазної компоненти метаболізму NO при гіпоксії. Відомо, що інтенсивність утворення NO із аніонів NO2- у міокарді при ішемії може бути значно вищою порівняно з роллю NO-синтаз, оскільки кисень є інгібітором ферментативного перетворення NO2- до NO.

Показано, що роль мікросомного окиснення (МСО) полягає у кисень-залежній трансформації широкого спектру ендогенних і екзогенних хімічних сполук (Владимиров, Арчаков, 1972). Проте за умов гіпоксії активність систем МСО може змінюватися на користь електрон-транспортних ланцюгів МХ, підсилюючи їх метаболічне забезпечення НАДН (Ратникова и др., 1978). Ефективність використання екзогенного СК для потреб системи МСО за умов гострої гіпоксії визначена більшою порівняно з іншими субстратами можливістю утворення відновних еквівалентів у дихальному ланцюгу з наступним їх переносом у цитозоль (Лукьянова и др., 1982) та опосередковується адренорецепторами. Оскільки утворення NO під впливом екзогенного КГЛ у печінці за умов гострої гіпоксії відбувається інтенсивніше порівняно з введенням екзогенного СК, тому, ймовірно, за цих умов супроводжується більшим зниженням активності системи МСО. Дослідження процесів амінопірин-N-деметилазної активності мікросомної фракції печінки щурів у процесі ІГ засвідчило вірогідне зниження активності процесів МСО на 37,2% (Р<0,05) (рис. 9). Гостра гіпоксія не змінює процеси МСО. Той же тест гострою гіпоксією, але у тварин після ІГ засвідчує різке (майже вдвічі) зниження активності процесів МСО, яке надалі поглиблювалося при парентеральному введенні L-аргініну. Ефекти L-NNA нівелювали вплив L-аргініну, однак залишались нижчими від значень при гострій гіпоксії.

Hаші результати підтверджують існування рецепторного контролю механізмів функціонування МХ, системи антиоксидантного захисту, викликаного адаптацією до періодичної нормобаричної і гострої гіпоксії, і участь у них оксиду азоту. Показано, що блокатори холінорецепторів, введені перед ІГ, нівелювали ефекти екзогенного L-аргініну. На відміну від L-аргініну, інгібітор NO-синтази не знижував інтенсивності ПОЛ при ІГ, проте суттєво підвищував активність ГП (майже втричі) та СОД (на 22%), знижував активність ГР (на 21%) та КАТ (на 34%).

Ефекти гіперпродукції NO, які супроводжують ІГ у мурчаків (але не щурів Вістар), як засвідчують наші результати, нівелюються інгібітором синтази оксиду азоту L-NNA. Це особливо прослідковується щодо змін вмісту АД, а для НА ми припускаємо існування альтернативних шляхів компенсаторних механізмів. Тому гіперпродукція NO, як і невідповідність у системі формування адаптації внаслідок зв’язування оксиду азоту у формі 6-нітрокатехоламінів, можуть модифікувати функціонування практично всіх систем організму і стратегію адаптаційних змін. Результати досліджень впливу L-аргініну на стан дихання і ОФ у МХ печінки і міокарда щурів, змінах системи мікросомного окиснення, інтенсивності процесів ПОЛ і системи АОЗ засвідчують про зростання ефективності функціонування кисень-залежних процесів. Ці зміни пов’язані із збереженням високих значень спряженості дихання і фосфорилювання АДФ, особливо при використанні субстрату окиснення КГЛ, вірогідного зниження активності системи МСО та продукції АФК. Саме такі ефекти функціонування МХ ми пов’язували із змінами продукції NO, оскільки вони нівелювалися при введенні інгібітора його біосинтезу Nщ-нітро-L-аргініну. Проведений курс адаптації тварин методом ІГ супроводжувався підвищенням кореляційної залежності передусім для ефектів окиснення КГЛ порівняно з ефектами окиснення СК у МХ: якщо для ефектів СК коефіцієнт кореляції змінювався у межах 0,56-0,85, то для ефектів КГЛ він досліджений на значно вищому рівні і становив 0,88-0,99.

8. Стан мітохондріального дихання та окиснювального фосфорилювання у печінці щурів за умов рентгенівського опромінення, введення α-кетоглутарату натрію та L-аргініну. Досліджений у нашій лабораторії ефект підвищення виживання тварин за умов метаболітної терапії екзогенним інтермедіатом ЦТК α-кетоглутаратом натрію у ранні терміни після опромінення у летальній дозі (Кургалюк, 1996) спонукав нас до з’ясування впливу КГЛ і L-аргініну за умов фракційного рентгенівського опромінення щурів у дозі 0,259 мКл/кг впродовж 30 діб. Відомо, що розвиток радіаційно-індукованих ушкоджень функціонального стану МХ і структурно-метаболічних порушень у системах організму супроводжується значною активацією вільнорадикальних процесів (Чаяло и др., 1991; Барабой та ін., 1994). Це виявляється, як досліджено нами, при іонізуючому опроміненні вже з найменшої дози – 2,59 мКл/кг і зберігається впродовж експерименту (рис.10). При цьому максимальні зміни спостерігаються на 30-ту добу дослідження.

Ефекти L-аргініну, введеного перед опроміненням, супроводжуються зниженням процесів дихання і ОФ у МХ при окисненні СК, а за умов окиснення КГЛ зростає величина спряженості дихання і фосфорилювання. Вплив L-NNA за аналогічних умов (2,59 мКл/кг) викликає активацію неспряженого з фосфорилюванням окиснення КГЛ на фоні вірогідної інтенсифікації процесів ліпопероксидації. Починаючи з дози 5,18 мКл/кг досліджено зростання величини ефективності окисно-відновних процесів, що виражається у їх підвищенні для СК при введенні L-NNA одразу після опромінення. Саме за цих умов інтенсивність процесів ліпопероксидації знижувалася.

Ефективність впливу L-NNA, введеного після опромінення, пов’язана із зростанням спряженості процесів дихання і ОФ для КГЛ на фоні зниження величини АДФ/О і інтенсивності процесів ПОЛ. Відоме явище “кисневого ефекту” у радіобіології ряд дослідників (Эйдус, Корыстов, 1984) пояснюють саме зниженням тканинного дихання і пов’язаного з ним обмеження інтенсивності процесів ПОЛ. Отже, впродовж тривалого опромінення коригувальний ефект системи NO пов’язаний з підвищенням ролі АХ і НАД-залежних субстратів у загальному окисненні.

Введення КГЛ курсовими дозами опроміненим тваринам обмежувало активацію процесів ПОЛ, нормалізувало показники крові і системи АОЗ. Підвищення терапевтичних ефектів екзогенного КГЛ та L-NNA пов’язане із зростанням ефективності окиснення КГЛ, ролі амінотрансферазних реакцій та СДГ, зниженням інтенсифікації процесів ПОЛ та підвищенням активності ферментів системи АОЗ у тканинах та крові.

Дослідження показників функціонування МХ і системи NO, яка реалізує свій вплив через холінергічну ланку регуляції (Данилович, Тугай, 2001), підтверджує нашу концепцію про синергічну дію АХ і КГЛ. Опосередкування ефектів екзогенного NO за участю КГЛ дозволяє пролонгувати реакцію холінергічних механізмів та може відігравати важливу роль у корекції метаболічних процесів організму при екстремальних навантаженнях (Шостаковська та ін., 1994). Вплив L-аргініну спрямований на обмеження наслідків дії негативних чинників на кисень-залежні процеси у МХ, що призводять до роз’єднання процесів дихання та ОФ з погіршенням енергетичного забезпечення функцій клітини. Використання природного метаболіта енергетичного обміну L-аргініну може бути перспективним шляхом корекції стресових ушкоджень організму і підвищує його адаптаційні можливості. Зниження ролі NO-синтазних систем у ранні терміни після іонізуючого впливу пов’язується у наших дослідженнях із ефективнішим використанням кисню і обмеженням реакцій вільнорадикального окиснення. Саме такі зміни спостерігаються при зростанні холінергічних механізмів регуляції і посиленні відновних процесів. Сукупність отриманих експериментальних даних та їх аналіз з урахуванням відомостей літератури дали можливість запропонувати гіпотетичну схему процесів метаболітної корекції основними інтермедіатами ЦТК ранніх ушкоджень за умов іонізуючого опромінення.

Рис. 10. Схема метаболітної корекції СК і КГЛ за участю системи оксиду азоту радіаційних ушкоджень кисень-залежних процесів.

ВИСНОВКИ

Здійснено системне дослідження дії основних інтермедіатів ЦТК сукцинату і α-кетоглутарату натрію за участю оксиду азоту у регуляції кисень-залежних процесів у клітині у щурів і мурчаків за умов гострої гіпоксії, стресу, іонізуючого опромінення. Показано наявність зв’язку між процесами енергозабезпечення (дихання і окиснювального фосфорилювання у мітохондріях), інтенсивністю процесів ліпопероксидації та активністю ферментів системи антиоксидантного захисту залежно від функціональних змін продукції оксиду азоту.

Встановлено, що екзогенний α-кетоглутарат натрію призводить до зростання вмісту нітрит-аніона як стабільного метаболіта оксиду азоту у печінці порівняно з сукцинатом за умов гострої гіпоксії на фоні зниження інтенсивності процесів ліпопероксидації.

Регуляція кисень-залежних процесів організму (мітохондріальне окиснювальне фосфорилювання, мікросомне окиснення, інтенсивність процесів ліпопероксидації і стан системи антиоксидантного захисту) залежить від рівня оксиду азоту, продукованого під впливом L-аргініну. Показана важлива роль холінорецепторів у реалізації ефектів екзогенного L-аргініну.

Активація вільнорадикального окиснення та зростання вмісту катехоламінів при гострій гіпоксії пов’язані із підвищенням ролі сукцинату та зниженням α-кетоглутарату як субстратів окиснення у мітохондріях. Введення L-аргініну посилює ефективність окиснення α-кетоглутарату шляхом активації холінергічних регуляторних впливів і знижує інтенсивність процесів ліпопероксидації. Ці зміни усуваються під впливом блокаторів холінорецепторів та інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA.

Екзогенний L-аргінін підвищує ефективність функціонування окисних процесів та функції мітохондрій щодо акумуляції кальцію за участю сукцинату і α-кетоглутарату у тварин з низькою резистентністю до гіпоксії до вихідної у тварин високою резистентністю. Зниження NO-синтазної активності супроводжується активацією процесів дихання у мітохондріях з одночасною інтенсифікацією процесів перекисного окиснення ліпідів.

Вплив екзогенного L-аргініну in vitro та in vivo засвідчує антиоксидантні властивості, пов’язані із вірогідним зниженням інтенсивності процесів ліпопероксидації, та активності основних ферментів системи антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази і каталази) за дозо-залежним характером. Показано, що сукцинат і α-кетоглутарат модифікують вплив екзогенного L-аргініну. Зростання інтенсивності процесів ліпопероксидації при окисненні сукцинату активує систему антиоксидантного захисту, що може використовуватися як ефективний механізм запобігання негативних наслідків окиснювального стресу.

Тканинна гіпоксія і викликані нею метаболічні порушення, що обумовлені зростанням вмісту катехоламінів, виступають основними патогенними чинниками при стресі. Ефекти L-аргініну за умов дії стресу супроводжуються зростанням резервних можливостей симпато-адреналової системи, опосередковуються катіонами кальцію, визначені вихідною резистентністю до гіпоксії і усуваються під впливом інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA.

Активація NO-ергічної ланки регуляції при введенні L-аргініну підвищує адаптаційні можливості організмів з низькою резистентністю до гіпоксії за рахунок зростання ефективності мітохондріального енергозабезпечення у амінотрансферазних реакціях та обмеження ефектів оксалоацетатного інгібування сукцинатдегідрогенази за умов стресу.

Зниження ролі NO-синтазних реакцій за умов стресу у тварин з високою резистентністю до гіпоксії запобігає інтенсифікації процесів ліпопероксидації та активує окиснення α-кетоглутарату, що виявляється при використанні ротенону і малонату.

Посилення метаболізму оксиду азоту в NO-синтазних і L-аргіназних реакціях може бути засобом профілактики гіпоксичних станів залежно від індивідуального стану фізіологічної реактивності. Для низькорезистентиних до гіпоксії тварин показано зростання ефективністі функціонування NO-синтазного механізму. Для особин з переважанням холінергічних регуляторних впливів, які вже володіють потенціалом адаптаційних можливостей – щурі з високою резистентністю до гіпоксії та мурчаки – корекція процесів енергозабезпечення і продукції активних форм кисню може здійснюватися під впливом інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA.

Вплив α-кетоглутарату і L-аргініну викликає підвищення динамічної витривалості до фізичного навантаження у тварин з високою і низькою резистентністю до гіпоксії та знижується під впливом блокаторів холінорецепторів та інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA. Посилення холінергічної ланки регуляції при введенні α-кетоглутарату натрію обмежує негативні ефекти стресу та зростання концентрації катехоламінів. Останні інтенсифікують процеси ПОЛ при виснажливому м’язовому навантаженні, що краще виражене у групі тварин з низькою резистентністю до гіпоксії.

Активація сукцинатзалежних процесів мітохондріального окиснення, викликаних гострою гіпоксією, знижується у тварин після проведення курсу адаптації. Інтервальна гіпоксія з введенням L-аргініну, попереджуючи активацію ПОЛ у тканинах та крові під дією гострої гіпоксії, підвищує ефективність і спряженість енергетичних реакцій у функціонуванні мітохондрій печінки і міокарда, посилюючи окиснення α-кетоглутарату. Зміни показників функціонування мітохондрій зберігаються до 180-ої доби після припинення курсу адаптації.

Досліджені ефекти адаптації опосередковані зростанням ролі NO-залежних механізмів, оцінюваних за змінами фонду нітратів, нітритів, карбаміду і сумарних поліамінів, знижуються під впливом L-NNA та холіноблокаторів. Інтервальна гіпоксія на фоні блокади адренорецепторів може бути ефективним засобом корекції інтенсивності процесів ліпопероксидації, мікросомного окиснення і супроводжується посиленням ролі антиоксидантної системи за умов гострої гіпоксії.

Радіомодифікаційні ефекти L-аргініну супроводжуються активацією окиснення сукцинату. Екзогенний α-кетоглутарат за участю інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA за умов іонізуючого опромінення підвищує ефективність окиснення α-кетоглутарату в мітохондріях, посилює роль амінотрансферазних реакцій та сукцинатдегідрогенази, знижує інтенсивність процесів ліпопероксидації, підвищує активність системи антиоксидантного захисту у тканинах та крові.

Перелік основних публікацій за темою дисертації

Кургалюк Н.М. Вплив альфа-кетоглутарату натрію на витривалість до фізичного навантаження у щурів з різною резистентністю до гіпоксії // Фізіол. журн. – 2000. – Т.46, №4. – С.88-95.

Кургалюк Н. Вплив L-аргініну на показники АДФ-стимульованого дихання мітоxондрій міокарда в процесі адаптації тварин до періодичної нормобаричної гіпоксії // Вісник Львівського університету. Сер. біол. – 2001. – Вип. 27. – С.225-235.

Кургалюк Н.М. Стан мітохондріального дихання і кальцієвої ємності печінки щурів з різною резистентністю до гіпоксії за умов введення L–аргініну // Фізіол. журн. – 2001. – Т.47, №3. – С.64-72.

Кургалюк Н.М. Мітохондріальне дихання, окисне фосфорилювання, стан системи антиоксидантного захисту та ПОЛ при іонізуючому опроміненні тварин і введенні альфа-кетоглутарату натрію // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 2001. – Вип.7. – С.44-49.

Кургалюк Н.М. Вплив модифікації продукції оксиду азоту L-NNA на стан системи антиоксидантного захисту і перекисного окиснення ліпідів у крові та тканинах щурів з різною резистентністю до гіпоксії // Фізіол. журн. – 2001. – Т.47, №2. – С.52-59.

Кургалюк Н.М. Зміни функціонального стану мітохондрій печінки мурчаків при адаптації до гострої гіпоксії під впливом L-аргініну і блокатора синтази оксиду азоту L-NNA // Біологія тварин. – 2002. – Т.4, №1-2. – С.96-102.

Кургалюк Н.М. Вплив L-аргініну і блокатора синтази оксиду азоту L-NNA на показники енергозабезпечення мітохондрій міокарда мурчаків за умов гострої гіпоксії // Вісник Львівського університету. Серія біол. – 2002. – Вип.29. – С.177-186.

Кургалюк Н.М. Вплив попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну на енергозабезпечення і антиоксидантний захист у печінці білих щурів за умов гострої гіпоксії // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 2002. – Вип.8. – С.33-36.

Кургалюк Н.М. L-аргінін як засіб корекції процесів мітохондріального енергозабезпечення при радіаційних ураженнях у щурів // Мед. хімія. – 2002. – 4, №3. – С.38-41.

Кургалюк Н.М. Вплив інтермедіатів циклу трикарбонових кислот на систему оксиду азоту за гострої гіпоксії організму // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т.74, №4. – С.85-90.

Кургалюк Н.Н. Оксид азота как фактор адаптационной защиты при гипоксии // Успехи физиол. наук. – 2002. – 33, №4. – С.65-79.

Кургалюк Н. Стан мітохондріального дихання та окиснювального фосфорилювання у печінці білих щурів за умов рентгенівського опромінення, введення L-аргініну та блокатора синтази оксиду азоту L-NNA // Вісник Львівського університету. Серія біол. – 2002. – 31. – С.233-240.

Кургалюк Н.М. Адаптаційні зміни катехоламінових фракцій крові щурів і мурчаків під впливом оксиду азоту, L-NNA і гострої гіпоксії // Наукові записки Тернопільського педуніверситету імені Володимира Гнатюка. Серія біол. – 2002.– 2. – С.110-114.

Кургалюк Н.М., Горинь О.В. Стан мітохондріального дихання та окислювального фосфорилювання у печінці білих щурів за умов рентгенівського опромінення та введення альфа-кетоглутарату натрію // Фізіол. журн. – 2000. – Т.46, №5. – С.63-70. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, отримання матеріалу, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті. Дисертант особисто виконала дослідження процесів окиснювального фосфорилювання у мітохондріях печінки щурів).

Горинь О.В., Кургалюк Н.М. Вплив альфа-кетоглутарату на показники периферичної крові, перекисного окиснення ліпідів і активність ферментів антиоксидантного захисту опромінених щурів // Фізіол. журн. – 2000. – Т.46, №3. – С.57-66. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, отримання матеріалу, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті. Дисертант особисто виконала дослідження вмісту ТБК-реактивних продуктів і ферментів антиоксидантного захисту у щурів).

Кургалюк Н.М., Вернюк О.М., Гальків М.О. Зміни процесів переамінування, окислення та медіаторного балансу у печінці тварин з різною резистентністю до гіпоксії при виконанні динамічної роботи за умов уведення альфа-кетоглутарату натрію // Вісник Львівського університету. Серія біол. – 2000. – Вип.25. – С.94-101. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, отримання матеріалу, виконання експериментальних робіт, аналізі результатів та написанні статті).

Кургалюк Н.М., Горинь О.В., Іккерт О., Гордій С.К. Вплив інтермедіатів циклу Кребса на пострадіаційні зміни процесів дихання і окисного фосфорилування у мітохондріях печінки щурів // Вісник Львівського університету. Серія біол. – 2000. – Вип.26. – С.103-110. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, отримання матеріалу, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті. Дисертант особисто виконала дослідження процесів окиснювального фосфорилювання у мітохондріях печінки щурів).

Кургалюк Н.М., Іккерт О.В., Гордій С.К., Гальків М.О., Ткаченко Г.М. Регуляція L–аргініном транспорту іонів кальцію і окиснювального фосфорилювання у мітохондріях печінки щурів з різною резистентністю до гіпоксії при дії стресорних навантажень // Біологія тварин. – 2000. – Т.2, №2. – С.143-151. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, розробка робочої схеми експерименту, отримання матеріалу, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті).

Кургалюк Н.М., Гальків М.О. Вплив альфа-кетоглутарату натрію на процеси переамінування, окислення та медіаторний баланс у печінці щурів з різною резистентністю до гіпоксії при виконанні динамічної роботи // Мед. хімія. – 2000. – Т.2, №1. – С.21-24. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті).

Кургалюк Н.М., Серебровська Т.В. Вплив інтервальних гіпоксичних тренувань на антиоксидну систему і перекисне окислення ліпідів при дії гострої гіпоксії і донора оксиду азоту // Мед. хімія. – 2001. – Т.3, №1. – С.69-71. (Дисертант є співавтором ідеї, покладеної в основу статті, їй належить опрацювання робочої схеми експерименту, участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті).

Кургалюк Н.М., Іккерт О.В., Горинь О.В., Гордій С.К., Серебровська Т.В., Гальків М.О. Вплив оксиду азоту на механізми регуляції вмісту активних форм кисню в адаптивних відповідях організмів з різною резистентністю до дії гіпоксичного фактора // Мед. хімія. – 2001. – Т.3, №3. – С.14-18. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналізі результатів, написанні статті).

Кургалюк Н.М., Іккерт О.В., Вовканич Л.С., Горинь О.В., Гальків М.О., Гордій С.К. Вплив L-аргініну і блокатора синтази оксиду азоту L-NNA на кальцієву ємність мітохондрій печінки щурів з різною резистентністю до гіпоксії // Укр. біохім. журн. – 2001. – Т.73, №5. – С.82-86. (Дисертанту належить опрацювання літературних даних і власних результатів, участь в аналізі і написанні статті).

Серебровська Т.В., Кургалюк Н.М., Носар В.І., Колеснікова Є.Е. Вплив інтервальних гіпоксичних тренувань та екзогенного оксиду азоту на процеси енергозабезпечення та ліпопероксидації у печінці щурів за умов гострої гіпоксії // Фізіол. журн. – 2001. – Т.47, №1. – С.85-92. (Дисертант є співавтором ідеї, покладеної в основу статті, їй належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз результатів та написання статті. Дисертант особисто виконала дослідження показників окиснювального фосфорилювання у мітохондріях печінки та вмісту ТБК-реактивних продуктів у крові і тканинах щурів).

Іккерт О., Кургалюк Н., Гордій С. Вплив L-аргініну та Nщ-нітро-L-аргініну на окисне фосфорилювання і процеси ліпопероксидації у щурів з різною резистентністю до гіпоксії за умов стресу // Укр. біохім. журн. – 2001. – Т.73, №6. – С.49-57. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналізі результатів, написанні статті).

Кургалюк Н.М., Мишуніна Т.М., Серебровська Т.В., Колеснікова Е.Є. Вплив L-аргініну і блокатора синтази оксиду азоту Nщ-нітро-L-аргініну на вміст катехоламінів у крові щyрів за умов стресу // Ендокринологія. – 2002. – Т.7, №1. – С.73-76. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналізі результатів, написанні статті).

Кургалюк Н.М., Серебровська Т.В., Носар В.І., Колеснікова Є.Е., Мойбенко О.О. Інтервальні гіпоксичні тренування і L-аргінін як засоби корекції енергозабезпечення міокарда за умов гострої гіпоксії // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т.74, №1. – С.83-88. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналізі результатів та написанні статті. Дисертант особисто виконала дослідження показників окиснювального фосфорилювання у мітохондріях міокарда).

Кургалюк Н.М., Серебровська Т.В., Колєснікова Є.Е., Алексюк Л.І. Модуляція екзогенним L-аргініном мітохондріального та мікросомального окиснення при гострій та періодичній нормобаричній гіпоксії // Фізіол. журн. – 2002. – 48, № 5. – С.67-73. (Дисертант є співавторм ідеї, покладена в основу статті, їй належить опрацювання робочої схеми експерименту, отримання матеріалу і безпосереднє виконання експериментальних робіт при дослідженні впливу L-аргініну на мітохондріальне та мікросомальне окиснення при гострій та періодичній нормобаричній гіпоксії, аналіз результатів та написання статті).

Кургалюк Н.М., Серебровська Т.В., Колєснікова Є.Е. Рецепторна регуляція окислювального фосфорилування мітохондрій печінки за адаптації щурів до періодичної нормобаричної і гострої гіпоксії // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т.74, №6. – С.114-119. (Дисертант є співавтором ідеї, покладеної в основу статті, їй належить участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналізі результатів та написанні статті. Дисертант особисто виконала дослідження показників окиснювального фосфорилювання у мітохондріях печінки).

Кургалюк Н.М., Мишуніна Т.М. Вплив L-аргініну і блокатора синтази оксиду азоту азоту Nщ-нітро-L-аргініну на рівень катехоламінів та продуктів пероксидного окислення ліпідів у крові щурів за умов адаптації до інтервальної гіпоксії // Доповіді Національної академії наук України. – 2003. – №2. – С.114-119. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь в отриманні матеріалу і виконанні експериментальних робіт, аналізі результатів та написанні статті).

Kurgaluyk N.M. Investigation of indices of energetical exchange in digestive glands and myocard of rats with different hypoxia resistance // 9th European Bioenergetics Conference. EBEC short reports/ August 17-22. –  Louvain-La-Neuve, 1996. – V.9. – P.179.

Kurgaluyk N.M, Shostakovska I.V. Influence of sodium alpha-ketoglutarate injection on energy support of digestive glands by functional loading of the organism // Materials of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, 1997, San Francisco, USA. – P.179.

Галькив М.А., Кургалюк Н.Н., Старостюк А.К. Радиобиологические особенности участия холинергических структур в реакциях организма на действие ионизирующей радиации // Третий съезд по радиационным исследованиям. Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность. – Москва, 14-17 окт. 1997 г.: Тез. докл. – Т.1. – Пущино, 1997. – С.353-354.

Кургалюк Н.М. Вплив альфа-кетоглутарату натрію на енергозабезпечення діяльності травних залоз при функціональному перенапруженні організму // Матеріали VII Укр. біохім. з’їзду. – Київ, 1997. – С.101-102.

Кургалюк Н.М., Гальків М.О., Горинь О.В., Гордій С.К., Шостаковська І.В. Особливості адаптаційної перебудови організму у залежності від рівня гіпоксичної стійкості та введення альфа-кетоглутарату натрію при виконанні щурами динамічної роботи / Гіпоксія: деструктивна та конструктивна дія. Матеріали Міжнародної конференції. – Київ, 10-12 червня 1998 р. – С.109-110.

Kurgalyuk N., Goryn O., Ikkert O., Gordii S., Galkiv M. Intermediates of Krebs cycle as regulators organism’s resistance to extremal conditions // Sixth International Symposium on biological reactive intermediates “Chemical and biological mechanisms in susceptibility to and prevention of environmental diseases. – Paris, 2000, July 16-20. – P.27.

Kurhalyuk N., Horyn O., Ikkert O., Hordii S. Changes of energy metabolism indices and antioxidant enzymes activity under extremal influences and their regulation by means of exogenous intermediates of Krebs cycle // 3rd Parnas Conference, October 14-18, 2000. – P.121.

Кургалюк Н.М., Іккерт О., Горинь О.В., Гордій С.К., Гальків М.О. Мітохондріальне дихання, окисне фосфорилювання, стан системи антиоксидантного захисту та перекисного окиснення ліпідів при іонізуючому опроміненні тварин і введенні α-кетоглутарату натрію / Матер. III Національного Конгресу патофізіологів України з міжнародною участю. // Фізіол. журн. – 2000. – Т.46. – №2(а). – С.121-122.

Kurhalyuk N., Ikkert O., Halkiv M., Hordii S., Tkachenko G. L-arginine as a correction factor for the mitochondrial respiration, antioxidant system activity and lipid peroxidation processes in rats with different resistsnce to hypoxia under stress conditions // Aminoacіds and their derivatives in biology and medicine. – Grodno. – 2001. – P.65-66.

Кургалюк Н.М., Іккерт О.В., Гальків М.О., Гордій С.К., Ткаченко Г.М. Мітохондріальне дихання, стан системи антиоксидантного захисту і перекисного окиснення ліпідів у щурів з різною резистентністю до гіпоксії під впливом L-аргініну за умов стресу // Актуальні проблеми гастроентерології. Тези доп. Всеукраїнської наукової конференції. – Київ, 20-21 грудня 2001 р. – К., 2001. – С.25.

Кургалюк Н.М., Іккерт О.В., Гордій С.К., Гальків М.О., Ткаченко Г.М. Корекція процесів перекисного окиснення ліпідів і системи антиоксидантного захисту у щурів з різною резистентністю до гіпоксії залежно від функціонального стану NO-ергічної ланки регуляції. Збірник праць наукової конференції до 100-річчя з дня народження І.М.Буланкіна (16-17 січня 2001 р, Харків).– Харків, 2001. – С.53-54.

Serebrovskaya T.V., Kurgalyuk N.M., Nosar V.I., Afanasyeva V.P., Moibenko A.A. Combination of intermittent hypoxic traning (IHT) nitric oxide donors improves rat liver mitochondrial respiration and phosphorylation under acute hypoxia // Fourth International Conference “Hypoxia in Medicine”. – 26-28 September 2001, Geneva, Switzerland. / Hyрoxia Medical J. – 2001. – №3. – P.30.

Кургалюк Н.М., Іккерт О.В., Гальків М.О., Гордій С.К., Ткаченко Г.М. Транспорт кальцію у мітохондріях печінки щурів з різною резистентністю до гіпоксії під впливом L-аргініну та блокатора синатзи оксиду азоту L-NNA // Матеріали XVI з’їзду Українського фізіологічного товариства. Вінниця, 28-30 травня 2002 р. / Фізіол. журн. – 2002. – Т.48, №2. – С.88.

Kurhalyuk N. NO-dependent adaptation to hypoxia in intermittent hypoxia training // 4th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell activation. Biological signals and their target enzymes”. – Wroclaw, 2002, September 15-17. – P.104.

Kurhalyuk N., Serebrovskaya T. Role of Krebs Cycle intermediates in energy metabolism and antioxidant enzymes activity under acute hypoxia // Astroeco – 2002: Current status and prospects of international research in observation astronomy, ecology and extreme physiology in the Elbrus region. – Terskol, Russia – 2002, August 12-16. – P.57.

Іккерт О.В., Кургалюк Н.М., Ткаченко Г.М., Гальків М.О., Гордій С.К. Роль NO-залежних механізмів мітохондріального енергозабезпечення у формуванні гострого стресорного впливу // Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду 1-3 жовтня 2002 р., м.Чернівці: Укр. біохім. журн.– 2002.– Т.74, №4а (додаток 1). – С.41.

Кургалюк Н.М., Іккерт О.В., Ткаченко Г.М., Гальків М.О., Гордій С.К. Радіотерапевтичні та радіопротекторні ефекти впливу екзогенного L-аргініну на мітохондріальне енергозабезпечення та інтенсивність процесів ліпопероксидації у щурів // Тези доповідей ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства 8-11 жовтня 2002 р., м.Львів. – С.200.

Кургалюк Н.М. NO-залежні ефекти адаптації до гіпоксії в інтервальному режимі // Матеріали міжнародної конференції, присвяченої пам’яті професора Шостаковської І.В. 11-12 жовтня 2002 р., м.Львів. – С.26.

Кургалюк Н.Н., Серебровская Т.В. Интервальная гипоксия и L-аргинин как способы коррекции основных кислородзависимых процессов при острой гипоксии // Тезисы докладов ІІІ Всероссийской конференции “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция” 7-9 октября 2002 г., Москва. – С.71.