|
ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. В.Н.КАРАЗІНА
Ушакова Галина Олександрівна
УДК 517.112:612.8
РОЛЬ ГЛІКОЗАМІНОГЛІКАН-зв’язуючих білків у МОРФОГЕНЕЗІ та ПЛАСТИЧНОСТІ мозку
03.00.04 - біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Харків – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті Міністерства освіти і науки України.
Науковий консультант:
доктор біологічних наук, професор Корогод Сергій Михайлович,
Дніпропетровський національний університет, завідувач кафедри експериментальної фізики, керівник Дніпропетровського відділення Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України.
Офіційні опоненти:
- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Малишева Маргарита Костянтинівна,
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
завідувач відділу нейрохімії;
- доктор біологічних наук, професор Шевцова Алла Іванівна,
Дніпропетровська державна медична академія
професор кафедри біологічної та загальної хімії;
- доктор біологічних наук, професор Перський Євген Єфроїмович,
Харківський національний університет ім В.Н. Каразіна,
завідувач кафедри біохімії.
Провідна установа: Київський національний університет
ім. Тараса Шевченка (кафедра біохімії), м. Київ.
Захист відбудеться "8" червня 2005 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України
(61077, м. Харків, площа Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15).
З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).
Автореферат розісланий “28” квітня 2005 року
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження глікокон’югатів набувають особливої актуальності. Тривалі роки вуглеводи (особливо полісахариди) розглядалися здебільшого як джерело енергії та структурні компоненти клітин. Останнім часом усе більше даних указують на обмеженість таких уявлень. Визначені полісахариди, що спроможні вибірково зв'язуватися з білками й ліпідами, такі взаємодії грають важливу роль у передачі інформації у системах “клітина-клітина” й “клітина-матрикс” (Guimond et al., 2001; Yip et al, 2002; Weigel and Yik, 2002).
Як вважають деякі дослідники, глікозилювання є регуляторний механізм життєдіяльності клітини, й, можливо, більш поширена форма регуляції, ніж фосфорилювання (Flogel, 2001). Зміни взаємодії гліканів із їх лігандами спостерігаються при розвитку багатьох патологічних процесів, наприклад, при запаленні (Ellies et al., 1998), пухлинному рості (Scheidegger et al., 1994), автоімунних захворюваннях (Chui et al., 2001). Навіть патогенні мікроорганізми починають взаємодію із клітиною господарю через взаємодії карбогідрат-лектин (Karlsson, 1998). Глікозаміноглікани беруть участь у багатьох фізіологічних процесах, включаючи контроль клітинного росту, рух клітин та їх адгезію (Martinho et al., 1996). Значна частина процесів, що задіяні у реалізації клітинних функцій, контролюється гепарансульфат-зв’язуючими білками. У цю групу входять фактори росту, молекули клітинної адгезії, різні протеоглікани (Kreis and Vale, 1993).
Найбільш докладно характеризовані глікозаміноглікани й протеоглікани, що присутні у сполучній тканині (Reddy and Dhar, 1991). Однак процеси проліферації, міграції і міжклітинної адгезії не менш актуальні для морфогенезу й функціонування ЦНС. Було показано (Margolis and Margolis, 1979; Yanagishita, 1993; Heufelder, 2000), що кількість глікозаміногліканів і протеогліканів у ЦНС украй мала. Тому протягом тривалого часу дослідники взагалі заперечували наявність даних компонентів у нервовій тканині. Тільки з появою більш чутливих методів імунохімії та молекулярної біології вдалося показати, що глікозаміноглікани, й, зокрема, гепарансульфати та гіалуронова кислота, представляють собою сполуки, котрі характерні для нервової тканини також (Karthikeyan et al., 1994; Hartmann and Maurer, 2001). Однак, природа, механізм й функціональні наслідки взаємодії глікозаміногліканів із специфічними білками у центральній нервовій системі багато в чому залишаються невідомими. На сьогодні є дані лише про структурні особливості окремих протеогліканів, що вже ідентифіковані, функції їх тільки вивчаються (Yanagishita, 1993; Heufelder, 2000; Hartmann and Maurer, 2001). Для визначених глікозаміноглікан-зв’язуючих білків часто встановлюється висока ступінь гомології стосовно структури (особливо вуглевод-зв’язуючих доменів), й можливості компенсаторного перехрестя контролювання однієї й той самої функції (Kreis and Vale, 1993). Частина глікозаміноглікан-зв’язуючих білків у нервовій тканині ще не визначена. У зв’язку з цим особливу актуальність набуває вивчення спочатку рівня загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої властивості білків у мозку. Для цього потребуються відповідні методи, що характеризуються високим ступенем специфічності та чутливості; необхідні дані стосовно оптимальних умов щодо визначення глікозаміноглікан-зв’язуючої властивості білків нервової тканини як в умовах експерименту in vitro та й в умовах in vivo.
Взаємодії глікозаміногліканів із їх лігандами частіше всього забезпечуються за рахунок електростатичних зв’язків, що є високочутливі до зміни навколишнього середовища, особливо до впливу вільних радикалів, рН й осмолярності (Moseley et al., 1995). Зміна властивостей мембрани цілого нейронального компартменту, що містить десятки й сотні синапсів, неодмінно впливає на вихідний сигнал цього нейрону, визначаючи нейрональну пластичність. Логічно припустити, що вплив кислих метаболітів (наприклад у разі гіперфенілаланінемії), зміна осмолярності під час впливу опромінення низької інтенсивності або під час гіпералгезії у післяопераційний термін можуть призводити до змін у взаємодіях між глікозаміногліканами та їх специфічними рецепторами. Яким чином це впливає на нейрональну пластичність раніше не було встановлено. Альтернативні пошуки корегування ментального порушення в наслідок впливу різних чинників є одна із серйозних проблем сучасності.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами науково-дослідних робіт. Робота виконувалася в рамках договору про спільну наукову діяльність Дніпропетровського національного університету та Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України (№1167, 2001-2003 рр) за темою “Дослідження механізмів формування неоднорідних розподілів мембранних макромолекул та їх ролі у морфо- та електрогенезі нейронів”, міжнародного цільового гранта від уряду Саксонії (Німеччина), 1996-1997 рр., (грант AZ 1-6220.3-02/41) за темою “Вплив материнського гіпотиреозу на ембріональний розвиток мозку та щитовидної залози щурів”, держбюджетної теми інституту біології ДДУ № 02-20-97 “Фундаментальні дослідження впливу синергічної дії екопатогенних чинників та наукове обґрунтування нових комплексних методів діагностики, корекції та профілактики порушень стану здоров’я населення” Міністерства освіти України.
Мета та задачі дослідження. Метою роботи стало визначення ролі гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих білків на різних етапах морфогенезу головного мозку за нормальних умов та оцінка внеску глікозаміноглікан-зв’язуючих білків у нейропластичність у разі впливу чинників, що провокують розумові порушення. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
- розробити методичні заходи визначення загальної гепарансульфат або гіалуронат-зв’язуючої здатності білків мозку, визначити оптимальні умови для їх застосування в умовах in vitro та in situ;
- визначити рівні загальної гепарансультат й гіалуронат-зв’язуючої здатності білків, їх клітинну й субклітинну локалізацію у мозку під час ембріонального розвитку щурів;
- оцінити ступень схожості глікозаміноглікан-зв’язуючої властивості білків та їх локалізації в ембріональному мозку людини й щурів;
- вивчити зміни гепарансультат та гіалуронат-зв’язуючої здатності білків та їх розподілу в мозку щурів під час раннього постнатального розвитку щурів;
- дослідити глікозаміноглікан-зв’язуючу властивість білків у різних відділах дорослого мозку та її залежність від статі;
- характеризувати наслідки впливу гепарансульфата та гіалуроната на морфогенез нейронів гіпокампу;
- виділити та очистити гепарансульфат-зв’язуючі та гіалуронат-зв’язуючі білки з мозку щурів та людини, визначити їх головні характеристики;
- з’ясувати рівень зміни глікозаміноглікан-зв’язуючої здатності білків у мозку щурів, розвиток котрих проходив в умовах гіперфенілаланінемії;
- дослідити гепарансультат та гіалуронат-зв’язуючу активність білків у мозку щурів на різних етапах морфогенезу та у дорослих особин під впливом іонізуючих чинників різного походження у малих дозах;
- вияснити можливу участь гепарансульфат-зв’язуючих білків мозку щурів у центральних механізмах болю;
- визначити динаміку поведінкових реакцій щурів під впливом указаних шкідливих чинників;
- запропонувати гіпотетичну шкалу залежності морфогенезних подій у мозку від загального рівня гепарансультат та гіалуронат-зв’язуючої здатності білків.
Об'єкт дослідження. Гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуюча властивість білків мозку.
Предмет дослідження. Динаміка гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості білків мозку на різних етапах морфогенезу головного мозку за нормальних умов та при дії чинників, що призводять до ментальних порушень; характеристика нових глікозаміноглікан-зв’язуючих білків мозку.
Методи дослідження. Фізико-хімічні методи очистки й характеристики білків (екстракція, ультрацентрифугування, гель-фільтрація, іонообміна й афіна хроматографії, електрофорез у ПААГ, імуноблотинг, імуноферментний аналіз, твердофазний вуглевод-ферментний аналіз); кількісний аналіз глікозаміногліканів, гісто- та імуноцитохімічні методи; моношарова культура нейронів гіпокампу;експериментальні моделі на щурах; статистичні засоби обробки данних.
Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано концепцію регуляції морфогенезних подій та нейропластичності у головному мозку за рахунок зміни загального рівня гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої властивості білків.
Уперше визначена динаміка загальної гепарансульфат- й гіалуронат-зв’язуючої здатності білків у мозку щурів під час ембріонального та постнатального розвитку. Отримані нові дані про специфічну субклітинну локалізацію центрів зв’язування гепарансульфату та гіалуронату в мозку щурів на різних етапах морфогенезу. Установлена наявність гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих компонентів у ядрах проліферуючих та мігруючих нервових клітин, і наведені докази зв’язування названих глікозаміногліканів із білками ядерного скелета. Показано схожість субклітинної локалізації гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих білків в ембріональному мозку людини. Доведено перерозподіл глікозаміноглікан-зв’язуючої властивості між мембранними та екстрацелюлярними/цитоскелетними білками на ранніх стадіях морфогенезу мозку. Установлений рівень співвідношення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої властивості екстрацелюлярних/цитоскелетних білків (1:10) на ранніх стадіях морфогенезу мозку.
Очищені та охарактеризовані гепарансульфат-зв’язуючі мембраноасоційовані та цитоскелетні білки з неонатального мозку щурів, що представлені двома поліпептидами з молекулярними масами 19 і 28 кДа, та нові мембранні гіалуронат-зв’язуючі білки з ембріонального мозку людини з молекулярними масами 250 і 20 кДа, які не мають імуноперехрестя з відомими білками.
Представлені докази швидкого збільшення загального рівня глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків мозку на стадіях активної проліферації та міграції клітин в умовах гіперфенілаланінемії, яка супроводжувалася зниженням маси мозку та порушеннями локомоторних, емоційних та дослідницьких реакцій щурів.
Уперше наводяться дані про збільшення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків у мозку новонароджених щурів унаслідок впливу 131I у малій дозі, отриманої під час критичних етапів ембріогенезу, при одночасній стабільності цих параметрів у мозку дорослих самиць.
Отримані дані про загальну гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючу активність білків із різних відділів мозку дорослих щурів обох статей за нормальних умов та після одноразового й фракціонованого загального рентгенівського опромінення у малій дозі (0,25 Гр). Установлено, що рівень загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків відрізняється в різних відділах мозку та залежить від статі тварин. За нормальних умов максимальний рівень загальної глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків був виявлений у структурах лімбічної системи. Як при одноразовому, так і при фракціонованому опроміненні динаміка змін загальної глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків у корі великих півкуль й гіпокампі відрізнялася від інших досліджених відділів мозку щурів, що вказує на специфічну пластичну перебудову міжклітинних взаємодій та взаємодії клітина-матрикс у цих структурах мозку під впливом малих доз радіації. Проява поведінкової активності тварин у перші дні пострадіаційний термін була пригнічена з найбільшим зменшенням параметрів, які характеризують емоційний та дослідницький стан.
Показана участь гепарансуфат-зв’язуючих білків мозку дорослих щурів у центральних механізмах болю в післяопераційний період.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані й сформульовані на їх підставі висновки мають загальнотеоретичне та практичне значення для загальної біохімії, й особисто для нейрохімії, глікобіології, клінічної біохімії та радіобіології.
На основі отриманих у роботі даних зроблено припущення про важливу роль гепарансульфат та гіалуронат-зв’язуючих білків у контролі проліферації та міграції окремих популяцій нервових клітин за рахунок регуляції генної експресії під час нормального розвитку мозку та в умовах впливу патогенних чинників (радіації у низьких дозах, гіперфенілаланінемії, материнського гіпотиреозу, післяопераційного болю). Дані про статеві розбіжності в рівні глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків свідчать про існування механізму гормональної регуляції експресії даних білків у мозку статевозрілих щурів, або взаємодії цих білків із глікозаміноглікановим лігандом. Установлені закономірності змін рівню загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків у мозку дорослих щурів за умов розвитку біологічних ефектів, спричинених дією одноразового та фракціонованого опромінення у малій дозі. Очищені мембраноасоційовані гепарин-зв’язуючі білки з мозку новонароджених щурів та мембранні гіалуронат-зв’язуючі білки з ембріонального мозку людини за нормальних умов. Запропоновані в даній роботі підходи до кількісного та якісного виявлення гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих білків можуть бути використані в лабораторній біохімічній практиці.
Результати досліджень входять до програм курсів лекцій та лабораторних робіт із біохімії, клінічної біохімії для студентів біолого-екологічного факультету та медичного факультету ДНУ. Отримані дані оптимальних умов для проведення твердофазного вуглевод-ферментного мікроаналізу впроваджені до ЦНДЛ Дніпропетровської державної медичної академії.
Особистий внесок здобувача. Основні ідеї роботи висунуті автором самостійно. Дисертантом було самостійно проведений аналіз літературних даних, проведені експериментальні дослідження та статистична обробка результатів, частина експерименту проведена сумісно з аспіранткою Білоусовою Т.В. (гл. 5, 6.2 та 6.3). Обговорення методології та отриманих результатів проведені сумісно з науковим консультантом. У роботах, що опубліковані у співавторстві, відображені результати, що отриманні при особистій участі автора у проведенні експерименту та обговоренні результатів. У дисертації не використовувалися ідеї або розробки, які належать співавторам публікацій.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були подані особисто на щорічних наукових підсумкових конференціях Дніпропетровського національного університету (Дніпропетровськ, 1994-2003), 15th Meeting of the International Society for Neurochemistry (Кіото, Японія, 1995), 23rd and 24th Meetings of FEBS (Базель, Швеція, 1995, Барселона, Іспанія, 1996), Second Biennial Research Conference on “Molecular biology of cellular interactions” (Ленгрис, Німеччина, 1995), 8th Sardinian Conference on Neuroscience (Кагліарі, Італія, 1995), 11th and 14th Biennial Meetings of the International Society for Developmental Neuroscience (Тампере, Фінляндія, 1996 та Сідней, Австралія, 2002), IV та V Міжнародних конференціях “Франція й Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур” (Дніпропетровськ, 1997, 1998), 16th ISN/28th ASN Meeting (Бостон, США, 1997), YII та VIII Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1997 та Чернівці, 2002), III та IV з’їздах по радіаційним дослідженням (Москва, Росія, 1997 та 2001), II та III з’їздах Українського біофізичного товариства (Харків, 1998 та Львів, 2002), IV European Research Conference: Neural Mechanisms of Learning and Memory (Аквафреда ді Маратеа, Італія, 1998), Forum of European Neuroscience (Берлін, Німеччина, 1998), Twelfth General Meeting of the European Society for Neurochemistry (Санкт-Петербург, Росія, 1998), Annual Meeting of the Canadian Pain Society (Саскачеван, Канада, 1998), 10th European Congress of Anaesthesiology (Франкфурт на Майні, Німеччина, 1998), 4th International Congress In The Decade of the Brain (Гданськ, Польща, 1999), 15th National Meeting of British Neuroscience (Лондон, Англія, 1999), Fifth IBRO World Congress of Neuroscience (Єрусалим, Ізраїль, 1999), 17th ISN/13th ESN Meeting (Берлін, Німеччина, 1999), Forums of European Neuroscience (Брайтон, Англія, 2000 та Париж, Франція, 2002), Joint Meeting of the ISN/ASN (Буенос Айрес, Аргентина, 2001), International Symposium Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems (Київ, 2001), III з’їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003).
Публікації. Результати досліджень подані у 25 статтях (7 із них одноособові) та 35 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних та закордонних журналах та матеріалах з’їздів та конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 294 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, основної частини, що містить огляд літератури, розділ матеріалів та методів досліджень, розділів результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення результатів дослідження, висновки, 2 додатки. Робота ілюстрована 12 таблицями та 87 рисунками. Перелік використаної літератури включає 447 найменувань цитованої літератури.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури
Огляд літератури присвячений опису факторів, що забезпечують міжклітинні взаємодії, наведена характеристика сімейства глікозаміногліканів, систематизовані глікозаміноглікан-зв’язуючі білки, що були ідентифіковані у нервовій тканині, представлені докази забезпечення важливих функцій у нервовій системі за рахунок глікозаміноглікан-зв’язуючих білків та можливих порушень за умов впливу шкідливих чинників.
Матеріали та методи дослідження
Біологічні об’єкти. Модельні експерименти проводились на лабораторних щурах лінії Вістар та білих нелінійних щурах, всього 342 тварини. Тварини знаходилися у стандартних умовах. Головним об’єктом дослідження був головний мозок щурів та людини різного віку. Також для досліджень використовувалися сироватка крові, селезінка, печінка, тканини скелетних та серцевих м’язів щурів та людини. Декапітацію тварин проводили під легким наркозом. Для імунізації та отримання специфічних поліклональних антитіл використовували 4 дорослих кроля Шиншила. Тканини людини (аутопсийний матеріал) від 24 жертв дорожньо-транспортних катастроф були надані обласною лікарнею ім. Мечнікова м. Дніпропетровська. Головний мозок з абортивного матеріалу був наданий міською лікарнею №9 м. Дніпропетровська. Надання та використання біологічного матеріалу людини проводилось згідно Хельсінкської декларації прав людини. Об’єктом дослідження морфогенезу нейронів була моношарова культура нейронів гіпокампу щура.
Хімічні реагенти. В роботі використовувалися особливо чисті реагенти фірм Sigma (USA), Fluka (Switzerland), Serva (Germany), Medix Biochemica (Finland), Boehringer Mannheim Biochemica (Germany), Medac (Germany), Serotec (Germany), DAKOPATS (Denmark), Affaniti (Nottingham, UK), Реагент (Дніпропетровськ, Україна). Лабораторний пластик та концентруючи патрони були придбані у фірм “Amicon” (USA) та “Nunc” (USA).
Для визначення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків, що різняться за місцем локалізації були отримані різні фракції, що містили водорозчинні, мембраноасоційовані, мембранні та екстрацелюлярні/цитоскелетні білки за допомогою диференціального центрифугування та застосування солюбілізації білків за участю NaCl, тритона Х-100 та сечовини, відповідно (Березін, 1989). Вихідний буфер містив трис – 0,25 мМ (рН7,4), ЕДТО – 1 мМ, дитіотрейтол – 2 мМ, ФМСФ – 0,2 мМ, NaN3 – 3 мМ.
Загальна кількість глікозаміногліканів оцінювалася за методом Gold (1981).
Кон’югати гепарансульфату та гіалуронової кислоти з ферментом пероксидазою хрону готували за методикою перйодатного окислення (Dolzhenko, 1994). Для визначення загальної гепарин- або гіалуронат-зв'язуючої активності білків у різних біологічних фракціях був використаний твердофазний вуглевод-ферментний аналіз (Dolzhenko, 1994; Ushakova, 1995). Його особливість полягає у використанні кон’югату, що складається з глікозаміноглікану з нашитою на нього ферментною міткою. Аналіз проводили у плоскодонних 96-лункових планшетах. Дані калібрувальних вимірювань використовували для перерахунку екстинції у кількість (нг) зв’язаного з білками відповідного глікозаміноглікана у співвідношенні до 1 мг загальної кількості білка (ЗБ) у пробі. Вимірювання екстинції проводили на спектрофотометрі “Anthos 2010”.
Загальну кількість білку визначали за методом Бредфорд (1985).
Очистку гіалуронат-зв’язуючих білків проводили за допомогою афінної хроматографії на кількох типах носіїв (залежно від активації сефарози та засобу приєднання гіалуроната до неї). Оптимальні умови для зв’язування гіалуронату до специфічних білків були підібрані за допомогою твердофазного вуглевод-ферментного методу. Контроль за ходом хроматографії проводили спектрофотометрично.
Гепарин-зв’язуючі білки з мозку виділяли за допомогою афінної хроматографії, що проводили на гепарин-сефарозі (Sigma).
Для подальших етапів очистки білків використовували також іонообміну хроматографію на ДЕАЕ-сефадексі А-50 (Pharmacia) та гель-фільтрацію на сефакрилі S-300 (Pharmacia).
Дослідження поліпептидного складу гепарин- та гіалуронат-зв’язуючих білків проводили за методом електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію за Леммлі (1970).
Серед білків, що були розділені під час електрофорезу, специфічні білки визначали методом імуноблотингу (Stott, 1989) з використанням моноспецифічних антисироваток до N-CAM, фібронектину, вітронектину, тенасцину, антитромбіну III, CD44. Паралельно, гель після електрофорезу фіксували у розчині ТХО – 10% та фарбували іонами срібла (Merril, 1986).
Поліклональна антисироватка проти N-CAM була отримана шляхом імунізації кролів чистим білком, що був люб’язно наданий Елізабет Бок (лабораторія білка Копенгагенського університету). Антисироватка детально охарактеризована (Ushakova, 1995). Інші антисироватки були придбані у Sigma (USA), Serva (Germany), Boehringer (Germany), DAKOPATS (Denmark), Affaniti (Nottingham, UK),
Непрямий та конкурентний варіанти імуноферментного аналізу використовували для визначення кількості специфічних білків (Фримель, 1987). Кількість гормонів Т-4, ТСГ у сироватці крові визначали з використанням імуноферментних тест-наборів Medix Biochemica (Фінляндія).
Локалізацію гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих білків у мозку ссавців визначали гістохімічними засобами (Bullock and Petrusz, 1985) із використанням напівтонких парафінових зрізів мозку та специфічних кон’югатів (Ushakova, 1997). На паралельних зрізах проводили забарвлення за допомогою антитіл до ЯАКП (ядерного антигену клітинної проліферації) (Sigma), місця специфічного зв’язування антигену на зрізах виявляли за допомогою біотин-стрептовідин-пероксидазного комплексу. Візуальну оцінку гістологічних зрізів проводили при застосуванні світлового мікроскопа Axioplan (Zeiss). Морфометрію проводили при збільшенні х400 за допомогою вставленого калібрувального окуляра, сполученого зі стандартним мікрометром.
Дослідження морфогенезу нейронів проводили з використанням культури нейронів гіпокампу (Wilcox et al., 1994) та імуноцитохімічних засобів із використанням антитіл проти N-CAM та протеїну А, кон’югованого з частками колоїдного золота розміром 20 нм (Sigma). Оцінку проводили за допомогою електронного мікроскопа JEM-100CX (JEOL). Електронні мікрофотографії обробляли за допомогою програми UTHSCSA ImageTool (США). Розподіл молекул на плазматичній мембрані нейронів розраховували за допомогою комп’ютерної моделі Ніконенко (2000).
Для статистичної обробки даних використовували t-тест Ст’юдента, U-тест Манн-Уітні, та тест Колмогорова-Смірнова (Лакин, 1990).
Для дослідження впливу шкідливих чинників різного походження на глікозаміноглікан-зв’язуючу властивість білків мозку були відтворенні декілька експериментальних моделей.
Модель впливу інкорпорованого I-131 на розвиток щурів була відтворена згідно рекомендації Рейллі (Reilly, 1986). Самицям вводився I-131 (Київ) внутрішньом'язово у дозі 5,5 МБк (150 мкКі) в 0,05 мл фізіологічного розчину, що відповідає дозі поглиненої радіації в 0,5 Гр. Самицям контрольної групи вводився фізіологічний розчин 0,05 мл, в аналогічних умовах Терміни введення обирали відповідно до критичних періодів ембріогенезу.
З метою дослідження впливу тотального іонізуючого опромінення низької інтенсивності на мозок дорослих тварин були створені моделі одноразового й фракціонованого опромінення. Тварини опромінювали рентгенівськими променями в дозі 0,25 Гр. за допомогою установки РУМ-17 одноразово (напруга 150 кВ, струм 6 мА, фільтри Cu 2,0 мм, фокусна відстань 168 см, потужність дози 0,26 сГр/хв) та фракціоновано по 0,01 Гр/добу протягом 25 діб на установці РУМ-17 (фокусна відстань 181 см, решта параметрів – такі самі).
Експериментальна модель гіперфенілаланінемії створювалася за схемою Matsuo та Hommes (1988). Стан гіперфенілаланінемії отримували за рахунок ін’єкцій (двічі на добу з інтервалом 12 год.) фізіологічного розчину, що містив L-фенілаланін – 0,13 М та DL-α-метилфенілаланін – 0,06 М (Research Organics, Cleveland, Ohio, USA) по 0,2 мл/10 г ваги тіла у перші чотири ін’єкції, та по 0,4 мл/10 г ваги тіла у решті ін’єкцій. Тваринам контрольної групи вводився еквівалентний об’єм фізіологічного розчину.
Експериментальна модель післяопераційного болю була відтворена згідно Brennan (1996). Поведінкові реакції тварин визначалися за тестом у “відкритому полі” (Буреш, 1991).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Визначення оптимальних умов зв’язування глікозаміногліканів специфічними білками мозку in vitro
Синтезовані специфічні кон’югати, гепарансульфату (або гіалуронату), зв’язаних із пероксидазою хрону. Установлені оптимальні умови використання цих кон’югатів для кількісного та якісного аналізу загальної гепарансульфат та гіалуронат-зв’язуючої активність компонентів мозку. Для дослідження рівня загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої властивості білків мозку за допомогою твердофазного вуглевод-ферментного та гістохімічного аналізу насамперед був визначений характер впливу основних чинників, які застосовуються під час екстракції білків та їх аналізу. А саме, був визначений вплив рН середовища, іонної сили та детергентів, що можуть змінювати афінність білків до глікозаміногліканів in vitro.
Було визначено, що оптимальним показником рН буфера для сорбції гіалуронат-зв'язуючих білків до полістиролу мікротитрувальних планшетів, є 5,6. Для гепарансульфат-зв’язуючих білків оптимальним є діапазон рН 5,6-6,8 (рис.1).
Мембраноасоційовані та сечовинорозчинні білки мозку мають найбільшу активність зв'язування гепарану за умов кислого значення рН 3. Із зростанням водневого показника від 5 до 10 гепарансульфат-зв’язуюча активність мембраноасоційованих білків поступово знижується (рис. 2.А). У фракції сечовинорозчинних білків спостерігається додатковий пік гепаран-зв’язуючої активності в області фізіологічних значень рН (рис. 2.Б).
Рис. 2. Залежність загальної гепарансульфат-зв’язуючої активності білків мозку новонароджених щурів від рН середовища in vitro:
А - мембраноасоційовані білки; Б - сечовинорозчинні білки (n=12).
Оптимальним значенням рН середовища для зв’язування гіалуронату специфічними білками з різних білкових фракцій мозку як новонароджених, так і дорослих щурів є область 5,0 (рис. 3). Така сама тенденція спостерігається і для білків виділених із мозку людини.
| 
