|
Національна Академія Наук України
Iнститут фізіології ім. О. О. Богомольця
Лішко Поліна Валеріївна
УДК 612.82:577.1
роль гідрофобних взаємодій у модуляції nmda
рецептор- керованих іонних каналів в нейронах гіпокампа щура
03.00.02 - біофізика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2000
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран
Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук
Кришталь Олег Олександрович
зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інститута фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, заст. директора Міжнародного центра молекулярної фізіології при НАН України Веселовський Микола Сергійович
Доктор біологічних наук, зав. відділом нейрохімії Інститута фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України Малишева Маргарита Костянтинівна (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України)
Провідна установа: Національний Університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ
Захист відбудеться "22" лютого 2000 р. о "14" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.
Автореферат розісланий "19" січня 2000 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук Сорокіна- Маріна З. О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Нейромедіаторна система збуджуючих амінокислот (ЗАК) є основною системою передачі швидкого синаптичного збудження в центральній нервовій системі ссавців. Рецептори збуджуючих амінокислот відіграють ключову роль в чисельних нормальних і патологічних процесах та поділяються на дві великі групи– метаботропні і іонотропні, кожна з яких включає в себе різні типи {Krogsgaard-Larsen and Hansen, 1992}. До іонотропних відносяться: рецептори N-метил-D-аспарагінової (NMDA), 2-аміно-3-(3-гідрокси-5-метил-4-ізоксазоліл) пропіонової (AMPA) і каінової кислот, що представлені, в свою чергу, кількома підтипами. Родина метаботропних рецепторів містить вісім підтипів і, на основі даних нейрохімії, фармакології і молекулярної біології, поділяється на три групи {Hollmann & Heinemann, 1994}.
Найбільш детально вивченими є рецептори NMDA- типу. Відомо, що NMDA- рецепторний комплекс відіграє суттєву роль у процесах навчання і пам’яті. NMDA- рецептори є мішенню для терапевтичних заходів при таких хронічних дегенеративних захворюваннях як хвороба Альцгеймера, хорея Гентінгтона, синдром Паркінсона і нейронні пошкодження при ВІЛ-2 {Foster & Fagg, 1987}, {Danysz, Parsons, et al., 1995}.
Блокатори NMDA- рецепторів можуть використовуватись в терапії для лікування від опіатної та морфінової залежності {Bespalov, Dumpis, et al., 1994}, {Wolf & Jeziorski, 1993}. На жаль, високоафінним блокаторам NMDA- рецепторів притаманна сильна нейротоксичність, тому їх використання в терапії є неможливим. Показано, що ефективні нейропротекторні агенти повинні мати низьку спорідненість до NMDA- рецептора і швидко звільняти іонний канал при фізіологічному миттєвому збільшенні концентрації глутамату в синаптичній щілині до мілімолярних концентрацій.
Деякі антагоністи глутаматних рецепторів знаходились на клінічних випробуваннях як протисудомні та протиішемічні засоби. Однак, хоча ці сполуки і виявили чималі нейропротекторні властивості, значна кількість побічних ефектів ускладнює їх клінічне використання. В зв'язку із цим зросла зацікавленість до сполук, що діють на різні підтипи рецепторів збуджуючих амінокислот і проявляють властивості часткових агоністів {Kew, Trube, et al., 1998}, {Ebert, Madsen, et al., 1996}. Саме тому пошук нових лігандів NMDA-рецепторів є досить актуальною задачею.
Модельним об’єктом таких досліджень може служити гіпокамп, оскільки він є місцем проекції великої кількості глутаматергічних нейронів, і, відповідно, концентрація NMDA- рецепторів в даній структурній одиниці головного мозку є досить високою.
Дослідження проводилися відповідно із планами наукової роботи відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
Мета і задачі дослідження: Метою роботи було з’ясування механізмів взаємодій похідних імідазол-4,5-, піразол-3,4-дикарбонових кислот і нової бензопіранової сполуки- ансекуліна (KA-672) із NMDA- рецептор- керованим іонним каналом, а також дослідження ролі гідрофобних взаємодій в модуляції NMDA- рецептора у пірамідних нейронах гіпокампа щура.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
1) Використовуючи метод внутрішньоклітинної перфузії у конфігурації “ціла клітина” визначити електрофізіологічні характеристики взаємодії похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот з NMDA- рецептором.
2) Виділити серед ряду похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот речовини, що мають найбільшу блокуючу здатність і порівняти їх фармакологічні властивості із структурними особливостями.
3) Визначити механізм взаємодії ансекуліна (КА672) з NMDA- рецепторним іонофорним комплексом.
4) Визначити роль гідрофобних взаємодій в модуляції NMDA- керованих іонних каналів.
Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі вивчено вплив нових агоністів і антагоністів NMDA-рецептора, похідних імідазол-4,5-, піразол-3,4-дикарбонових кислот і нового блокатора іонного каналу NMDA- рецептора гідрохлорида ансекуліна (KA672.НСl). Виявлено основні характеристики взаємодії KA672 із рецепторами NMDA- типу. На підставі даних електрофізіологічного скринінгу похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот висловлено припущення про існування в глутамат-розпізнаючому центрі NMDA- рецептора ліпофільної ділянки, з якою може взаємодіяти ліпофільний замісник молекули похідної. Наявність такої взаємодії веде до зміни і навіть інверсії агоністичних властивостей даної похідної.
Теоретичне та практичне значення роботи. Теоретичне значення результатів полягає в тому, що отримані принципово нові відомості стосовно структури і функції агоністів і антагоністів глутаматних рецепторів. Знайдені нові антагоністи можуть бути використані в ролі зондів при дослідженні вибірковості взаємодії лігандів із окремими підтипами NMDA- рецепторів. Практичне значення результатів роботи полягає в тому, що досліджені речовини, а саме гідрохлорид ансекуліна (КА672.НСl), можуть використовуватись в клінічній медицині і служити прототипом для створення більш ефективних блокаторів NMDA-рецепторів. Зокрема, КА672 знаходиться на другій фазі клінічних досліджень.
Особистий внесок. Автором особисто були виконані всі електрофізіологічні експерименти. В розробці концепцій роботи приймали активну участь також інші співавтори публікацій.
Особлива подяка док. біол. наук Л.Б. Піотровському за надані досліджувані речовини, результати експериментів in vivo і цінні наукові зауваження.
Апробація роботи. Основні положення роботи були викладені і обговорені на V Всеросійському конгресі "Человек и лекарство" (Москва, 1998), Всеросійській науковій конференції "От materia medica к современным медицинским технологиям" (С.- Петербург, 1998), Міжнародному симпозіумі “Symposium of Pathology of Cerebral Neurotransmission” (Magdeburg, 1997), Всеросійській конференції “Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии” (С.-Петербург, 1999), Міжнародній науковій конференції “Joint Meeting of ISN and ESN” (Berlin, 1999), семінарі Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (Київ, 1998).
Публікації. Результати роботи опубліковані в трьох наукових статтях і тезах п’яти докладів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 232 найменувань. Робота викладена на 133 сторінках, містить 5 таблиць та ілюстрована 23 рисунками.
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єкт досліджень. Дослідження проводилися на ізольованих нейронах гіпокампа щура лінії Вістар віком 14-16 діб. Гостроізольовані нейрони одержували за допомогою стандартних прийомів із застосуванням ферментативної обробки тканини протеазою з Aspergillus oryzae {Kiskin N.I., Tsyndrenko, et al., 1991}. Із зрізу гіпокампа виділяли stratum pyramidale. Ізольовані пірамідні нейрони отримували при багаторазовому пропусканні stratum pyramidale через скляні піпетки (діаметром від 0.5 до 1 мм) у безмагнієвому розчині Рінгера (РР) (у мМ): 130 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 20 N-2-гідроксиетилпіперазин-N'-2-етансульфонової кислоти (HEPES), 10 глюкози; pH доводили 1 М розчином NaOH до 7.4.
Реєстрація хемоактивованих трансмембранних струмів. Реєстрація іонних струмів через мембрану нейронів проводилася методом внутрішньоклітинної перфузії {Kostyuk, Veselovsky, et al., 1981} із використанням скляних мікропіпеток, які мали опір 2-5 МОм {Hamill et al., 1981}. Піпетки заповнювалися внутрішньоклітинним розчином (у мМ): 100 NMDG-фтор, 10 тетраетиламоній хлорид (TEA-Cl), 20 Tris-HCl, pH 7.2, тонка частина кінчика заповнювалася розчином 130 мМ Tris-HCl. В експериментах по дослідженню властивостей КА-672 використовувався інший внутрішньоклітинний розчин (в мМ): 100 KF, 20 Tris-HCl, pH 7.2. Для отримання вольт- амперних характеристик NMDА- активованих струмів внутрішньоклітинний розчин модифікували (у мM): 104 NaF, 16 Tris-HCl та 8 TEA-Cl, pH 7.2. Як позаклітинний розчин використовувався безмагнієвий розчин Рінгера (РР).
Піпетку з нейроном вміщували в отвір V-образно зігненої скляної трубки, що занурена у позаклітинний розчин. Програмно кероване відкривання клапана дозволяло швидко міняти розчин в V-образному коліні трубки. Синхронно з відкриванням клапана проводився запис струму, що протікає через мембрану досліджуваного нейрона. Використання пристрою “плигаючий столик” (виробництво “Pharma Robot”, Київ) у наших експериментах дозволяло провести швидку зміну позаклітинних розчинів за 15-20 мсек. При цьому тривалість аплікації речовин складала загалом 4-5 секунд і була лімітована часом, необхідним для перенесення системи піпетка-трубка в інше заглиблення для аплікації. На всіх наведених нижче кривих початок аплікації агоністів відповідає початку хемоактивованих іонних струмів. Для отримання NMDA- активованих відповідей використовувався розчин РР, який містив додатково L-аспарагінову кислоту і гліцин. У разі дослідження дії антагоністів неNMDA- типа використовувався розчин РР, що містив 2 мМ MgCl2 і 300 мкМ АМРА. АМРА аплікували на фоні потрібної концентрації досліджуваної сполуки. Всі ефекти речовин в даній роботі були зворотними. Експерименти виконувалися при кімнатній температурі (19–24 оС). Всі реактиви, які використовувалися в роботі, були вироблені фірмою Sigma Chemical Co. (St. Louis, США). Вода для розведення розчинів була деіонізована на апараті Super-Q фірми Millipore і мала питомий опір 10-12 МОм* см. Похідні імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот були люб'язно надані доктором біол. наук Л. Б. Піотровським. KA-672 HCl було люб'язно надане Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. (Німеччина).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Фармакологічні характеристики похідних імідазол-4,5- і піразол- 3,4- дикарбонових кислот. Раніше було показано, що 1-метил-, 1-етил- і 1-бензилпохідні імідазол-4,5-дикарбонової кислоти (ІЕМ) при прямому введенні в мозок мишам виявляють властивості часткових агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот {Ryzov, Lapin, et al., 1988} Тому ми вивчили дію цих і деяких інших похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот (ІДК і ПДК) на струми, що активуються NMDA в ізольованих нейронах гіпокампа щура (рис 1. і табл.1).
Рис 1.Структура похідних імідазол-4,5- (ліворуч та середина) та піразол-3,4- дикарбонових кислот (праворуч).
При цьому найбільшу судомну активність, як видно з таблиці, виявили речовини ІЕМ-1574 та ІЕМ-1808. Інші похідні значно ослабляли власний судомний ефект NMDA, що свідчить про наявність у них активності NMDA- антагоніста.
Таблиця 1. Порівняння судомної активності імідазольних похідних при їх інтрацеребровентрикулярному (іцв) введенні разом з 170 мг/кг NMDA мишам з їх дією на NMDA- активовані струми нейронів гіпокампа щура. ↑ і ↓- відповідно посилення і ослаблення судомного ефекту в порівнянні з власним судомним ефектом NMDA. Ант- антагоніст.
В експериментах на ізольованих нейронах піразол-3,4-дикарбонова кислота (ІЕМ-1375) була здатна активувати мембранну провідність, тобто виявила властивості агоніста NMDA- рецепторів, однак заміщення в положенні 1 циклу атома водню на метильну групу призвело до появи у такої сполуки (ІЕМ-1575) активності NMDA- антагоніста (рис. 2А).
Серед похідних імідазолу спостерігалася подібна картина. Так, дві 1-заміщені імідазольні похідні (ІЕМ-1573 і ІЕМ-1442) були неактивні, тоді як подовження вуглеводневого ланцюга замісника у першому положенні імідазольного кільця від пропіла до бензила (відповідно ІЕМ-1791 і ІЕМ-1441) виявило сполуки з властивостями антагоністів NMDA- рецепторів (рис. 2Б і табл. 2).
Рис. 2 Блокуюча дія 1мM ІЕМ- 1575 (1-метилпохідної ПДК) (А) та ІЕМ-1791 (1-пропілпохідної ІДК) (Б) на активовану L-аспартатом NMDA- відповідь. Тут і далі: підтримуваний мембранний потенціал -80мВ. Вміст гліцину в розчинах 10мкМ, L-аспартату- 50мкМ.
Як видно з таблиці 2 та рисунку 2Б IEM-1791 у концентрації 1мМ пригнічував активований іонний струм на 21.3±1%, а та ж сама концентрація IEM-1441- на 16.5 ± 6%. На рисунку 6 наведена залежність дози- ефекту для пропільної похідної ІДК (IEM-1441). Значення IC50 для даної похідної виміряне на 3 клітинах при підтримуваному мембранному потенціал -70мВ і концентраціях аспартату (50мкМ) та гліцину (10мкМ) становило 2.67± 0.03мM, а коефіцієнт Хілла k= 1.5± 0.1.
Таблиця 2. Пригнічення NMDA- відповіді похідними ІДК та ПДК (концентрації антагоністів 1 мМ). I - амплітуда пригніченої відповіді, I0 - амплітуда контролю.
Серед 2-заміщених ІДК тільки 2-метил-похідна (IEM-1574) була NMDA- агоністом, тобто була здатна сама активувати мембранну провідність за відсутністю аспартату.
Рис. 3 Пригнічення NMDA- активованого струму (А) 1 мM ІЕМ- 1808 (2-етил-похідна ІДК); (Б) 1мM ІЕМ- 1795 (2-пропіл- похідна ІДК).
Як і раніше, подовження радикалу-замісника (в ряді 2-етил-, 2-пропіл та 2-феніл аналогів; IEM-1808, IEM-1795 та IEM-1797, відповідно) призводило до появи у сполуки властивості NMDA- антагоніста. Так, 1мМ IEM-1808 пригнічував активовану відповідь в середньому на 63.1±10%, IEM-1795 в тій самій концентрації на 77.3±4%, а 1мМ IEM-1797 відповідно на 70.4±17.5% (див. табл. 2 та рис.3).
Рис. 4 Порівняння впливу IEM-1441 (1-бензил- ІДК) та IEM-1797 (2-феніл-ІДК) на NMDA- індуковані струми. Розчин містив 50мкM L-аспартату і 10мкM гліцину. Підтримуваний потенціал -70мВ. Дані отримані на 3 нейронах гіпокампа. I і I0 – максимальні амплітуди струмів в присутності антагоніста (ІЕМ-1797 або ІЕМ-1441) і в контрольних розчинах відповідно, IC50- концентрація блокатора, що пригнічує відповідь на 50%.
Похідна IEM-1797 (2-фенілзаміщений аналог) був антагоністом рецепторів як NMDA-, так і неNMDA- типа (із значенням IC50= 0.21± 0.03мM для NMDA- активованих відповідей; див. рис.4). У разі впливу на неNMDA- рецептори, 1мМ ІЕМ-1797 пригнічував АМРА- відповідь, що активується аплікуванням 300 мкМ АМРА при підтримуваному потенціалі -90мВ до 76.4 ± 3.1 % (рис. 5).
Рис. 5 Пригнічення неNMDА- відповіді ІЕМ-1797 (2-феніл-похідною ІДК). Концентрації АМРА 300 мкМ, підтримуваний потенціалі -90 мВ.
Пригнічення ІЕМ–1797 NMDA- активованих струмів в залежності від підтримуваного потенціалу показано на рис. 6.
Рис.6 NMDA- активовані струми індивідуальної клітини в контрольному розчині (300мкМ L-аспартату і 10мкМ гліцину) і в аналогічному розчині з блокатором (плюс 500мкМ ІЕМ-1797), виміряні при підтримуваних потенціалах від -120 до +40 мВ, а також вольт-амперні характеристики таких відповідей. Вісь абсцис- Vм (підтримуваний мембранний потенціал, у мВ); вісь ординат- пА (пікоамперна шкала).
Дія похідних ІДК, що виявляють властивості антагоністів, пояснюється конкурентним зв`язуванням похідних з глутамат- розпізнаючим центром рецептора. На рис.7 представлений характерний паралельний зсув кривих доза- залежних відповідей на L-аспартат. Значення ЕС50 у контрольному розчині дорівнює 48.3 ± 5.4 мкM, а в присутності 500мкM ІЕМ-1797 ЕС50 зростає до 62.6 ± 4.2 мкM. Одержаний зсув значення EC50 після додавання IEM-1797 дає змогу вважати IEM-1797 конкурентним антагоністом рецепторів NMDA- типу.
Рис.7 Криві доза- залежних відповідей на L-аспартат, отримані в контрольному розчині і в присутності 500мкM NMDA- антагоніста. Підтримуваний потенціал – -90 мВ. I і I0 – максимальні амплітуди струмів при тестових концентраціях L- аспартату і при його найбільшій концентрації 10мM відповідно; ЕС50- концентрація агоніста, що активує 50% від максимальної відповіді; k- коефіцієнт Хилла (в обох випадках є близьким до 1). Дані 3 нейронів.
Таким чином, можна констатувати, що між даними, одержаними в експериментах in vivo та in vitro існують очевидні розходження. Логічно вважати, що це обумовлене специфікою експериментів in vivo, в яких досліджені сполуки взаємодіють не тільки із пірамідними нейронами гіпокампу, але й з елементами інших мозкових структур. Одержані на нейронах гіпокампа дані вказують на зміну типу активності досліджених речовин після введення ліпофільного замісника в частину молекули, що позбавлена фармакофорних груп (тобто груп, що забезпечують її взаємодію із рецептором). Так, заміна агоністичної активності NMDA- типа (IEM-1574) на антагоністичну (IEM-1808) є наслідком подовження алкілового замісника в позиції 2 молекули ІДК від метилу (IEM-1574), етилу (IEM-1808), до пропілу та фенілу (IEM-1795 і IEM-1797). В даному випадку остання сполука набула властивостей NMDA- антагоніста та почала взаємодіяти із рецепторами неNMDA- типа.
Характеристика взаємодії хлорида і тартрата КА672 з нейронами гіпокампа.
1. Селективність КА672 по відношенню до рецепторів NMDA- типа. Другою частиною наших досліджень було визначення фармакологічних характеристик двох солей ансекуліна (рис. 8А): хлорида та тартрата. У дослідах по виявленню впливу КА672.НCl на різні трансмембранні струми у нейронах гіпокампа, ансекулін продемонстрував значну селективність до рецепторів саме NMDA- типу. Так, при аплікації 10мкМ КА672.HCl разом із 0.5мМ АМРА не було помітно будь-яких змін в жодному з трьох досліджених нейронів в АМРА- активованої провідності порівняно з контролем (відсутність пригнічення АМРА- індукованої провідності: I/I0= 102 ± 12%, де I та I0 –максимальні амплітуди відповіді у розчині з блокатором і у контрольному розчині). Подібна ситуація склалася у випадку з ТТХ- чутливими Na+ струмами (I/I0= 97.4 ± 2.5%). Але у випадку з рецепторами NMDA- типу 10мкМ КА672.HCl спричиняло значне зменшення провідності, активованої 1мМ L-аспартату і 10мкМ гліцину (рис. 8Б).
Також була виявлена відсутність механізму “use-dependence” і відсутність зміни кінетики відповідей протягом тривалої аплікації блокатора. Так, після витримки клітини в 10мкМ розчині КА672.HCl протягом 5 хвилин, міра пригнічення контрольної відповіді залишилася такою ж, як і після 5 секунд інкубації в розчині блокатора (див. рис. 8В).
Рис.8 КА672.НСl оборотно блокує відповіді в ізольованих нейронах гіпокампа. (А) Будова 7-метокси-6-[3-[4-(2-метоксифеніл) піперазин- 1-іл] пропокси] -3,4-диметил-2H-1-бензопіран-2 гідрохлориду (KA-672), нової синтезованої сполуки, що структурно подібна кумаринам рослинного походження (Б) NMDA- відповідь, що активується 1мМ L-аспартату на фоні 10мкМ гліцину, оборотно блокується 10 мкМ КА672.НСl. (В) Поєднання кривих з частини А: відсутність зміни амплітуди відповіді протягом 5 хвилин аплікації блокатора у порівнянні з амплітудою відповіді після 5 секунд аплікації антагоніста (ліворуч). Праворуч: нормування кривих свідчить про відсутність зміни кінетики відповіді.
А, Б- загальне калібрування. Підтримуваний потенціал дорівнював -90мВ.
Характеристики часових констант спаду відповіді (τ) в обох випадках були такі: τKA-672(5 сек)/τконтроль= 1.1 ± 0.2 і τKA-672(5 хвилин)/τконтроль=0.9 ± 0.1. Де τKA-672(5 сек) і τKA-672(5 хв) –характеристики констант часу спаду NMDA- відповідей в розчині 10 мкМ KA-672 HCl, виміряних відповідно після 5 секунд і 5 хвилин з початку інкубації нейрона у розчині блокатора. τcontrol – часова константа спаду в контролі (3 клітини). Відсутність розбіжностей між даними значеннями констант свідчить про взаємодію КА672.HCl із закритим каналом NMDA- рецепторного комплексу, тобто механізм блоку КА672.HCl являє собою блок закритого каналу, позбавлений механізму “use-dependence”.
Подібні характеристики має інша соль ансекуліна- КА672.тартрат. Але на відміну від гідрохлорида ансекуліна, більш розчинний у фізіологічних розчинах КА672.тартрат має незначну афінність до NMDA- рецептора. Так, ефективність пригнічення тартратом NMDA- відповідей є слабкішою в 50 разів у порівнянні з гідрохлоридом.
2. Залежність блокування NMDA- відповіді від концентрації КА672.НСl. NMDA- відповіді реєструвалися в присутності 10мкМ гліцину і 1мM L-аспартату в контрольному і тестових розчинах (рис. 9). Значення IC50 при підтримуваному потенціалі -90мВ, близькому до потенціалу спокою, дорівнювало 20.1 ± 7.3мкM, а значення коефіцієнта Хілла, відповідно k= 0.3 ± 0.1 (3 клітини). Ми, на жаль, не змогли виміряти міру блокування КА672.НСl в концентраціях вищих за 50мкM через обмежену розчинність даного блокатора у фізіологічних водних розчинах.
Рис.9 Пригнічення NMDA- активованого струму різними концентраціями КА672.НСl. I і I0 – максимальні амплітуди відповідей у присутності антагоніста КА672.НСl і в контрольному розчині відповідно, IC50- концентрація блокатора, яка викликає 50% пригнічення відповіді. Концентрації L-аспартату– 1мМ, гліцину – 10 мкM.
3. Потенціалозалежність блокування NMDA-активованого струму. В експериментах на пірамідних нейронах КА672.HCl виявив властивості слабкого потенціалозалежного блокатора. На рисунку 10А показана залежність ступеня пригнічення відповіді від підтримуваного мембранного потенціалу. У інтервалі підтримуваних потенціалів від -80мВ до -20мВ міра блоку змінювалася, зменшуючись з деполяризацією мембрани нейрона. Статистичну достовірність потенціалозалежності блокування підтверджує також результат теста Стьюдента для 9 клітин при мембранних потенціалах (-80 і -20мВ), де р > 0.005. Потенціалозалежність іншої солі ансекуліна КА672 тартрата у порівнянні з гідрохлоридом була незначною (рис. 10Б).
| 
