|
ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМ. В.Н. КАРАЗІНА
ПОПІВНЕНКО Людмила Іванівна
УДК 577.352.4:611.018.51
РОЗРОБКА МЕТОДУ ТА ВИМІРЮВАННЯ МОДУЛЯ ЗСУВУ МЕМБРАН ЕРИТРОЦИТІВ
03.00.02 — біофізика
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фізико-математичних наук
Харків—2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу.
Офіційні опоненти:
- доктор фізико-математичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Сльозов Віталій Валентинович, Національний науковий центр “Харківський фізико-технічний інститут”, завідувач відділу (м. Харків);
- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, професор (м. Харків).
Провідна установа:
Київський національний університет ім. Т. Шевченка, кафедра біофізики (м. Київ).
Захист відбудеться ”_25”__05___ 2000 року о _1400__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд.7-4.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий “_24___”__04_____2000 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.
Актуальність теми. Реакція клітини на дію різних екстремальних факторів, як правило, супроводжується зміненням її форми чи розміру, тобто деформацією клітинної мембрани. Рівень і характер деформації, що виникає при цьому, та стійкість клітин до дії екстремальних факторів значною мірою визначаються модулями пружності мембрани. З іншого боку, як відомо з літератури, модулі пружності значно змінюються при різних хворобах людей і тварин. Зокрема, зниження здатності мембран еритроцитів деформуватися в мікрокапілярах кровоносної системи без утворення значної напруги в них перешкоджає виконанню їх головної функції – доставці кисню в периферійні частини організму. Саме тому вивчення механічних характеристик клітинних мембран, зокрема еритроцитів, є важливим як з погляду теоретичної біофізики, так і з точки зору прикладної медицини.
Існує декілька методів визначення модулів пружності клітинних мембран (методи всмоктування окремої клітини в мікрокапіляр, реєстрації півперіоду відновлення форми попередньо здеформованих клітин та ін.). Ці методи ґрунтуються на вимірюванні деформації окремої клітини в статичних умовах з використанням складної техніки для кіно- та фотознімання під мікроскопом. Вони є надзвичайно трудомісткими та тривалими. Значно простіше визначати пружні характеристики клітинних мембран динамічними методами, наприклад, по швидкості протікання визначеного об'єму суспензії клітини крізь мікрокапіляр з певними геометричними параметрами. Але такий підхід зараз неможливий через відсутність точної кількісної теорії процесу всмоктування клітинної суспензії крізь мікрокапіляр навіть найпростішої форми. Розробка теоретичної моделі, на котрій було б основано більш швидке та більш просте, ніж при існуючих методах, вимірювання модулів пружності клітинної мембрани, очевидно, є важливим не лише з теоретичної, а й з практичної точок зору, оскільки механічні характеристики клітин чутливі до їх морфофункціонального стану і тому їх визначення може бути основою для розробки діагностичних тестів щодо захворювань різного генезу.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалась у межах планової відомчої теми HДР ІПКіК HАH України "Побудова та експериментальна перевірка кількісної теорії кріоконсервування біоб'єктів", затвердженої постановою Бюро ВМББЕ і КФ Президіума HАH України 14.01.1996.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було створення фізико-математичної моделі процесу всмоктування суспензії еритроцитів людини у довгий циліндричний капіляр, діаметр якого не перебільшує розміру клітин, та теоретичне обґрунтування і розробка методу вимірювання модуля розтягу при сталій площі (модуля зсуву) мембрани еритроцита людини за часом протікання крізь цей капіляр певної кількості суспензії з відомим гематокритом.
Для досягнення сформульованої вище мети були вирішені наступні задачі:
- проведено аналіз динаміки змінення форми еритроцита людини у процесі його всмоктування у мікрокапіляр та визначено умови, при яких деформація клітинної мембрани відбувається без ізотропного розтягу.
- побудовано фізико-математичну модель процесу всмоктування еритроцита людини у мікрокапіляр і обчислено час проходження клітини крізь мікрокапіляр у залежності від перепаду тиску на ньому, в'язкості зовнішньоклітинного розчину, модуля зсуву клітинної мембрани, довжини та радіусу мікрокапіляра.
- теоретично обґрунтовано метод вимірювання модуля зсуву клітинних мембран еритроцитів людини шляхом вимірювання часу протікання певної кількості суспензії цих клітин з заданим гематокритом крізь циліндричний мікрокапіляр;
- експериментально продемонстровано можливість практичного здійснення запропонованого методу вимірювання модуля зсуву мембран еритроцитів людини на спеціально створеному з цією метою пристрої.
Hаукова новизна одержаних результатів. Створено нову фізико-математичну теорію процесу всмоктування еритроцитів людини у мікрокапіляр з діаметром, котрий не перебільшує характерний розмір клітини. Ця модель, на відміну від існуючих, дозволяє обчислити час протікання певного об'єму клітинної суспензії крізь циліндричний мікрокапіляр з заданими геометричними параметрами. Вперше теорію явища сформульовано на підставі аналітичних рішень. Обґрунтовано і практично здійснено на спеціально створеному з цією метою пристрої новий метод вимірювання модуля розтягу при постійній площі мембрани для еритроцита людини.
Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи можуть бути використані при створенні приладу для швидкого вимірювання механічних характеристик еритроцитів периферійної крові людини з метою діагностики захворювань крові та організму в цілому.
Особистий внесок здобувача. Обзор і аналіз літературних даних, теоретичні викладки та розрахунки, формулювання основних положень та висновків, які викладено в роботі, здійснено безпосередньо здобувачем. Співавтор статей по теоретичній частині роботи Гордієнко Є.О., який є науковим керівником дисертаційної роботи, приймав участь у постановці задач, обговоренні та трактовці отриманих результатів. Експериментальна частина роботи виконана безпосередньо автором дисертації при консультативній і методичній допомозі наукового співробітника ІПКіК HАH України Тодріна О.Ф.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися і обговорювалися на:
- ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 29 червня-5 липня 1998;
- Конференції молодих вчених ІПКіК HАH України, 25-26 травня, Харків, 1999;
- Symposium Theoretical Physics and Biology, 17-18 November, 1999, Kiev, Ukraine
Публікації: Результати дисертації опубліковано в чотирьох наукових статтях та двох тезах доповідей.
Структура та обсяг дисертації: Дисертація складається з вступу, чотирьох розділів, висновків. Повний обсяг дисертації складає 135 сторінок, 32 ілюстрації, з них 22 ілюстрації займають повні сторінки, 1 таблицю, 10 сторінок займає список використаних літературних джерел (116 найменувань).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету і задачі дослідження, визначено наукову новизну, практичну і теоретичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертації.
В розділі 1 викладено огляд літератури за темою дослідження. В ньому проаналізовано фактори, котрі впливають на деформуємість клітинних мембран, описано методи її визначення, а також результати експериментальних досліджень модулів пружності мембран еритроцитів за останні п’ятдесят років. На основі аналізу літературних даних обґрунтовано актуальність та перспективність теми дисертаційної роботи.
У розділі 2 наведено характеристику об’єктів та методів дослідження. Теоретична частина роботи виконана з використанням методів теорії пружності тонких оболонок при кінцевих деформаціях, гідродинаміки при малих числах Рейнольдса та математичної фізики. В експериментах використовувались еритроцити, що були отримані з крові здорових донорів. Для вилучення плазми, згустків, лейкоцитів та інших формених елементів кров відмивали в ізотонічному фізіологічному розчині (0.15 М NaCl + 5 mM фосфатного буферу) з pH 7.4.
Визначення модуля зсуву здійснювали шляхом всмоктування певної кількості суспензії у циліндричний капіляр, діаметр якого був меншим за характерний розмір клітини. Капіляр встановлювався у спеціальну ємкість, заповнену суспензією еритроцитів. Ємкість з еритроцитами була відокремлена гнучкою мембраною від ємкості з робочою рідиною, в якій знаходиться поршень, внаслідок переміщення якого у робочій рідині зростав тиск до визначеної величини. При зростанні тиску мембрана прогиналася, виштовхуючи суспензію еритроцитів з ємкості у капіляр. Об’єм суспензії еритроцитів, який пройшов крізь капіляр, розраховували по величині переміщення поршню, коефіцієнту стискування робочої рідини і зниженню тиску в системі. Оскільки об’єм робочої рідини на декілька порядків перевищував об’єм суспензії, яка продавлювалася крізь капіляр, зниження тиску в системі не перевищувало 5% від початкової величини. Тому вважалося, що дослідження проводилися при постійному тиску. Експерименти здійснювали за допомогою пристрою, який було розроблено та виготовлено співробітниками ІПКіК НАН України спільно з НПФ “Кріокон” (м. Харків). Статистична обробка результатів експериментів здійснювалася за загальновідомою методикою Ст’юдента-Фішера.
У розділі 3 описано фізико-математичну модель процесу всмоктування еритроцита людини у циліндричний мікрокапіляр, яку створено на підставі наступних припущень:
1) моделлю еритроцита є в’язкий однорідний розчин, оточений тонкою пружною оболонкою, що здібна деформуватися тільки шляхом розтягу при постійній площі з модулем зсуву M;
2) течія крізь мікрокапіляр вважається осесиметричною, а рідина нестисливою;
- течія відбувається при малих числах Рейнольдса;
4) тертям клітини о стінку мікрокапіляра та градієнтом тиску поза клітиною та мікрокапіляром нехтуємо.
У пункті 3.1 наведено аналіз динаміки змінення форми еритроцита під час його всмоктування у циліндричний мікрокапіляр, діаметр якого не перевищує характерного розміру клітини. При визначених у роботі радіусах мікрокапіляра еритроцити деформуються лише шляхом зсуву у площині мембрани чи згинання. Виходячи із закону нормального розподілу еритроцитів по розмірам, обчислено відносну кількість клітин, які зазнають гемоліз при продавлюванні крізь мікрокапіляр у залежності від його радіуса. Розрахунки показують, що мінімальний радіус мікрокапіляра, крізь який проходять усі клітини без ізотропного розтягу, дорівнює rр = 1.8 мкм, а при rр = 1.24 мкм усі клітини гинуть внаслідок надмірного ізотропного розтягу.
Рішення задачі про всмоктування еритроцита в мікрокапіляр значно полегшується, якщо наперед відомо, як змінюється його форма під час цього процесу. Виходячи з умов незмінності площі поверхні клітинної мембрани та об’єму клітини, отримано аналітичні вирази, на підставі яких обчислено форму поверхні мембрани еритроцита, який продавлюється крізь мікрокапіляр (рис. 1).
У пункті 3.2 наведено фізико-математичний аналіз руху внутрішньо- та зовнішньоклітинної рідини на початковій стадії втягування еритроцита в мікрокапіляр з моменту перекриття клітиною вхідного отвору в мікрокапіляр до зформування напівсферичної форми передньою частиною клітини, що всмоктується в мікрокапіляр.
Тримірна аксіально-симетрична течія незтисливої рідини описується стоксовою функцією течії Y. При малих числах Рейнольдса стаціонарна течія описується рівнянням руху:
 (1)
або  , (2)
де  . (3)
У тороідальній ортогональній спряженій правій системі координат обертання ξ, η, φ
 , (4)
де  ,  .
У розглянутому нами випадку частини мембрани еритроциту AS і SP (рис. 2) є координатними поверхнями у тороідальній системі координат ξ, η, φ. Тому саме в цій системі криволінійних координат полегшується вирішення рівнянь руху рідини всередені еритроцита. Загальне рішення неоднорідного рівняння руху  в цій системі координат можливо подати наступним чином:
 (5)
 ,
де x = ch ξ, Pν - функція Лежандра першого роду ступіню ν.
За для того, щоб рішення (5) було скінченим за x ® Ґ (що відповідає скінченому потоку рідини крізь вхідний отвір мікрокапіляра), треба покласти  . Крім того, оскільки потік нестисливої рідини крізь будь- яку поверхню h = const, що спирається на контур вхідного отвору капіляра x = Ґ, у області течії, що розглядається, повинен бути однаковим  не може залежати від координати h. Тому необхідно також припустити cn = dn = 0. Таким чином
 . (6)
Можливо довести, що при B № 0 відповідні швидкості руху Vh наближаються до нескінченності за x ® Ґ, а саме на кромці вхідного отвору у мікрокапіляр. Тому треба, щоб було B = 0. Перепад тиску на клітині вздовж осі симетрії x = 0 між точками Р і D (див. рис.2) дорівнює:
 (7)
де hin і hout - динамічна в’язкість внутрішньо- та зовнішньоклітинного розчину, h = h’ - координатна поверхня SPQ
У пункті 3.3 викладено фізико-математичну модель першого етапу всмоктування еритроцита в мікрокапіляр від моменту перекриття клітиною вхідного отвору мікрокапіляра до моменту, при якому радіус кривини втягнутої в мікрокапіляр частини клітини дорівнює радіусу капіляра.
Тангенційна складова напруг, діючих на мембрану з боку зовнішньо- та внутрішньоклітинної рідини, дорівнює
 , (8)
 ,
де штрихами позначені координати на поверхні мембрани.
При x = 0 сумарна тангенційна напруга, що діє на мембрану з боку оточуючої її рідини, врівноважується створеним у мембрані при її деформації натягом відповідно до рівняння
 , (9)
де прийнято такі позначення  ,  ,
де  .
Перепад тиску між виходом із капіляра z=L та площиною z = rp дорівнює
 . (10)
Підсумовуючи (10) і (7) , знаходимо повний перепад тиску на мікрокапілярі
 (11)
звідкіля виходить
 . (12)
Об’єм втягнутої в мікрокапіляр клітини дорівнює
 . (13)
Звідсіля одержуємо
 (14)
Інтегруючи у границях від h0 до h = p/2, знаходимо час t1, за який радіус лобової частини еритроцита, що всмоктується в мікрокапіляр, сягає значення rp.
Тривалість першої стадії процесу всмоктування еритроцита в мікрокапіляр t1 зростає зі зменшенням рушійної сили цього процесу  та з підвищенням в’язкості зовнішньоклітинного розчину. Збільшення довжини мікрокапіляра L також призводить до росту тривалості першої стадії досліджуваного процесу при заданому перепаді тиску внаслідок того, що при цьому зменшується сила  , яка викликає цей процес. Залежність t1 від параметра  є слабкою, бо із зменшенням діаметра мікрокапіляра, з одного боку, зростає деформація частини клітини, що всмоктується в мікрокапіляр, але, з іншого боку, ця деформація зачепає меньшу частину поверхні клітинної мембрани.
У пункті 3.4 наведено теоретичний опис процесу всмоктування еритроцита у мікрокапіляр від моменту утворення циліндричної частини мембрани до його повного всмоктування у мікрокапіляр.
Позначаючи як l довжину циліндричної частини клітини, що всмоктана у мікрокапіляр, в області 1 (рис. 3) функцію течії Y1 у циліндричних координатах представимо у вигляді
 (15)
котрому відповідають такі осьова та радіальна складові швидкості руху рідини:
 , (16)
 .
Очевидно,  .За законом зберігання маси нестисливої рідини  для області  отримуємо
 ,
(17)
 ,  .
Функції течії (15) відповідає градієнт тиску вздовж осі симетрії r = 0
 . (18)
Невідому функцію  визначили, виходячи з умови механічної рівноваги мембрани:
 . (19)
Поверхневе навантаження, що діє на мембрану клітини з боку внутрішньоклітинної рідини в області  , дорівнює
 , (20)
Тому, враховуючи (16), маємо
| 
