Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ

СТАРОДУБ ВАЛЕНТИНА МИКОЛАЇВНА

УДК 53.082:612.017.1

РОЗРОБКА ІМУННИХ СЕНСОРІВ НА ОСНОВІ ПОРУВАТОГО КРЕМНІЮ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ ЇХ ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ХАРАКТЕРИСТИК

03.00.20 – Біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2000Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник –            доктор біологічних наук, професор

                          Курський Михайло Дмитрович,

   Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН   України, головний науковий співробітник.

Науковий консультант –        кандидат фізико-математичних наук

                          Федоренко Леонід Леонідович,

         Інститут фізики напівпровідників НАН

   України, старший науковий співробітник.

Офіційні опоненти:                            доктор біологічних наук,

   старший науковий співробітник,

   Дмитренко Микола Петрович,

    Інститут екогігієни і токсикології

ім. Л.І. Медведя МОЗ України,

завідувач лабораторії біохімії;

   доктор біологічних наук,

    старший науковий співробітник,

    Таранова Людмила Анатоліївна,

    Інститут колоїдної хімії та хімії води

ім. А.В. Думанського НАН України,

завідувач відділу мікробної екології.

Провідна установа –        Київський національний університет

               імені Тараса Шевченка,

               кафедра мікробіології та імунології.

Захист відбудеться  “   17  ”  квітня 2000 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої  вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ – 30, вул. Леонтовича 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича 9).

Автореферат розісланий “   17   ” березня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук                                        Кірсенко О.В.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нарощування темпів прогресу з одного боку призводить до розвитку життя і підвищення рівня забезпечення потреб людини, а з іншого - до погіршення її здоров`я та загострення екологічної кризи. Для забезпечення вчасного визначення розвитку хвороб, успішного їх лікування та реєстрації кількості і типу шкідливих компонентів у довкіллі інструментальна та методична бази повинні відповідати сучасним вимогам практики. Найбільш повно вони можуть бути виконані лише на основі біосенсорів. Однак, не дивлячись на досягнення біотехнології, запропоновані на сьогодні їх моделі залишаються в більшості ще складними,  коштовними та неспроможними до прямої реєстрації досліджуваних аналітів. До того ж, аналізи на основі цих біосенсорів є недостатньо чутливими, багатостадійними, досить тривалими та вимагають використання коштовних реактивів. Тому пошук привабливіших щодо чутливості, мініатюрності, простоти та дешевизни трансдюсерів для створення нового покоління біосенсорів продовжується. У цьому відношенні поруватий кремній (ПК) завдяки можливості його простого отримання, наявності високорозвиненої поверхні та здатності до ефективної видимої фотолюмінесценції (ФЛ) все більше привертає до себе увагу дослідників.

ПК вже знайшов використання в оптичних фільтрах, фотогальванічних елементах та світловипромінюючих діодах. Показана можливість його застосування в біочіпах, які можна вводити в організм і спрямовувати таким чином лікування та діагностику. В останній час ПК викликає цікавість і як трансдюсер біосенсорів. Однак, незважаючи на стрімкий розвиток досліджень суто фізичних та електроннооптичних властивостей ПК, поки що бракує повідомлень про його використання в біосенсориці. Особливо це стосується ФЛ ПК, хоча він є чи не найкращим і найпридатнішим матеріалом для створення біосенсорів.

Міоглобін (Mb) є легко доступним і традиційно використовуваним антигеном (АГ) для лабораторних досліджень. Більш того, він вважається одним з важливих біохімічних маркерів розвитку інфаркту міокарду. Тому виникає нагальне завдання пошуку нових, перспективних підходів для його визначення, оскільки існуючі методи не в змозі задовольнити основні вимоги, які ставить практика щодо чутливості, швидкості та простоти аналізу цього АГ.

Забруднення довкілля - одна з найбільш актуальних проблем сьогодення. Однак, не зважаючи на велику увагу громадськості до поглиблення екологічної кризи, моніторинг повітря щодо рівня компонентів біологічного походження, які надходять з різних біотехнологічних підприємств і можуть негативно впливати на здоров`я людей, залишається поки що не реалізованим через брак надійних, специфічних, чутливих та швидких методів реєстрації.

Таким чином, пошук принципово нового типу імунних сенсорів, здатних до прямого визначення специфічної взаємодії імунних компонентів, таких як Mb - антитіла (АТ) до нього та специфічні біологічні забруднювачі (СБЗ) повітря - АТ до них, є невідкладним завданням біотехнології.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною фундаментальних досліджень відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем за темою НДР, № 01974004371, “Створення наукових основ експресної доклінічної біохімічної діагностики і моніторингу довкілля з використанням селективних взаємодій молекул та біосенсорної технології” та Фонду фундаментальних досліджень Державного комітету України з питань науки та інтелектуальної власності (проект 5.4/255 “Пошук нових підходів для прямої реєстрації специфічних взаємодій біологічних молекул”).

Мета і задачі дослідження. Метою даної дисертаційної роботи було з`ясувати можливість створення принципово нового типу оптичних імунних сенсорів на основі ФЛ ПК для реєстрації специфічної взаємодії АГ-АТ тa продемонструвати основні характеристики їх роботи порівняно з іншими методами та імунними сенсорами на прикладі визначення Mb та реєстрації забруднення повітря компонентами клітин дріжджів - продуцентів лізину на біотехнологічному заводі (м. Обухів, Київська область). 

Для досягнення зазначеної мети було сформульовано такі основні задачі:

1)        обрати метод одержання ПК, охарактеризувати розміри пор, структуру поверхні та вивчити основні властивості його ФЛ;

2)        вивчити характеристики ФЛ ПК при його взаємодії з різними буферними розчинами та імунними компонентами;

3)        створити імунні сенсори на основі ФЛ ПК для реєстрації специфічних взаємодій АГ-АТ та дослідити характеристики їх роботи: а) при визначенні концентрації Mb в розчинах та сироватці крові, а також б) при реєстрації рівня забруднення повітря компонентами дріжджових клітин - продуцентів лізину;

4)        розробити умови застосування та вивчити робочі характеристики оптоімунного сенсора на основі підсиленої хемілюмінесценції при реєстрації забруднення повітря компонентами клітин дріжджів - продуцентів лізину;

5)        порівняти основні характеристики розробленого імунного сенсора з показниками традиційного імуно-хімічного аналізу, типу ELISA, та оптоімунного сенсора на основі підсиленої хемілюмінесценції.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше запропоновано принципово новий метод на основі ФЛ ПК для реєстрації специфічної взаємодії АГ-АТ. Вивчено характеристики ФЛ та структурні особливості поверхні ПК, отриманого за технологією, що включала застосування променю лазера та хімічних реагентів.

Виявлено, що характеристики ФЛ ПК в значній мірі залежать від наявності на поверхні ПК специфічного імунного комплексу і можуть служити надійним параметром для реєстрації результату специфічної АГ-АТ взаємодії. Встановлено, що при контакті поверхні ПК з різними буферними середовищами, розчинами бичачого сироваткового альбуміну (БСА), IgG, анти-IgG, Mb, IgG до Mb, a також інших типів АГ та АТ фотолюмінесцентний сигнал залишається стабільним протягом перших 2-ох годин вимірювань. Вперше виявлено, що за умов утворення специфічного імунного комплексу на поверхні ПК протягом цього ж часу спостерігається майже повне гасіння ФЛ, причому зміни інтенсивності ФЛ в часі прямо пропорційно залежать від концентрації імунного компонента, що визначається.

Для пояснення ефекту гасіння ФЛ імунним комплексом, утворюваним на поверхні ПK, запропоновано гіпотезу, згідно з якою в процесі формування імунного комплексу відбувається десорбція водню з поверхні ПК і його захват комплексом [АГ-АТ]. Така гіпотеза відкриває новий напрямок у дослідженні процесів, що супроводжують утворення специфічного імунного комплексу.

Практичне значення отриманих результатів. Вперше розроблено оптичний імунний сенсор на основі ФЛ ПК. Продемонстровано можливість застосування запропонованого сенсора для простого, швидкого та чутливого визначення концентрації Mb в розчинах та сироватці крові, а також для моніторингу забруднення повітря компонентами клітин дріжджів - продуцентів лізину на біотехнологічному заводі. Відпрацьовано умови використання оптоволоконного імунного сенсора на основі підсиленої хемілюмінесценції для реєстрації зазначених вище забруднювачів повітря.

Розроблений оптичний імунний сенсор на основі ФЛ ПК можe бути базовою моделлю для подальшого удосконалення з метою впровадження і виробництва принципово нового типу інструментального діагностичного засобу, практичне використання якого дасть можливість на основі імунного аналізу реєструвати рівень забруднення повітря біологічними компонентами різного типу та проводити швидку, просту, достатньо чутливу та доступну діагностику стану організму людини.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Головна ідея роботи та напрямок досліджень були запропоновані науковим керівником та науковим консультантом, а її практичне виконання належить здобувачу. Автором дисертаційної роботи самостійно здійснено аналіз літератури, проведено імуно-хімічні, біохімічні, імунологічні дослідження, статистичну обробку даних, підготовлено публікації одержаних результатів, а також здійснено їх представлення на наукових семінарах та  конференціях. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником та науковим консультантом. Друковані роботи підготовлено при безпосередній участі автора спільно з науковим керівником та консультантом.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були представлені на таких міжнародних наукових конференціях: “Перша Національна Науково-Практична Конференція з Проблем ВІЛ/СНІД з Міжнародною Участю” (Kиїв, 1995); the ICB Seminars “Biomeasurements: Electrochemical Measurements of Biochemical Quantities” (Warsaw, 1995); NATO Advanced Study Institute on "Advanced Electronic Technologies and Systems Based on Low-dimensional Quantum Devices. High Technology" (Sazopol, 1996); Sixth International Meeting on Chemical Sensors (Gaihtersburg, 1996); SPIE-Conference on Optical Organic and Semiconductor Inorganic Materials (Riga, 1996); “17-th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in Conjunction with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology” (San Francisco, 1997); NATO Advanced Research Workshop “New Trends in Biosensor Development” (Vorzel, 1998); “XII European Conference on Solid-State Transducers and the IX UK Conference on Sensors and Their Applications” (Southampton, 1998); 2-nd Euroconference on Environmental Analytical Chemistry: "Environmental Analytical Chemistry for the Protection of Sensitive Ecosystems" (Cordoba, 1998); E-MRS'99 Spring Meeting “Microcrystalline & Nanocrystalline Semiconductors” (Strasbourg, 1999); “the 13th European Conference on Solid-State Transducers” (the Hague, 1999); NATO Advanced Study Institute on “Human Monitoring after Environmental and Occupational Exposure to Chemical and Physical Agents” (Antalya, 1999).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 1 статтю в Українському біохімічному журналі, 2 статті в журналі Sensors and Actuators, 9 повідомлень і тез у матеріалах міжнародних конференцій та отримано 1 патент.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 134  сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, який містить 247 посилань. Робота ілюстрована 22 рисунками та 4 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 4 розділів, в яких висвітлено витоки і тенденції сучасного розвитку імуно-хімічного аналізу та імунних сенсорів, а також погляди на Mb, як маркер розвитку інфаркту міокарду, та ціннісний і руйнівний вплив біотехнологічних виробництв на здоров`я людини і стан довкілля. Наведено відомості про існуючі методи визначення Mb та моніторингу довкілля на наявність СБЗ.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

ПК одержували за технологією, що передбачала обробку монокристалічного кремнію (МК) спочатку комп`ютерно керованим сфокусованим променем YAG: Nd лазеру (довжина хвилі λ = 1,06 мкм, тривалість імпульсу ф = 2x10-4 c, енергія E = 0,3 Дж) в режимі сканування по поверхні, а потім сумішшю HF : HNO3 : H2O = 1 : 3 : 5 (за об`ємом) протягом 3-10 хвилин. Пластини ПК розрізали на окремі зразки розміром 4х4 мм2. Після зазначеної обробки та при збудженні променем He-Cd лазеру (довжина хвилі л = 440 нм, потужність P = 0,001 Ват) ПК набуває здатності до видимої ФЛ в червоній області спектру. ФЛ, зміна характеристик якої була вимірюваним параметром результату специфічної взаємодії АГ-АТ, реєстрували використовуючи стандартний монохроматор УМ-2, фотопомножувач ФЕУ-83 та персональний комп`ютер. Морфологічні особливості одержаної поверхні ПК вивчали за допомогою електронної мікроскопії атомних сил (AFM). Поверхню ПК промивали етанолом та декілька разів дистильованою водою, після чого зразки висушували при кімнатній температурі в ламінарно чистих умовах. Процес іммобілізації імунних компонентів здійснювали шляхом пасивної сорбції. Після цього поверхню ПК промивали забуференим фізіологічним розчином (ЗФР) на основі 20 ммоль/л Na-фосфатного буфера, рН 7,3 та 140 ммоль/л NaCl і висушували.

Mb було виділено з м`яза серця людини за допомогою сульфату амонію і люб`язно надано нам  к.б.н., доцентом Львівського Державного університету ім. І. Франка В.М. Коробовим. Моноклональні АТ до Mb було отримано з фірми “Біон” (Росія). Сироватки готували стандартним шляхом із зразків крові людини, люб`язно наданих нам к.м.н. А.П. Сісецьким (Науково-дослідний інститут кардіології ім. Н.Д. Стражеско). Mb визначали спектрофотометрично, імунним сенсором на основі ФЛ ПК та методом ELISA.

Для кількісного визначення клітин дріжджів та їх компонентів у повітрі отримували поліклональні АТ. Для цього сухі клітини дріжджів (1 г), що використовують для виробництва лізину на біотехнологічному заводі, ретельно розмішували в 50 мл розчину сахарози (5 моль/л), а суміш декілька разів піддавали замерзанню та розмерзанню. Отриманий лізат дріжджів центрифугували при 500 g протягом 30 хвилин, а супернатант піддавали діалізу проти ЗФР. Для імунізації 6 кролів породи “Шиншил”, вагою 2-2,5 кг кожний, використовували однорідну емульсію, до складу якої входили розчин АГ та ад`ювант Фрейнда (“Sigma”), у співвідношенні 1:2,5. Для отримання антисироватки з бажаним титром 1:1000 - 1:10000 через кожні два тижні проводили три повторні внутрішньошкірні імунізації. З одержаної сироватки, титр якої складав 1 : 4096, виділяли поліклональні IgG шляхом їх осадження сульфатом амонію. Очистку специфічних IgG здійснювали афінною хроматографією, використовуючи BrCN сефарозу (Pharmacia) з ковалентно пришитими АГ (клітинами дріжджів та їх компонентами). За допомогою методу ELISА встановлено, що отримані АТ не утворювали специфічних комплексів з лізином, БСА, Mb, гемоглобіном та казеїном.

Проби повітря забирали методом фільтрації за допомогою спеціального приладу (ВО “Політехмед”, м. Київ), призначеного для роботи в полі, та фільтрів Петряну (завод медичних полімерів Міністерства медичної промисловості Росії,  м. Санкт-Петербург).   Швидкість   забору повітря була 1,2 м3/год., час забору - 30 хвилин. Фільтри з адсорбованим пилом замочували в 20-ти мл бікарбонатного буфера (50 ммоль/л, рН 7,3) і витримували в ньому протягом 15 хвилин за умов інтенсивного перемішування.  Отриманий розчин центрифугували протягом 30 хвилин при 500 g, а супернатант концентрували до 2 мл при кімнатній температурі, використовуючи вакуумний упарювальний прилад.

Моніторинг клітин дріжджів та їх компонентів, тобто СБЗ, проводили в 4 цехах біотехнологічного заводу: ферментації, випарювання концентрату лізину, висушування та фасування готової продукції, а також в 6 місцях оточуючого повітря: на території заводу, поблизу викидної вентиляційної труби; на відстані близько 500 м  від неї; в 3-х місцях житлової зони на відстанях 2, 4, та 6 км від викидної вентиляційної труби та на відстані 2 км від неї в напрямку, протилежному центру міста. Забір зразків оточуючого повітря проводили в два дні: 1) за наявності помірного вітру та 2) за його відсутності. У кожному з зазначених цехів та ділянок оточуючого середовища брали по 4 зразки повітря, на кожний з яких використовували по одному фільтру. Подальші вимірювання концентрації загального білка (ЗБ) та СБЗ проводили в трьох повторних аналізах. Рівень СБЗ у повітрі визначали за допомогою калібрувальних кривих, побудованих для кожного з сенсорних пристроїв окремо. Концентрацію ЗБ реєстрували методом Лоурі.

У конструкції імунного сенсора на основі оптичних волокон та підсиленої хемілюмінесценції використовували оптроди (монопровідні, товщиною 1,2 мм, шириною 5 мм; виробництва Південного машинобудівного заводу, м. Дніпропетровськ), та тефлонову комірку, ємністю 80 мкл. Визначення СБЗ здійснювали, застосовуючи конкурентний та “сендвіч” імуноаналізи, одним з компонентів яких був кон`югат специфічних АТ з пероксидазою хріну (ПХ). Реєстрацію сигналу, який виникав у результаті окислення люмінолу молекулярним киснем, що з`являвся внаслідок каталітичної активності ПХ, здійснювали за допомогою фотоелектричного помножувача ФЕУ-59, або ж ультрафіолетового кремнієвого фотодіоду (область спектральної чутливості – 0,36-1,2 мкм). Для іммобілізації імунних компонентів на поверхню оптроду її промивали хромовою сумішшю, а потім етанолом. Після цього поверхню послідовно обробляли γ-амінопропілтриетоксисиланом (APTES) і глутаровим альдегідом (ГА). Іммобілізацію імунних компонентів проводили з їх розчину (100 мг/л) на основі ЗФР протягом 30 хвилин. Незв`язані групи ГА блокували БСА (1 %). АТ з ПХ кон`югували перйодатним методом. В якості оптимального середовища для реакції хемілюмінесценції використовували суміш з: H2O2, пара-йодфенолу, люмінолу та тріс-HCl буфера (рН 8,1) в концентраціях 2; 0,05; 0,06 та 50 ммоль/л відповідно.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Отримання ПК, вивчення основних його властивостей та їх використання для розробки оптичних імунних сенсорів.

Основна і найважливіша відмінність нашого методу отримання зразків ПК від більшості існуючих полягає у застосуванні лазеру для попередньої обробки поверхні перед її травленням.

Результат дослідження поверхні одного з зразків ПК методом AFM представлено на рис. 1. Спостережувана глибина пор знаходиться в межах 10 - 200 нм, а їх діаметр (d) та  ширина “пагорбків” (кремнієвих кристалітів) - від 50 до 400 нм. Згідно класифікації поверхні ПК на мікропорувату (d < 2 нм), мезопорувату (2 нм < d < 50 нм) та макропорувату (d > 50 нм) і на основі результатів AFM виготовлені нами зразки можна віднести до макропоруватих.

Отримані зразки ПК при збудженні He-Cd лазером (довжина хвилі л = 440 нм, потужність P = 0,001 Ват) здатні до видимої ФЛ в червоній області з максимумом інтенсивності за довжини хвилі 650 нм та напівшириною смуги ~ 400 меВ. Із збільшенням  густини енергії лазеру, використовуваному при одержанні зразків ПК, від 11,5 до 33,5 Дж/см2 інтенсивність ФЛ збільшувалась. Тому при отриманні ПК лазерний промінь фокусували таким чином, щоб його густина досягала значення 33,5 Дж/см2. Спонтанне спадання інтенсивності ФЛ зразків ПК за температури 300 К описується розтягненою експонентою і відбувається протягом ≥ 200 мксек (рис. 2). Ці дані та попередні результати щодо форми та інтенсивності спектру узгоджуються з даними, наведеними в літературі, для ФЛ ПК в червоній області спектру.

На наш погляд, найбільш імовірною причиною гасіння ФЛ ПК може бути депасивація поверхні кристалітів (розрив зв`язку Н з Si в його пористій структурі) і включення поверхневих безвипромінювальних рівнів у рекомбінаційний процес. Водень, відірваний від поверхні ПК за умов специфічної взаємодії між імунними компонентами, імовірно, захвачується утвореним комплексом [АГ-АТ]. Це пояснення грунтується на тому, що наявність рекомбінаційних безвипромінювальних центрів на поверхні ПК є вирішальним фактором, який впливає на інтенсивність ФЛ в рамках будь-якої з існуючих моделей пояснення природи ФЛ ПК. Виявлений ефект згасання ФЛ ПК покладено в основу розробки принципово нового типу імунних сенсорів, робочі характеристики яких подано нижче.

2. Вивчення характеристик роботи імунного сенсора на основі ФЛ ПК при визначенні концентрації Mb в розчинах та сироватці крові.

Виявлено, що оптимальний час фізичної сорбції АТ до Mb на поверхню ПК складає 60 хвилин, а оптимальна їх концентрація в розчині  при іммобілізації дорівнює 100 мг/л (рис. 4 та 5).

У подальших експериментах встановлено, що найменша концентрація Mb, яку  можна  реєструвати  за допомогою даного сенсорного пристрою, складає 10 мкг/л, а лінійний відрізок графіку залежності характеристик ФЛ від вмісту Mb в розчині лежить у діапазоні 0,01 – 1 мг/л (рис. 6, крива 1).

Рис. 4. Зміна інтенсивності ФЛ в часі при утворенні імунного комплексу на поверхні ПК за різного часу іммобілізації АТ (100 мг/л) до Mb. Крива 1 – 15, 2 – 30, 3 – 60 та 4 - 90 хвилин.

Загальний час аналізу складає близько 80 хвилин, враховуючи тривалість усіх підготовчих етапів. Однак, його можна суттєво скоротити, зменшуючи час на утворення комплексу [АГ-АТ] та приготування селективного шару, а також проводячи аналіз у кінетичному режимі та використовуючи заздалегідь приготовлені зразки ПК з іммобілізованими АТ.

З метою вивчення операційної стабільності розробленого оптичного імунного сенсора на основі ФЛ ПК поверхню ПК після кожного циклу вимірювань обробляли розчином HСl (0,1 н) або ацетатного буфера (50 ммол/л, рН 2,2) протягом 5 хвилин, після чого її промивали ЗФР, висушували і досліджували ФЛ. Отримані результати показали, що після першого циклу вимірювань інтенсивність ФЛ зменшилась на 50 % у порівнянні з її початковим значенням (до утворення імунного комплексу на поверхні ПК). Потім такі зразки ПК витримували в розчині Mb (100 мг/л) 60 хвилин, і знову піддавали обробці в кислому середовищі за процедурою, описаною вище. Після другої обробки розчинами з низьким значенням рН інтенсивність ФЛ зменшилась майже до 0. На нашу думку найбільш імовірним поясненням такого ефекту є пошкодження самої поверхні в результаті дії розчинів з низьким рН. Таким чином, зразки ПК не придатні для багаторазового використання. Однак, зважаючи на широку розповсюдженість кремнію та його дешевизну, це не є проблемою для практичного використання запропонованого імунного сенсора.

Рис. 5. Зміна інтенсивності ФЛ в часі при утворенні імунного комплексу на поверхні ПК за різних концентрацій АТ у розчині, використовуваному для іммобілізації (60 хвилин). Крива I – 4, II – 20, III – 100 та IV – 500 мг/л.

Рис.6.  Зміна інтенсивності ФЛ при зануренні зразка ПК з іммобілізованими АТ (100 мг/л, 60 хвилин) на  15 хвилин у: буферні розчини Mb різних концентрацій (Крива 1) та сироватку крові людини, розведену ЗФР 1 : 10, до якої додавали різні концентрації Mb (Крива 2).

Для перевірки роботи розробленого сенсорного пристрою в реальних умовах аналізували сироватки крові 3-х здорових осіб, які змішували і потім за допомогою ЗФР готували зразки 3-х розведень: нерозведені, розведені 1 : 10 та 1 : 100. Виявилось (рис. 7), що за умов використання нерозведеної сироватки значення інтенсивності ФЛ зменшилось близько на 30%, а для зразків розведених сироваток воно наближувалось до 100%. Імовірно, що такі відмінності в інтенсивності ФЛ пов’язані з тим, що сироватка здорових людей у нормі може містити Mb в концентраціях до 100 - 150 мкг/л.

Рис. 7. Зміна інтенсивності ФЛ у разі занурення зразка ПК з іммобілізованими АТ на 15 хвилин у буферний розчин з Mb (0,1 мг/л) (N0) та сироватку крові людини: нерозведену (N1); розведену ЗФР 1 : 10 (N2) та 1 : 100 (N3).

Для підтвердження зроблених припущень до зразків розведеної (1:10) сироватки додавали різні кількості Mb з розчинів з вихідними концентраціями від 1 мкг/л до 10 мг/л. На основі отриманих результатів (рис. 6, крива 2), можна прийти до висновку, що різниця в значеннях змін інтенсивності ФЛ ПК при вимірюванні вмісту Mb в буферному розчині (крива 1) та розведеній сироватці (крива 2) не є значною, і проявляється у більшій мірі при малих концентраціях доданого Mb. Це імовірно свідчить про наявність певної початкової концентрації даного гемопротеїду в зразку сироватки. Більш того, крива залежності інтенсивності ФЛ від концентрації Mb в сироватці має таку ж саму лінійну ділянку, як і при визначенні Mb в буферному розчині. Вона знаходиться у діапазоні від 0,01 до 1 мг/л. Останнє виявляється досить важливим для діагностики інфаркту міокарду, оскільки концентрація Mb в таких випадках може коливатись у межах від 100 мкг/л до 1 і навіть до 10 мг/л.

Для аналізу вмісту Mb в реальних зразках імунним сенсором на основі ФЛ ПК використовували сироватки, отримані від здорових осіб (І група), осіб з початковою формою інфаркту міокарду (ІІ група) та пацієнтів з ознаками гострого інфарктного стану (ІІІ група). Всього було перевірено 15 осіб – по 5 від кожної групи. Зразки сироваток хворих на інфаркт міокарду розводили ЗФР 1 : 10, а здорових осіб - залишали нерозведеними. Усі зразки піддавали аналізу, як за допомогою імунного сенсора так і стандартного методу ELISA. Дані, представлені в Таблиці 1, являють собою середнє значення трьох вимірювань. На їх основі ми прийшли до висновку, що різниця між результатами, отриманими за допомогою розробленого оптичного імунного сенсора та методу ELISA, для зразків сироватки досліджуваних груп не є статистично значимою. Наведені дані також свідчать, що імунний сенсор є дещо менш точним у порівнянні з методом ELISA, що, імовірно, викликано використанням зразків ПК, які отримано з різних пластин МК. Такий недолік може бути усунений шляхом удосконалення технології виробництва ПК, сортування та маркування його окремих зразків. Слід, однак, наголосити, що даний імунний сенсор є значно простішим у використанні та забезпечує виконання аналізів за менш тривалий час порівняно з методом ЕLISA.

Таблиця 1. Визначення концентрації Mb в сироватці здорових осіб та осіб хворих на інфаркт міокарду різного ступеня тяжкості.

3. Розробка методів для моніторингу забруднення повітря клітинами дріжджів та їх компонентами.

Відкритий ефект згасання ФЛ ПК за умов утворення на його поверхні імунного комплексу ми також використали при розробці оптичного імунного сенсора нового типу для реєстрації СБЗ повітря, що надходять з лізин продукуючого біотехнологічного заводу. Виявилось, що чутливість аналізу в даному випадку сягає 100 мкг/л при часі, відведеному на утворення імунного комплексу, 60 хвилин. У перерахунку на одиницю об`єму повітря таке значення чутливості відповідає 0,33 мкг СБЗ в 1м3 повітря. Хоча загальний час проведення досліду складав 90-120 хвилин, враховуючи тривалість усіх підготовчих етапів, його, як і у випадку визначення Mb, можна скоротити за рахунок зменшення часу, відведеного на формування селективного шару та утворення імунного комплексу, а також за рахунок проведення вимірів у кінетичному режимі та здійснення попередньої іммобілізації АТ на поверхню ПК.

Результати визначення забруднення внутрішнього повітря 4 робочих приміщень заводу за допомогою розробленого оптичного імунного сенсора на основі ФЛ ПК порівнювали з даними традиційного методу ELISA та результатами оптродного імунного сенсора, вперше застосованого нами для визначення СБЗ, а також з даними методу Лоурі (Таблиця 2).

Виявлено, що найвищим рівнем забрудненості повітря як ЗБ, так і СБЗ, характеризується остання стадія виробництва лізину - цех пакування готової продукції. Причому в кожному з обстежених приміщень заводу вміст ЗБ в одиниці об`єму повітря приблизно в 4 рази перевищував концентрацію СБЗ, що є підтвердженням неможливості застосування традиційних біохімічних підходів до моніторингу повітря на забрудненість СБЗ. Дані щодо концентрацій СБЗ для кожного з робочих приміщень, які було отримано з використанням різних підходів, не були статистично різними, хоча в ряду точності використовувані методи розташовуються таким чином: ELISA; оптродний сенсор; та сенсор на основі ФЛ ПК. Меншу точність останнього в цих експериментах, як і у випадку визначення концентрації Mb, можна пояснити використанням зразків ПК, отриманих з різних пластин.

Таблиця 2. Концентрація ЗБ та СБЗ у робочих приміщеннях біотехнологічного  заводу.

Оскільки результати моніторингу внутрішнього повітря заводу, отримані оптичним імунним сенсором на основі ФЛ ПК, були підтверджені даними як методу ELISA, так і оптродного сенсора з використанням підсиленої хемілюмінесценції, а точність останнього була майже на рівні точності методу ELISA, то при визначенні СБЗ у зовнішньому повітрі обмежились порівнянням результатів, отриманих лише з використанням сенсорних пристроїв. Дані проведених вимірювань (Таблиця 3) свідчать, що на характер розповсюдження та накопичення СБЗ у зовнішньому повітрі значно впливають кліматичні умови, а особливо, наявність вітру, його сила та напрямок. Забрудненість повітря в житловій зоні на відстані 4 км від викидної труби за умов наявності помірного вітру можна було визначити лише при використанні оптродного імунного сенсора на основі підсиленої хемілюмінесценції. Це імовірно обумовлено його вищою чутливістю, значення якої складає 20 мкг в 1 л розчину, або 66 нг СБЗ в 1 м3 повітря, в порівнянні з  імунним сенсором на основі ФЛ ПК. Хоча чутливість імунного сенсора на основі ФЛ ПК нижче від чутливості оптродного імунного сенсора, в даний момент це неможна вважати недоліком першого, оскільки на сьогодні поки що не існує відомостей щодо мінімальних дозволених доз (МДД) вимірюваних СБЗ в одиниці повітря. Більш того, мало імовірно, що їх значення не перевищуватиме 0,33 мкг в 1 м3 повітря. Разом з тим, перевага розробленого імунного сенсора перед його оптичним аналогом та методом ELISA полягає в тому, що він не потребує кон’югатів імунних компонентів з ферментами, а здатний прямо реєструвати утворення специфічного імунного комплексу.

Таблиця 3. Концентрація СБЗ у повітрі різних районів міста Обухова.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено оптичні імунні сенсори принципово нового типу для експресного та прямого визначення концентрації міоглобіну в сироватці крові, а також рівня забруднення повітря компонентами клітин дріжджів - продуцентів лізину на біотехнологічному заводі по виробництву лізину (м. Обухів, Київська обл.).
2. Встановлено, що при контакті поруватого кремнію з різними середовищами: повітря, дистильованa водa, Na-фосфатний та тріс-HCl буфери (20 ммоль/л, рН 7,3), забуферений фізіологічний розчин; розчини: бичачого сироваткового альбуміну, міоглобіну, компонентів клітин дріжджів - продуцентів лізину, різних типів IgG та анти-IgG, - фотолюмінесценція залишається стабільною протягом перших 2-ох годин вимірювань.
3. Вперше виявлено, що утворення специфічного імунного комплексу на поверхні поруватого кремнію спричиняє різке спадання інтенсивності його фотолюмінесценції, причому швидкість цього процесу залежить від концентрації імунного компонента, що аналізується, та часу проходження імунної реакції. Відкритий феномен покладено в основу розробки імунних сенсорів для реєстрації антиген-антитіло специфічних взаємодій
4. Запропоновано пояснення механізму згасання фотолюмінесценції поруватого кремнію, згідно з яким утворення імунного комплексу супроводжується відривом водню від поверхні та його захватом комплексом [антиген-антитіло], а утворені обірвані зв`язки виступають як безвипромінювальні центри, які спричиняють згасання фотолюмінесценції. 
5. Основними характеристиками оптичного імунного сенсора на основі фотолюмінесценції поруватого кремнію для визначення концентрації міоглобіну в модельних розчинах та сироватці крові є: а) його чутливість - 10 мкг/л; б) лінійний діапазон залежності інтенсивності фотолюмінесценції від вмісту міоглобіну - 0,01 – 1 мг/л; в) загальний час аналізу – 80 хвилин; г) операційнa стабільність - один аналіз на кожній поверхні поруватого кремнію.
6. Вивчено робочі характеристики імунного сенсора для визначення рівня компонентів клітин дріжджів - продуцентів лізину, у повітрі робочих приміщень біотехнологічного заводу та прилеглих до нього територій. Чутливість сенсора – 0,33 мкг зазначених антигенів в 1 м3 повітря, загальний час аналізу – 120 хвилин. Встановлено місця найбільшого забруднення як внутрішнього, так і зовнішнього повітря.
7. Розроблено умови застосування оптродного імунного сенсора на основі підсиленої хемілюмінесценції для реєстрації клітин дріжджів - продуцентів лізину, та їх компонентів у повітрі. Виявлено, що його чутливість – 66 нг вказаних антигенів в 1 м3 повітря, а загальний час аналізу – 45 хвилин.
8. Функціональні характеристики обох розроблених імунних сенсорів на основі фотолюмінесценції поруватого кремнію порівняно з характеристиками оптродного імунного сенсора та методу ELISA. Встановлено, що результати, отримані з використанням зазначених методичних підходів в реальних умовах статистично не відрізняються, а розроблені імунні сенсори є значно простішими у використанні, забезпечують виконання аналізів за менш тривалий час та не потребують використання кон’югатів, оскільки здатні прямо реєструвати утворення специфічного імунного комплексу.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Starodub N.F., Fedorenko L.L., Starodub V.M., Dikij S.P., Svetchnikov S.V. Use of the silicon crystals photoluminescence to control immunocomplex formation // Sensors&Actuators B. - 1996. - N35-36. - P. 44-47.
2. Стародуб В.М., Федоренко Л.Л., Сісецький А.П., Курський М.Д. Імунний сенсор для визначення рівня міоглобіну // Український біохімічний журнал. - 1999. - Т.71, N3. - С. 68-72.
3. Starodub V.M., Fedorenko L.L., Sisetskiy A.P., Starodub N.F. Control of myoglobin level in a solution by an immune sensor based on the photoluminescence of porous silicon // Sensors&Actuators. - 1999. - V.58, N1-3. - P. 409-414.
4. Стародуб М., Стародуб В., Федоренко Л., Дикий С. Імуносенсор на основі флуоресценції порувтого кремнію для визначення рівня специфічних антитіл // Збірник тез першої Національної науково-практичної конференції з проблем ВІЛ/СНІД з міжнародною участю, 24-26 січня, Київ. - 1995. - С. 72-73.
5. Starodub N.F., Ternovoj K.S., Starodub V.M., Fedorenko L.L., Dikij S.P., Svechnikov S.V. Extinguishing of visible photoluminescence of porous silicium stimulated by antigen-antibody complex formation // Proc. SPIEE-Conference on Optical Organic and Semiconductor Inorganic Materials, Aug. 26-29, Riga, Latvia. - 1996. - P. 73-76.
6. Starodub V.M. Antigen-antibody interaction: new aspects of the signal generation at the specific complex formation // Proc. 17-th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in Conjunction with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, USA, Aug. 24-29. - 1997. - P. 1787.
7. Starodub V.M., Fedorenko L.L., Torbicz W., Artjuch V.P., Starodub N.F. Optical sensors for environmental monitoring in field: the measurement of the biological pollutant level of the air // Proc. NATO Advanced Research workshop “New trends in biosensor development”, Vorzel, Ukraine, July 6-9. - 1998. - P. 51-52.
8. Starodub V.M., Fedorenko L.L., Starodub N.F. Control of a myoglobin level in solution by the bioaffinic sensors based on the photoluminescence of porous silicon // Proc. XII European Conference on Solid-State Transducers and the IX UK Conference on Sensors and their Applications, Southampton, UK, Sept. 13-16 - 1998. - V.1. - P. 817-820.
9. Starodub N.F., Starodub V.M. Fiber optic immune sensor based on the enhanced chemical luminescence for control of environmental contamination by biological substances // Book of abstracts of 2-nd Euroconference on Environmental Analytical Chemistry: "Environmental Analytical Chemistry for the protection of sensitive ecosystems", Oct. 31 - Nov. 6, Cordoba, Spain. - 1998. - CL 12.
10. Starodub V., Urge-Vorsatz D., Starodub N. A new method based on a bioaffinic sensor utilizing the photoluminescence of porous silicon to monitor protein substances in the air // Proc. E-MRS'99 Spring Meeting “Microcrystalline & Nanocrystalline Semiconductors”, June1-4, Strasbourg, France. - 1999. - V.I-I. - P. 13.
11. Starodub V.M., Starodub N.F. Optical immune sensors for monitoring protein substances in the air // Book of abstracts of the 13th European Conference on Solid-State Transducers, September 12-15, the Hague, the Netherlands. -1999. - P. 87-88
12. Starodub V.M. Optical immune sensors for the express monitoring of the air contamination by biological substances // Proc. NATO Advanced Study Institute “Human Monitoring after Environmental and Occupational Exposure to Chemical and Physical Agents”. Sept. 23 – Oct. 3, Teсirova - Antalya, Turkey. - 1999. - P. 81-82.

За результатами дисертації отримано один патент:

13.        Стародуб М.Ф., Федоренко Л.Л., Стрільченко, І.Ю., Стародуб, В.М., Свечников С.В. Спосіб фотолюмінесцентного імуноаналізу. Патент № 98052658 від 21.05.98, МПК 6 G 01 № 33/53.

АНОТАЦІЯ