|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут молекулярної біології та генетики
НАЗАРЕНКО Олена Анатоліївна
УДК 577.152.3 + 543.645.3 + 543.554
РОЗРОБКА БІОСЕНСОРА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ
КОНЦЕНТРАЦІЙ СТЕРОЇДНИХ ГЛІКОАЛКАЛОЇДІВ
03.00.20 – біотехнологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2005
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.
Науковий керівник – кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник
Корпан Ярослав Ізидорович,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН
України, заступник директора з наукової роботи.
Офіційні опоненти - доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Соломко Олександр Петрович,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН
України, завідувач відділу біохімічної генетики;
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник
Верьовка Сергій Вікторович,
Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України,
старший науковий співробітник відділу структури і
функції білка.
Провідна установа – Київський національний університет імені
Тараса Шевченка, м. Київ.
Захист дисертації відбудеться “_27_” вересня 2005р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.
Автореферат розіслано “ 26 ” серпня 2005 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук О.В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Останнім часом стероїдні глікоалкалоїди (СГА) привернули особливу увагу вчених у зв’язку з отриманням даних щодо їхньої токсичності. Основним резервуаром цих природних токсинів є рослини родини Пасльонових, зокрема, картопля, широко вживана в їжу мільйонами людей. Споживання картоплі та продуктів з неї може бути потенційно небезпечним, оскільки високі концентрації СГА призводять до отруєння, іноді навіть з летальним кінцем як людей, так і тварин (Morgan et al., 1987). СГА спричиняють подвійну токсичну дію: по-перше, як детергенти, руйнуючи мембрани клітин, по-друге, інгібуючи холінестерази, що виконують ключову роль у передачі нервових імпульсів і детоксикаційній функції деяких ксенобіотиків (Morris et al, 1984).
Доведено, що СГА є тератогенними, ембріо- та генотоксичними сполуками (Poswillo et al., 1972; Swinyard et al., 1973; Chaube et al., 1976; Pierro et al., 1977; Renwick J, 1984; Baker et al., 1987; Keeler et al., 1990). Дослідження останніх років також свідчать, що СГА спричиняють збільшення ризику захворювання на рак мозку, молочної залози, легень та щитовидної залози (http:ntp-server.niehs.nih.gov/htdocs/Chem_Background).
Враховуючи це, надзвичайно актуальним є здійснення постійного контролю рівня СГА у харчових продуктах, особливо зважаючи на той факт, що досі не існує єдиного токсикологічно обґрунтованого стандарту безпечної концентрації СГА для людини (Korpan et al., 2004). Більш того, наукові дані є суперечливими й базуються тільки на дослідженнях дії СГА в гострих експериментах. Тому було дуже важливо дослідити дію СГА у субхронічному експерименті.
На сьогодні методи для визначення загального вмісту СГА та концентрації кожного з них окремо базуються на використанні колориметрії (Clement et al., 1989); високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) (Crabbe et al., 1980; Jonker et al., 1992; Houben et al., 1994; Simonovska et al., 2000; Sotelo et al., 2000), тонкошарової хроматографії (Ferreira et al., 1993), газової хроматографії – мас-спектрометрії (Herb et al., 1975; Chen, 1994), радіоімунологічного аналізу (Harvey et al., 1985) та твердофазового імуноферментного аналізу (ELISA) (Morgan et al., 1983).
Кожний із цих методів має певні недоліки, з яких найбільш суттєвими є дорожнеча обладнання, тривалий час попередньої обробки зразків та проведення самого аналізу. Дуже перспективною видається розробка альтернативних підходів до визначення вмісту СГА за допомогою біосенсорів. Інтерес до розробки біосенсорів обумовлений низкою їхніх потенційних переваг: дешевизною, простотою використання, можливістю їхньої мініатюризації, експресністю аналізу, низькою собівартістю при масовому виробництві - і все це із забезпеченням необхідного рівня чутливості та селективності (Sze, 1994; Korpan et al., 2002). Для розробки біосенсорів як чутливий елемент використовували бутирилхолінестразу (БуХЕ), яка, з одного боку, є чутливою до СГА (Nigg et al., 1996), з іншого – широко застосовується в біосенсорних системах, зокрема, на основі рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ), для аналізу бутирилхоліну, іонів важких металів, фосфорорганічних і карбаматних пестицидів (Новиков и др., 1992; Jaffrezic et al., 1996; Солдаткін, 1997). Внаслідок ферментативної реакції утворюються протони, що й обумовлює вибір рН-ПТ як перетворювачів. Досі у світі не існує жодного сенсорного пристрою для визначення концентрації СГА, тому актуальною є розробка біосенсора для аналізу цих токсинів із використанням рН-ПТ як перетворювачів та іммобілізованої БуХЕ як чутливого елемента.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетних тем Інституту молекулярної біології та генетики НАН України № 2.2.4.22 „Розробка нетрадиційних підходів до створення селективних елементів у біоелектронних системах” (№ державної реєстрації 0199U000660, 1999-2002 рр.), № 2.2.4.18 „Розробка монобіосенсорів та сенсорних масивів для аналізу забруднення навколишнього середовища та харчових продуктів” (№ державної реєстрації 0103U008008, 2001-2004 рр.) та міжнародних грантів INTAS № 00-0151 і NATO Linkage № LST.CLG 977342, де дисертантка виконувала окремі розділи згідно з планом науково-дослідних робіт.
Мета та завдання дослідження. Основною метою роботи була розробка потенціометричного біосенсора на основі БуХЕ для кількісного аналізу СГА та відпрацювання методик вимірювання цих токсинів у модельних і реальних зразках.
Для реалізації мети вирішували такі завдання:
1. Створення експериментальної моделі субхронічної інтоксикації СГА на щурах та характеристика її біохімічних показників.
2. Вивчення шляхів ефективної іммобілізації БуХЕ на поверхні польових транзисторів.
3. Дослідження механізму(ів) інгібування БуХЕ, іммобілізованої на поверхні рН-ПТ, деякими СГА.
4. Створення лабораторного прототипу біосенсора для визначення концентрацій α-соланіну та α-чаконіну в модельних та реальних зразках, дослідження і оптимізація його аналітичних характеристик.
5. Розробка методик вимірювання СГА біосенсором як в модельних, так і в реальних зразках.
6. Порівняння розробленого біосенсорного методу аналізу СГА з класичним методом тонкошарової хроматографії.
Об’єкт дослідження – інгібування ферменту БуХЕ стероїдними глікоалкалоїдами спіростанового типу б-соланіном і α-чаконіном.
Предмет дослідження – розробка біосенсорів для визначення концентрацій СГА.
Методи дослідження – біохімічні та електрохімічні методи визначення ферментативних реакцій, тонкошарова хроматографія, методи визначення токсичної дії глікоалкалоїдів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створено експериментальну модель субхронічної глікоалкалоїдної інтоксикації за низкою критеріально значимих показників та охарактеризовано її. Показано, що введення
щурам перорально паростків картоплі з концентрацією глікоалкалоїдів у дозі 1/20 від LD50 спричиняє зниження активності холінестераз крові майже вдвічі порівняно з контрольною групою тварин.
Показано, що СГА картоплі - б-соланін та б-чаконін - конкурентно і зворотньо інгібують БуХЕ, іммобілізовану на поверхні рН-ПТ.
Вперше у світі розроблено лабораторний прототип біосенсорного пристрою на основі рН-ПТ та БуХЕ для визначення концентрації СГА у модельних розчинах та у соку бульб картоплі.
Вперше запропоновано підходи, що дозволяють за допомогою розроблених біосенсорів селективно визначати СГА у присутності в дослідних зразках іонів важких металів та фосфорорганічних пестицидів.
Практичне значення одержаних результатів. Створено лабораторний прототип потенціометричного біосенсора, який може бути основою комерційного пристрою для експресного аналізу загального вмісту СГА, зокрема, у картоплі як існуючих сортів, так і отриманих внаслідок селекції або генетичної модифікації, та в продуктах харчування.
Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи авторкою проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертанткою разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Здобувачем особисто розроблено лабораторний прототип потенціометричного біосенсора, підібрано оптимальні умови проведення аналізу СГА та визначено механізм інгібування БуХЕ цими токсинами. За безпосередньої участі дисертантки підібрано оптимальні умови визначення СГА за допомогою тонкошарової хроматографії, виконано роботу з отримання тіней еритроцитів та визначення токсичної дії СГА на тимоцити. Обговорення та аналіз результатів досліджень проведено з науковим керівником.
Здобувач висловлює слова глибокої вдячності д.б.н., професору, академіку НАН України Єльській Г.В., д.б.н., професору Солдаткіну О.П., к.б.н., с.н.с. Дзядевичу С.В. за постійну увагу до дисертаційної роботи та обговорення отриманих експериментальних результатів.
Авторка щиро вдячна завідувачеві відділу біохімії Інституту екогігієни і токсикології імені Медведя МЗ України д.б.н., професору Дмитренку М.П за можливість проведення токсикологічних досліджень та допомогу при аналізі отриманих експериментальних даних; співробітникам к.б.н. Кішко Т.О. та Шандренко С.Г. за допомогу при підборі оптимальних умов проведення тонкошарової хроматографії та в проведенні біохімічних досліджень.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на: 1-st Black Sea Basin Conf. On Analytical Chemistry (Odessa, Ukraine, 2001), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, Україна, 2002), “Eurosensors XVI” (Prague, Czech Republic, 2002), V Всеукраїнській науковій конференції молодих вчених гігієністів, токсикологів, хіміків-аналітиків (Київ, Україна, 2003), Conference for students and young scientists on Molecular Biology and Genetics dedicated to the 30th anniversary of the Institute of Molecular Biology and
Genetics NAS of Ukraine (Kyiv, Ukraine, 2003), The 17th European Conference on Solid-State Transducers (Guimeraes, Portugal, 2003), VIII International Meeting on Cholinesterases (Perugia, Italy, 2004), 10th International Congress of Toxicology (Tampere, Finland, 2004), MADICA 2004 (Tunise, Tunis, 2004), II З’їзді токсикологів України (Київ, Україна, 2004), Конференції-звіті з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України „Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій” (Київ, Україна, 2005).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 експериментальні статті у фахових виданнях, 2 огляди та тези 13 доповідей на науково-практичних конференціях та з’їздах.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, яка має три розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, а також висновків та списку використаних джерел, який охоплює 135 найменувань. Роботу викладено на 114 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 29 рисунків та 7 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали і методи дослідження. При розробці біосенсорів використовували такі реактиви: БуХЕ з сироватки крові коня (КФ 3.1.1.7.), виробництва фірми “Sigma”-“Aldrich Chemie GmbH” (Німеччина), з активністю 13 од. акт./мг препарату та БуХЕ з сироватки крові людини (КФ 3.1.1.7.) виробництва фірми “Sigma”-“Aldrich Chemie GmbH” (Німеччина), з активністю 6,4 од. акт./мг препарату; субстрат БуХЕ - бутирилхолінхлорид (“Sigma”- “Aldrich Chemie GmbH”); фосфотриестеразу з Pseudomonas diminuta (КФ 3.1.8.1.) з активністю 2000 од. акт./мл препарату було люб’язно надано для досліджень проф. Фраком Раушелом (США); субстрат фосфотриестерази – параоксонметил (“Sigma”- “Aldrich Chemie GmbH”). Для іммобілізації ферментів застосовували: 25% водний розчин глутарового альдегіду фірми “Serva” (Німеччина) та фотополімер полі(вініл)алкоголь із вмістом стирилпіридину (PVA/SbQ) (SPP-H-13, Toyo Gosei Kogyo Co.Ltd, Японія). Для стабілізації біоматриць додавали сироватковий альбумін бика (БСА) фірми “Serva”. Для інгібіторного аналізу використовували кристалічні α-соланін та α-чаконін з пагонів Solanum tuberosum від “Sigma”-“Aldrich Chemie GmbH”.
Решта реактивів були вітчизняного виробництва і мали кваліфікацію „осч” та „хч”.
У роботі використовували рН – чутливі польові транзистори виробництва НДІ Мікроприлад (м. Київ). Їхні конструкції та характеристики описано в роботі (Shul’ga et al., 1996). Створення ферментних біоматриць на поверхні електродів проводили згідно (Wan et al., 1998; Soldatkin et al., 2002). Визначення СГА за допомогою біосенсора проводили шляхом інгібіторного аналізу (Архипова и др., 2001).
Вивчення впливу вживання проростків картоплі на організм щурів. Активність аспартатамінотрансферази (АСТ) та аланінамінотрансферази (АЛТ) визначали за методом Райтмана-Френкеля (Raitman et al., 1957) з використанням
стандартних наборів.
Бутирилхолінестеразну активність у сироватці крові щурів визначали методом Елмана (Ellman, 1961) за допомогою наборів „RANDOX U.K.”
Ацетилхолінестеразну (АцХЕ) активність визначали за (Roddick et al., 1989).
5'-нуклеотидазну активність тіней еритроцитів визначали за методом Чена (Chen, 1956).
Процеси перекисного окислення ліпідів у печінці визначали по утворенню малонового діальдегіду за методом Гацко (Кузьминская и др., 1989).
Осмотичну резистентність еритроцитів визначали відносно ряду гіпотонічних розчинів хлориду натрію за методом Дейчі (Тодоров, 1963).
Цитотоксичну дію СГА вивчали на суспензії тимоцитів, які отримували за методикою Клауса (Клаус, 1990). Кількість життєздатних тимоцитів підраховували в камері Горяєва після забарвлення їх трипановим синім.
Солюбілізовану лактатдегідрогеназу (ЛДГ) в позаклітинне середовище розраховували у відсотках щодо загальної ЛДГ активності лізованих 0,01% дигітоніном клітин.
Методика визначення СГА за допомогою тонкошарової хроматографії. СГА екстрагували з дегідратованої картоплі сумішшю киплячого метанолу з оцтовою кислотою (95+5, v/v). Надосадову рідину випарювали до кінцевого об’єму 1 мл. Соланін та чаконін розділяли на активованих метанолом пластинках сумішшю хлороформ : метанол : 2% NH4OH (70:30:5). Для візуалізації аналізів пластинку занурювали в 20% розчин SbCl3 у суміші оцтова кислота : дихлорметан (1+3, v/v), висушували в повітрі впродовж 10 хв. Яскраво-рожеві плями на безбарвному фоні хроматограми сканували через 5 хв після проявлення. Для кінцевого етапу хроматограми сканували та здійснювали комп’ютерний розрахунок із використанням програми “ДенситоАналіз”.
Результати дослідження та їхнє обговорення.
Експериментальна модель субхронічної глікоалкалоїдної інтоксикації на щурах. Для розробки моделі глікоалкалоїдної інтоксикації були створені агравовані умови, за яких щурам лінії Wistar щоденно (перорально) протягом 2-х місяців вводили паростки картоплі з вмістом СГА 22,5 мг/кг ваги тварини. Після цього досліджували загально-токсичні показники: вагу та вагові коефіцієнти, аланінамінотрансферазну, аспартатамінотрансферазну та бутирилхолінестеразну активності сироватки крові, інтенсивність перекисного окислення ліпідів у печінці, ацетилхолінестеразну та 5'-нуклеотидазну активності у тінях еритроцитів, кількість білка в безклітинній фракції тимусу, осмотичну резистентність еритроцитів.
У дослідної групи щурів спостерігали деякі клінічні прояви загально-токсичних інтоксикацій, таких як діарея та адинамія. Але вони не супроводжувались змінами ані ваги та вагових коефіцієнтів, ані АСТ та АЛТ активностей, що, можливо, пов’язано з тим, що доза СГА в паростках картоплі не
перевищувала 1/20 від ЛД50.
Проте, і при цих дозах ми виявили зміни, що відображають вибіркову токсичність самих СГА. В тимусі, що є найбільш уразливим до дії ксенобіотиків
органом, кількість білка в безклітинній фракції значно зростає і становить 112,7 ± 10,7 мг/г тимусу у дослідної групи та 84,9 ± 6,6 мг/г тимусу – у контрольної групи. Окрім того, відзначено зменшення життєздатності тимоцитів при їхньому інкубуванні в середовищі Хенкса протягом 7 год: воно становить 8,4 ± 0,8% та 18,2 ± 1,8% у дослідної та контрольної груп, відповідно.
Встановлено, що чаконін виявляє майже вдвічі більшу цитотоксичність щодо тимоцитів щурів порівняно з соланіном (рис.1).
А Б
Рис.1. Вплив соланіну (А) та чаконіну (Б) на життєздатність тимоцитів
При дослідженні впливу СГА на тимоцити за двома показниками - загибеллю клітин та вивільненню лактатдегідрогенази (ЛДГ) в позаклітинне середовище внаслідок руйнування мембран - виявлено синергізм спільної біологічної дії соланіну (10 мкг/мл) та чаконіну (5 мкг/мл) (рис.2).
Про певні зміни мембран також свідчить зростання в 1,5 рази в тінях еритроцитів 5´-нуклеотидазної активності, яка є одним з найвживаніших маркерів для вивчення стану цитоплазматичних мембран (ЦПМ) клітини, оскільки активний центр цього інтегрального білка знаходиться із зовнішнього боку ЦПМ.
Нами виявлено зниження ацетилхолінестеразної (АцХЕ) активності тіней еритроцитів (у дослідних щурів) на 45% порівняно з контрольною групою тварин. Це пояснює зниження активності в поведінці дослідної групи. Відомо, що фізіологічною особливістю СГА є їхня здатність впливати на передачу нервових імпульсів, специфічно блокуючи фермент АцХЕ (Кинтя и др., 1979; Roddick et al., 1989; Nigg et al., 1996). Механізм інгібування АцХЕ не з’ясований повністю, але вважають (Friedman et al., 2004), що, можливо, він пов’язаний з типом стероїдної частини СГА.
Виходячи з даних стосовно дії СГА на щурів, отриманих у субхронічному експерименті, можна зробити таке припущення: тривале вживання картоплі навіть із незначною кількістю цих токсинів може бути вкрай небезпечним для людини, особливо зважаючи на той факт, що значення LD50 для людини 3-6 мг/кг ваги людини (Morris et al., 1984) значно нижчі у порівнянні з LD50 - 590 мг/кг ваги для щурів (Gull et al., 1970). Показано значне зниження активностей ферментів БуХЕ та АцХЕ, що вказує на послаблення детоксикаційної функції печінки та пригнічення передачі нервових імпульсів. Продемонстровано також мембранотропну та цитотоксичну дію СГА. У той же час не виявлено суттєвих змін ваги та вагових коефіцієнтів органів тварин, а також АЛТ та АСТ активностей. Інтоксикація не набуває значних розмірів через те, що не всі СГА паростків всмоктуються в шлунково-кишковому тракті та отримана доза СГА не перевищує 1/20 від LD50.
Оскільки існуючі методи визначення СГА дорогі, потребують значних затрат часу та зусиль, привабливою видається розробка альтернативного методу визначення цих токсинів за допомогою сенсорного приладу.
Розробка біосенсорної системи для визначення СГА на основі рН-ПТ та іммобілізованої БуХЕ. До біоселективних мембран, що є чутливим елементом при створені біосенсорів, ставиться ряд вимог, а саме: забезпечення адгезії мембрани до поверхні перетворювача, дифузійної проникливості щодо молекул субстратів та інгібіторів, рівня включення ферментів у мембрану та збереження їхньої активності при іммобілізації (Rolfe et al.,1988). Процедура виготовлення мембран повинна бути простою, малочутливою до випадкових відхилень умов навколишнього середовища та дешевою. Було показано (Dawson et al., 1990), що цим вимогам відповідають біосенсори з ферментом, іммобілізованим методом зшивки глутаровим альдегідом та фотополімеризацією за допомогою PVA/SbQ у білковій мембрані (Wan, 1998; Soldatkin et al., 2002). Тому було запропоновано створити біочутливу мембрану для визначення концентрацій α-соланіну та α-чаконіну двома методами іммобілізації бутирилхолінестерази: ковалентного зв'язування у насичених парах глутарового альдегіду та фотополімеризацією у PVA/SbQ.
 
А Б
Рис.3. Залежність активності БуХЕ від концентрацій α-соланіну та α-чаконіну при іммобілізації ферменту в фотополімері PVA/SbQ (А) та БСА мембрані зшивкою глутаровим альдегідом (Б)
Як видно з рис.3, обидва способи формування ферментних мембран забезпечують досить високий та приблизно однаковий рівень їхньої чутливості до СГА. При розробці лабораторного прототипу біосенсора для визначення СГА в подальших дослідженнях було обрано іммобілізацію БуХЕ у білковій мембрані завдяки простішій процедурі іммобілізації в лабораторних умовах. Але для масового виробництва фотополімеризація є більш технологічним методом іммобілізації, оскільки у такому випадку виробництво перетворювачів, включаючи інтегральні схеми обробки даних та нанесення мембран, можна здійснювати в одному технологічному циклі.
Оскільки принцип роботи сенсора на основі іммобілізованої БуХЕ полягає у локальній зміні рН середовища, яка відбувається під час ферментативного процесу, то сигнал, що реєструється, очевидно, залежатиме від концентрації буферного розчину. При аналізі СГА було встановлено незалежність рівня інгібування від буферної ємності (рис. 4), а тому контроль буферної ємності при аналізі реальних зразків не є обов’язковим, як у випадку більшості раніше створених сенсорів на основі рН-ПТ (Arkhipova, 2002).
Ми проводили серію експериментів із вивчення механізму інгібування БуХЕ, іммобілізованої на поверхні рН-ПТ, соланіном та чаконіном. Використовуючи широковживаний у біохімічній практиці метод Діксона (рис.5), нами було встановлено, що СГА інгібують іммобілізовану БуХЕ конкурентно. Отримано непрямі докази конкурентного механізму інгібування, а саме: незалежність інгібування від часу інкубування та збільшення рівня інгібування при зменшенні концентрації субстрату - БуХХл. Згідно з (Nigg et al., 1996), незалежність рівня інгібування від часу інкубування, безпосередньо свідчить також про зворотність взаємодії між досліджуваними інгібіторами і БуХЕ. Ще одним доказом зворотності інгібування є також факт повного відновлення активності ферменту після відмивання мембран лише робочим буферним розчином без застосування додаткових реагентів. Отже, отримані експериментальні дані свідчать про те, що іммобілізована БуХЕ інгібується СГА конкурентно та зворотньо.
Як видно із наведених на рис.3 результатів, чутливість БуХЕ знаходиться в діапазоні 2-100 мкМ. Це повністю забезпечує аналіз картоплі на вміст СГА, але є недостатнім для визначення СГА у сироватці крові. Відомо, що ферменти залежно від джерела їхнього отримання відрізняються деякими кінетичними характеристиками та чутливістю до інгібіторів. Тому замість БуХЕ з сироватки коня як чутливий елемент сенсора ми використали БуХЕ з сироватки людини. Встановлено, що біосенсор на основі БуХЕ з сироватки людини був значно чутливішим до СГА порівняно з сенсором на базі БуХЕ з сироватки коня (порівняти рис.3 та рис.6), а лінійний динамічний діапазон визначення СГА становив 0,03-5 мкМ. Таким чином, заміна БуХЕ коня на БуХЕ людини дасть можливість аналізувати вміст СГА в сироватці крові та інших біологічних рідинах.
Загальновідомо, що фермент БуХЕ має порівняно низьку специфічність щодо різних типів інгібіторів, окрім СГА фермент суттєво інгібується фосфорорганічними пестицидами та іонами важких металів. Тому було проведено низку досліджень з вивчення можливості селективного визначення СГА картоплі за допомогою створеного потенціометричного бісенсора за наявності інших інгібіторів.
Було проведено визначення концентрацій СГА на фоні деяких важких металів та пестицидів. Встановлено, що застосування етилендіамінтетраацетату (ЕДТА) (специфічний комплексон іонів важких металів) та фосфотриестерази (фермент, що здатний розщеплювати винятково фосфорорганічні пестициди) перешкоджає інгібуванню іммобілізованої БуХЕ ртуттю, свинцем (до концентрацій 500 мкМ) і параоксоном (до 100 мкМ), але не впливає на здатність СГА картоплі інгібувати фермент. Це дозволяє аналізувати досліджувані складні суміші на наявність СГА (рис.7).
Практичне використання біосенсорів лімітується їхньою стабільністю при роботі та зберіганні, тому в наступній серії експериментів ми вивчали ці характеристики розробленого біосенсора.
Слід зазначити, що для сенсорних систем на основі іммобілізованих біологічно активних молекул умовно розрізняють два види стабільності: операційну стабільність та стабільність при зберіганні. Ці два види стабільності якісно відрізняються між собою тим, що для дослідження стабільності при функціонуванні застосовується так званий квазібезперервний режим роботи (використання одного і того ж датчика для проведення аналізів щонайменше 10 разів на день протягом певного проміжку часу), а стабільність при зберіганні досліджується, використовуючи той самий датчик для аналізу періодично, зберігаючи його в проміжках за відповідних умов. Тест на операційну стабільність показав, що стабільні відгуки для створених біосенсорів суттєво не зменшувались впродовж принаймні 10 годин його безперервного використання.
Нами було встановлено, що після двох тижнів роботи біосенсора у квазібезперервному режимі активність біоселективної мембрани зменшувалась на 30% у випадку іммобілізації БуХЕ у глутаровому альдегіді. При тривалому зберіганні (більше 1,5 місяця) біосенсорних приладів при температурі 40С активність БуХЕ, іммобілізованої у глутаровому альдегіді, знижувалась на 40%.
Відгук біосенсора на субстрат та інгібітор мав високу відтворюваність, стандартне відхилення не перевищувало 5% (рис.8).
| 
