|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ШУГАЙ МИРОСЛАВА ОЛЕКСАНДРІВНА
УДК 578.81:637.13
БІОЛОГІЧНІ ТА ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ
ФАГІВ МОЛОЧНОКИСЛИХ БАКТЕРІЙ, ВИДІЛЕНИХ ЗА УМОВ ВИРОБНИЦТВА МОЛОЧНИХ ФЕРМЕНТОВАНИХ ПРОДУКТІВ
03.00.06 – вірусологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2006Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського
національного університету імені Тараса Шевченка
Науковий керівник – академік УААН, доктор біологічних наук, професор
Бойко Анатолій Леонідович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка.
Офіційні опоненти – академік УААН, доктор біологічних наук, професор
Патика Володимир Пилипович,
Національний авіаційний університет Кабінету Міністрів України;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Товкач Федір Іванович,
Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділом молекулярної біології вірусів.
Провідна установа – Інститут сільськогосподарської мікробіології ААН
України, м. Чернігів.
Захист дисертації відбудеться 21 березня 2006 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка, за адресою:
03127, м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, корп. 12, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий „ 20 ” лютого 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.В. Молчанець
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Інтерес до фагів молочнокислих бактерій зумовлений насамперед тим, що ці віруси мають надзвичайно важливе практичне значення. Лізуючи клітини бактерій-хазяїв, фаги знижують активність заквасок, збільшують тривалість вироблення продуктів та погіршують їх якість, завдаючи цим серйозних економічних втрат. Незважаючи на значні досягнення щодо вивчення механізмів захисту молочнокислих бактерій (МКБ) від фагової інфекції, проблема боротьби з бактеріофагами залишається однією з найактуальніших для молочної промисловості розвинених країн світу (Brussov Н., 2001; Coffey A. and Ross R.P., 2002; McGrath S. et al., 2002).
В Україні проблема фаголізису особливо гостро постала в останні десятиліття, коли вітчизняні дослідження з ряду причин було практично припинено, колекції фагів та чутливих до них культур втрачено, а тому, роботи з виявлення та профілактики фаголізису на виробництві майже не проводилися. Зрозуміло, що за цих умов кількість випадків порушень ферментації значно зросла.
Вибір ефективних методів боротьби з бактеріофагами МКБ, без сумніву, повинен базуватися на всебічному вивченні їх біологічних властивостей. Аналіз літератури щодо лактофагів дозволяє зробити висновок: незважаючи на великий інтерес зарубіжних дослідників до цієї групи бактеріальних вірусів та велике число робіт, присвячених їм, виявляються все нові й нові дані, які не тільки відкривають обнадійливі перспективи боротьби з фаголізисом на виробництві, а й мають велику теоретичну цінність. Зокрема, завдяки тому, що на даний час фаги МКБ – найдослідженіша на генетичному рівні фагова система (Lucchini S. еt al., 1999; Proux C. et al., 2003; Desiere F. et al., 2002), ця група вірусів стала цікавим об’єктом для еволюційного дослідження. Дані, отримані завдяки секвенуванню фагових геномів, розширюють наші уявлення про еволюцію бактеріальних вірусів, допомагають з’ясувати особливості генетичної структури світової популяції фагів, дозволяють по-новому оцінити роль бактеріофагів як фактора еволюції їх хазяїв.
Мозаїчність фагових геномів свідчить про важливу роль горизонтального обміну блоками генетичної інформації в еволюції бактеріофагів. Згідно з Hendrix (2003), шляхом гомологічних та негомологічних рекомбінацій відбувається інтенсивний обмін послідовностями геномів не лише між фагами, активними до філогенетично близьких хазяїв, але й фагами, хазяї яких займають спільну екологічну нішу, внаслідок чого виникає значна розмаїтість локальних популяцій бактеріальних вірусів. Окрім того, з огляду на порівняння фагових геномів ставиться питання про необхідність перегляду існуючої таксономічної системи бактеріофагів та відкриваються перспективи створення природної таксономії родини Siphoviridae – такої систематики, яка б відображала філогенетичні зв’язки між вірусами (Lawrence J.G. еt al., 2002; Proux С. еt al., 2002; Rohwer F. and Edwards R., 2002).
Важливість та нагальна необхідність дослідження фагів МКБ, поширених на підприємствах молочного профілю України, зумовлені насамперед економічними чинниками. Моніторинг та вивчення властивостей фагів, активних до промислових культур МКБ, сприятимуть розробці заходів, спрямованих на профілактику ситуацій фаголізису на виробництві, а також створенню ефективних програм селекції фагостійких штамів заквашувальних культур і їх ротації. Ці дослідження мають і велику наукову цінність, оскільки розширюють наші знання щодо різноманітності бактеріофагів такої важливої у житті людини групи мікроорганізмів, як молочнокислі бактерії.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася відповідно до напрямку науково-дослідних робіт кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темою: „Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських рослин”, держбюджетна тема 01БФ036-076 (номер державної реєстрації 0101U005076).
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити біологічні та фізико-хімічні властивості фагів МКБ. Визначити роль бактеріофагів у виробничих процесах і здійснити пошук тест-культур для детекції фагів. Досягнення поставленої мети передбачало здійснення таких завдань:
Провести виділення фагових ізолятів зі зразків продукції, сироватки, ропи та змивів з обладнання підприємств молочного профілю різних областей України.
Дослідити вплив фагового забруднення на якість отримуваного продукту.
Вивчити основні біологічні властивості ізольованих фагів – спектр літичної активності та ефективність репродукції на чутливих культурах.
Провести дослідження штамів МКБ, які забезпечують найвищу ефективність репродукції фагів, на лізогенність.
Вивчити морфолого-структурну організацію віріонів. Визначити і порівняти поліпептидний склад вірусів.
Визначити серологічну спорідненість фагових ізолятів, які належать до різних літичних груп.
Дослідити чутливість бактеріофагів до дії фізико-хімічних факторів: підвищеної температури, цитрату натрію, осмотичного шоку, хлороформу, а також інфекційність фагів при зберіганні.
На основі отриманих даних провести порівняльну характеристику фагів МКБ, поширених у молочній галузі України.
Об’єкт дослідження – ізоляти фагів молочнокислих бактерій, виділені за умов виробництва, промислові культури молочнокислих бактерій.
Предмет дослідження – біологічні властивості та фізико-хімічні характеристики виробничих ізолятів фагів молочнокислих бактерій.
Методи дослідження. Очистку та концентрування вірусів проводили за допомогою диференціального центрифугування. Біологічну активність фагів визначали методом двошарового агару. Чисельність МКБ – методом граничних розведень та за допомогою фотокалориметра. Для виявлення антигенної спорідненості вірусів скористалися методом непрямого твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА) в гомо- та гетерологічних системах. Морфолого-структурну організацію віріонів визначали за допомогою електронної мікроскопії. Поліпептидний склад виділених фагів досліджували з використанням методу електрофорезу в ПААГ.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні проведено обстеження продукції підприємств молочного профілю на наявність фагів МКБ та здійснено їх виділення. Показано, що фаголізис культур закваски призводить до активного розвитку сторонньої мікрофлори, внаслідок чого знижуються рівень епідеміологічної безпеки та якість продукції. Встановлено, що проблема запобігання виникнення ситуації масового фаголізису полягає у необхідністі зниження титру фага у цільовому продукті до значень, нижчих від 106 БУО/мл.
Вперше в Україні досліджено на фагочутливість культури термофільних стрептококів, завдяки чому виявлено фаги, здатні репродукуватися у штамах як мезофільних (Lactococcus lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. diacetilactis), так і термофільних (Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) МКБ. Визначено систематичне положення ізольованих фагів: віруси належать до родини Siphoviridae, порядку Caudovirales. Серед ізолятів домінують фаги морфотипу В1, також виявлено фаги морфотипу В2 групи с2.
Показано, що процес термоінактивації фагів описується двокомпонентними кривими, а фаги відрізняються термостійкістю. Досліджено чутливість бактеріофагів до цитрату натрію та показано різну потребу вірусів у іонах кальцію. Виявлено стійкість фагових часток до осмотичного шоку, хлороформу та за умов тривалого зберігання в ропі.
Практичне значення роботи. Створено колекцію виробничих фагів (13 ізолятів), активних щодо штамів мезо- та термофільних МКБ. До виділених фагів визначено чутливість 147 музейних культур МКБ колекції Технологічного інституту молока та м’яса УААН (ТІММ). Фагостійкі штами в майбутньому можуть використовуватися для створення заквашувальних композицій. Серед чутливих штамів відібрано ті, які забезпечували найвищий рівень репродукції бактеріофагів та не містили індуцибельних профагів. Вони є перспективними кандидатами тест-культур для проведення моніторингу лактофагів за умов виробництва.
Виявлено залежність репродукції фагів від наявності іонів Са2+, що вказує на можливість розробки та застосування у маточному виробництві безкальцієвих середовищ з метою запобігання фаголізису заквасок у вітчизняній молокопереробній промисловості.
Встановлено, що жоден із режимів пастеризації, прийнятих на виробництві, не гарантує повної інактивації фагів; лише за умов приготування закваски 100% вірусів утрачають інфекційність.
Показано, що в умовах виробництва ропа є вторинним джерелом фагової інфекції, тому це слід брати до уваги на етапі розробки конструкції сирзаводів та під час проведення ротації заквасок.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконано літературний пошук та аналіз літературних джерел за темою дисертації, підбір та модифікацію методів дослідження, планування та розробку схем експериментів, отримання експериментальних даних та їх статистичне опрацювання, аналіз отриманих результатів і оформлення роботи. Дослідження антигенної спорідненості фагових ізолятів та їх поліпептидного складу проводилися за сприяння к.б.н. Шевченко Т.П. – ас. кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, яка є співавтором відповідної публікації. Постановка завдань і обґрунтування науково-практичних висновків проводилися разом з науковим керівником – д.б.н., проф. Бойком А.Л. Друковані роботи підготовлено автором особисто при безпосередній участі наукового керівника. Дисертант висловлює щиру подяку д.т.н., зав. відділом біотехнології ТІММ Кігель Н.Ф. та к.б.н., cт.н.с. Рожанській О.М. за співпрацю та корисні поради.
Апробація результатів дисертації. Основні положення досліджень доповідались на IV Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 24–25 квітня 2004 р.), X з”їзді Товариства мікробіологів України (Одеса,15–17 вересня 2004 р.), IV міжнародній конференції „Біоресурси та віруси” (Київ, 27–30 вересня 2004 р.) та науковому семінарі кафедри вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка (2005 р.).
Публікації. Результати дисертаційної роботи представлено у чотирьох статтях, опублікованих у фахових наукових журналах, і трьох тезах, виданих за матеріалами з’їздів та конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційну роботу викладено на 156 сторінках машинописного тексту, куди увійшли огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень (4 розділи), узагальнення, висновки, список використаних джерел. Список літератури налічує 286 найменувань, з них 228 – іноземні. Робота містить 15 таблиць та 27 рисунків.
ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. На основі робіт вітчизняних та зарубіжних авторів висвітлено проблему фаголізису в молочній промисловості, дано аналіз особливостей молекулярної структури та еволюції популяцій фагів МКБ. Також представлено пропозиції дослідників щодо вдосконалення класифікації фагів родини Siphoviridae та наведено останні наукові розробки зарубіжних авторів, спрямовані на підвищення фагостійкості штамів лактобактерій.
Матеріали та методи дослідження. У роботі використано музейні культури молочнокислих бактерій колекції ТІММ УААН: Lactococcus lactis ssp. lactis – 26 штамів, L. lactis ssp. diacetilactis – 17 штамів, Lactococcus lactis ssp. cremoris – 34 штамів, Streptococcus salivarus ssp. thermophilus – 68 штамів та 2 штами Enterococcus faecium.
Фаги виділяли зі зразків кисломолочної продукції, сироватки, ропи та змивів з обладнання підприємств молочного профілю різних регіонів України. Титр фагів визначали у бляшкоутворюючих одиницях на мл (БУО/мл). Чисті лінії фагів отримували методом подвійного агару (Адамс М., 1961) шляхом послідовних пасажів фагів з окремих морфологічно однотипних негативних колоній на штамах чутливих бактерій. Для кожного ізоляту проведено шість послідовних пасажів. Завдяки тому, що літична дія бактеріофагів виявлялася на кількох культурах і ряд фагів мали спільних бактерій-хазяїв, при виділенні чистих ліній обмежилися трьома індикаторними культурами.
Загальну чисельність заквашувальної та сторонньої мікрофлори визначали: кількість МКБ згідно з ГОСТ 10444.12, бактерій групи кишкових паличок (БГКП) – ГОСТ 9225-84, дріжджів та плісняви – ГОСТ 10444.11, кількість спороутворюючих бактерій за Банниковою (1987).
Препарати фагів високого титру отримували методом суцільного лізису на агаризованому поживному середовищі (Девис Р. и др., 1984) та в рідкому середовищі – гідролізованому молоці. Визначення кола бактерій-хазяїв фагів проводили із залученням вище названих культур МКБ. Очистку і концентрування фагів здійснювали двома циклами диференціального центрифугування (90 000g, 3 год). Контроль чистоти вірусних препаратів визначали спектрофотометрично та за допомогою електронної мікроскопії. Електронно-мікроскопічний аналіз зразків проводили за загальоноприйнятими методиками, а також методом теплового прикріплення (Габрилович И.М., 1973).
Електрофоретичне дослідження поліпептидного складу фагів здійснювали за методом Laemmli U.K. (1970) з використанням 5% концентруючого і 14% розділяючого гелів та подальшим фарбуванням кумасі блакитним. Для визначення молекулярних мас фагових білків скористалися набором білків-маркерів фірми „Sigma”. Для проведення імунологічних досліджень отримували вірусоспецифічні мишачі поліклональні сироватки. Серологічну спорідненість вірусів вивчали, використовуючи метод непрямого твердофазного імуноферментного аналізу (Кэтти Д., 1991), обчислювали згідно з формулою Арчетті (Троценко Н.И. и др., 1989).
Чутливість фагів до нагрівання характеризували константою швидкості інактивації (КТ) (Габрилович И.М., 1973). Вплив цитрату натрію на репродукцію фагів на агаризованому середовищі визначали за зміною титру фагів, у рідкому середовиші – шляхом моніторингу оптичної густини та рН середовища. Чутливість до хлороформу і осмотичного шоку та стабільність фагів за умов зберігання визначали титруванням методом подвійного агару.
Дослідження бактерій на лізогенність проводили шляхом УФ опромінення культур з подальшим моніторингом оптичної густини, порівнюючи криві росту опроміненої і неопроміненої культур.
Статистичне опрацювання результатів здійснювали за загальноприйнятими методиками варіаційної статистики. Розрахунки проводили за допомогою персонального комп’ютера та з використанням програми „Excel XP”.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Моніторинг фагів молочнокислих бактерій на підприємствах молочного профілю України та їх вплив на якість цільового продукту. Першу серію експериментів було спрямовано на виявлення та виділення фагів зі зразків кисломолочної продукції, підсирних сироватки та ропи, змивів з обладнання підприємств молочного профілю різних областей України. Базуючись на джерелі виділення та морфології негативних колоній з 12 досліджуваних зразків, було ізольовано 13 фагів молочнокислих бактерій. Титри бактеріофагів становили від 102 до 109 БУО/мл (табл.1).
Величина титру фагів впливала на технологічні показники та смакові характеристики отримуваного продукту. Зокрема, при виробництві продукції, в якій титр фагів становив 104 БУО/мл та менше, не спостерігалося суттєвих порушень технологічного циклу, що дало змогу отримати якісний продукт. У разі зростання фагового титру до 106 відмічали уповільнення молочнокислої ферментації, а готовий продукт мав невисокі смакові характеристики. Збільшення титру до 108–109 призводило до зупинення виробництва. Таким чином, проблема запобігання виникнення ситуації масового фаголізису полягає в необхідністі зниження титру фага у цільовому продукті до значень, нижчих від 106 БУО/мл.
Таблиця 1
Джерела виділення фагів та їх титри у продукції
Джерело виділення фага № зразка Фаг Титр фага
БУО/мл Примітки
м. Київ, завод А; кефір 1 1Ф 103
м. Київ, завод В; ряжанка 2 2Ф 104
м. Київ, завод С;
сир кисломолочний 3 3Ф
4Ф 109
108 зупинення виробництва
Київська обл., завод Д; ряжанка 4 5Ф 103
Київська обл., завод Е; ряжанка 5 6Ф 106 збільшення часу вироб-лення, низькі смакові якості
Київська обл., завод К; ряжанка 6 7Ф 109 зупинення виробництва
Сумська обл., завод Л; -біокефір
- ряжанка
- змиви з обладнання (ряжанка) 7 8Ф 106 збільшення часу вироб-лення, низькі смакові якості
8 8/1Ф 106
9 8/2Ф 105
Черкаська обл., сирзавод М;
- сироватка
- ропа 10 – –
11 9Ф
10Ф
11Ф 102
102
102
Полтавська обл., завод Н; ряжанка 12 – – зупинення виробництва
Для з'ясування впливу фага високого титру на якість продукції проведено мікробіологічні дослідження зразків № 3 та № 6, у яких титр фага сягав 108–109 БУО/мл. Результати досліджень показали, що в цих зразках спостерігалося зменшення чисельності МКБ відповідно до 7Ч106 та 6Ч107 КУО/мл, тоді як у продуктах, отриманих за умов стабільної ферментації, кількість заквашувальної мікрофлори зазвичай становить 108–109 КУО/мл. Чисельність бактерій групи кишкових паличок у зразку № 3 перевищувала допустимий рівень, визначений діючими державними стандартами щодо мікробіологічних та санітарно-гігієнічних показників для кисломолочних продуктів, у 4 рази, а в зразку № 6 – у 1000 разів, окрім того, спостерігався ріст спорових бактерій та плісняви (табл. 2).
Таблиця 2
Мікробіологічні дослідження зразків, що містили фаги високого титру
№ зразка Фаг Титр
фага, БУО/мл Кількість мікроорганізмів у зразку, КУО/мл
Загальна чисельність МКБ Спороутво-рюючі плісені та /дріжджі бактерії групи кишкових паличок
3 3Ф
4Ф 109
108 7Ч106 3Ч103 6Ч101/0 4Ч104
6 7Ф 109 6Ч107 2Ч105 5Ч102/2Ч101 3Ч105
Електронна мікроскопія. Згідно з даними електронно-мікроскопічних досліджень, усі фаги мали довгі нескоротливі хвостові відростки (рис.1), а отже, відповідно до рекомендацій Міжнародного комітету з таксономії вірусів (Maniloff J., Ackermann H.-W., 1998), належали до порядку Caudovirales, родини Siphoviridae. Виявлено фаги з ікосаедричними голівками морфотипу В1 та фаги з пролатними голівками морфотипу В2. Згідно з сучасною класифікацією бактеріальних вірусів, лактококові фаги морфотипу В2 віднесено до с2-подібних лактококових фагів (Jarvis A.W. et al., 1991; Moineau S. et al., 2002). Таким чином, ізоляти 2Ф, 3Ф, 9Ф та 11Ф належать до групи с2 (табл. 3).
Таблиця 3
Морфологія віріонів фагів молочнокислих бактерій
Фаги Розмір віріонів, нм Морфотип Група
голівка хвостовий відросток
1Ф 47±1 135±2 В1
2Ф, 3Ф, 11Ф 41±1Ч56±1 110±2 В2 с2
4Ф, 5Ф, 10Ф 46±1 103±2 В1
6Ф, 7Ф, 8Ф, 8/1Ф,8/2Ф 47±1 135±2 В1
9Ф 41±1Ч45±1 64±2 В2 с2
Літична активність і видова специфічність фагів. Дослідження спектру літичної дії фагів дало змогу виділити 4 фагогрупи та визначити індекси їх літичної активності (табл. 4).
Таблиця 4
Літична активність та видова специфічність фагів молочнокислих бактерій
Гру-па Фаги Чутливі штами МКБ, % Iл*
L. cremoris L. lactis L. diacetilactis S. thermophilus
1 6Ф, 7Ф, 8Ф,
8/1Ф, 8/2Ф 5,9 7,7 35,3 26,5 0,19
2 4Ф, 5Ф, 10Ф 2,9 7,7 29,4 25,0 0,18
3 9Ф 2,9 7,7 – – 0,02
4 2Ф, 3Ф, 11Ф – 7,7 – – 0,01
Примітка. *Іл – індекс літичної активності
| 
