|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В.ПАЛЛАДІНА
Кучмеровська Тамара Муратiвна
УДК 577.164.15:612.822.1.
БІОЛОГІЧНА ДІЯ ВІТАМІНУ РР ТА ЙОГО ПОХІДНИХ
У НЕРВОВІЙ СИСТЕМІ
03.00.04 - біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ - 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії
ім.О.В.Палладіна Національної академії наук України.
Науковий консультант - доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України, Донченко Георгій Вікторович, Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, завідувач відділом.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, Київський університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії.
доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Тугай Василь Андрійович, Інститут
біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України, провідний
науковий співробітник.
доктор біологічних наук, професор
Романенко Олександр Вікторович, Національний
медичний університет ім. О.О. Богомольця, завідувач
кафедри біології.
Провідна установа - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії
НАН України (відділ медико-біологічних досліджень).
Захист відбудеться " 29 " березня 2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601 м.Київ-30, вул. Леонтовича 9.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна Національної академії наук України.
Автореферат розісланий " 24 " лютого 2000 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Сучасні біохімічні дослідження в галузі вітамінології спрямовані на з’ясування шляхів обміну та механізмів функціонування вітамінів, серед яких важливе місце належить вітаміну РР та його похідним. Вітамін РР є попередником синтезу нікотинамідних динуклеотидів, які, крім загальновідомої функції як коферментів численних дегідрогеназ, можуть проявляти і некоферментні функції. Так, NAD є алостеричним регулятором активності деяких ферментів енергетичного обміну та біологічної оксидоредукції (Everse et al., 1982), субстратом в процесах моно- та полі-АДФ-рибозилювання ядерних білків та інших макромолекул (McDonald L.J. et al., 1992; Iwasa H. et al., 1994; Han M.K. et al., 1996). Показано також участь NAD в процесах репарації ДНК (Kim H. et al., 1993). Однак, серед вищезгаданих функцій найменш дослідженими є механізми біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі. Згідно з даними літератури відомо, що недостатність вітаміну РР в організмі супроводжується різкими порушеннями з боку ЦНС (Ефремов и др., 1955; Кодинцова В.М., 1992), тому вже досить давно вітамін РР знайшов застосування у клініці для лікування "мозкової форми пелагри" (Joliffe N. et al., 1940).
Такі розповсюджені захворювання нервової системи, як шизофренія, психози різної етіології, епілепсія характеризуються порушенням рівня нікотинамідних динуклеотидів у мозку (Максимович Я.Б., 1981; Cook C., 1998). Відомо, що нікотинова кислота (NА) та її похідні збільшують рівень серотоніну у мозку (Маликова и др., 1969; Williams, 1983), посилюють ефект ряду наркотичних та снодійних речовин (Рыбалова С.С., 1981), діючи як транквілізуючі агенти. Тому стає очевидним, що функціонування нервової системи певною мірою залежить від забезпеченості організму вітаміном РР. З’ясування механізмів такої залежності дозволило б цілеспрямовано впливати на процеси функціонування нервової системи як у нормі, так і при різних її патологічних станах.
Ключем до розкриття механізмів біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі послужило відкриття у збудливих тканинах пуринергічної інервації, а також центральних бензодіазепінових рецепторів (Burnstock G., 1972; Ruano D., 1991).
У зв’язку з цими фактами у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України було сформульовано гіпотезу про можливу реалізацію нейротропної дії вітаміну РР та його похідних. Ця дія може здійснюватись через пурино- (оскільки у молекулі динуклеотидів міститься аденіловий залишок – структурний компонент лігандів пуринорецепторів типу Р1 та Р2) та бензодіазепінові рецептори (нікотинамід (NАm) є ендогенним лігандом бензодіазепінових рецепторів), а також через власний рецептор.
Експериментальним підтвердженням цієї гіпотези стали результати електрофізіологічних та біохімічних досліджень, проведених у нашому відділі спільно з Інститутом фізіології ім. О.О. Богомольця, які показали специфічну дію вітаміну РР та його похідних на передачу гальмівних та збуджуючих імпульсів нервово-м’язевих клітин шлунково-кишкового тракту та сечового міхура (Халмурадов А.Г. и др., 1980; Романенко А.В., 1981).
Ці дослідження були продовжені з метою виявлення більш конкретних біохімічних механізмів, які відповідальні за специфічну дію вітаміну РР та його похідних у функціонуванні збудливих клітин. Для цього були використані адекватні експериментальні моделі порушень функціонування нервової системи, такі як РР-гіповітаміноз, хвороба Паркінсона та ускладнення інсулінзалежного цукрового діабету (ІЗЦД) - діабетична нейропатія.
Мета і завдання досліджень. Метою роботи було з’ясування механізмів біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі та участі NAD у функціонуванні серотонін-, дофамін- та ГАМК-ергічної медіаторних систем головного мозку щурів у нормі та при експериментальних моделях деяких патологій. Для виконання роботи необхідно було вирішити наступні завдання:
- з’ясувати наявність нікотинамідних нуклеотидів і систем їх синтезу та розпаду в синаптосомах, а також можливість рецепції нуклеотидів синаптичними мембранами нервових закінчень “пуринергічних відділів” головного мозку щурів;
- дослідити природу NAD-зв’язуючого мембранного комплексу, його функціональну роль та виділити NAD-зв’язуючий білок (NAD-ЗБ);
- вивчити вплив NAD на процеси вивільнення та поглинання деяких медіаторів синаптичними пухирцями;
- дослідити дію NAD на трансмембранний потенціал плазматичної мембрани нервових закінчень;
- вивчити участь NAD у функціонуванні серотонін- та ГАМК-ергічної медіаторних систем головного мозку щурів за умов різної забезпеченості організму тварин вітаміном РР;
- дослідити нейротропну дію вітаміну РР та NAD на експериментальній моделі паркінсонізму та інсулінзалежного цукрового діабету;
- дослідити окисно-відновний стан нікотинамідних динуклеотидів та функціонування поліолового шляху обміну глюкози у нервовій системі за умов діабетичної нейропатії;
- на вибраних експериментальних моделях дослідити можливу коригуючу дію вітаміну РР та його похідних на процеси вивільнення та зворотнього поглинання деяких медіаторів, окисно-відновний стан, поліоловий шлях обміну глюкози, активності ферментів (NAD-глікогідролази, Na+,K+-ATPази).
Робота виконана у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України відповідно до планів науково-дослідних робіт Інституту.
Наукова новизна і практична значимість роботи. В результаті проведених досліджень одержано ряд вагомих та цінних у теоретичному і практичному відношенні нових результатів. Вперше виявлено існування NAD-модуляторної системи нервових закінчень головного мозку. ЇЇ функція полягає у модуляції процесів вивільнення та зворотнього поглинання серотоніну, дофаміну та ГАМК. Встановлено, що синаптичні мембрани “пуринергічних відділів” головного мозку щурів специфічно зв’язують NAD. Показано, що нікотинамідні динуклеотиди є природними компонентами синаптичних пухирців і синаптосом “пуринергічних відділів” головного мозку щурів та виявлено системи синтезу та розпаду динуклеотидів у нервових закінченнях. Знайдено, що ділянки синаптичних мембран, які рецептують NAD, за своєю природою є гліколіпопротеїдними комплексами. Розроблено умови солюбілізації синаптичних мембран (0,5% луброл РХ), виділено та очищено NAD-ЗБ, молекулярна маса якого становила близько 120 кД. Встановлено, що одним із можливих місць біологічної дії NAD є пресинаптична мембрана нервових закінчень. Вперше показано, що модулююча дія NAD на процеси вивільнення та зворотнього поглинання досліджуваних медіаторів може реалізуватись через зміну трансмембранного потенціалу. На моделях РР-гіповітамінозу, хвороби Паркінсона та діабету показано, що рівень нікотинамідних динуклеотидів у мозку, рецепція нуклеотиду, а також функціонування серотонін-, дофамін- та ГАМК-ергічної медіаторних систем порушені. Вперше продемонстровано, що вітамін РР та нікотиноїл-ГАМК проявляють свою коригуючу дію на функціонування цих медіаторних систем, діючи, можливо, через NAD-ЗБ. Виявлено, що зростання активності NAD-глікогідролази може бути одним із патогенетичних факторів розвитку хвороби Паркінсона. Показано можливість корекції при діабеті окисно-відновного стану нікотинамідних динуклеотидів у мозку та сідничному нерві вітаміном РР та його похідними.
Теоретичне та експериментальне обгрунтування біологічної ролі вітаміну РР та його похідних у нервовій системі, у регуляції клітинного метаболізму в нормі та при патологічних станах, послужило основою для рекомендації застосування нікотинаміду, нікотиноїл-ГАМК та досліджуваних інгібіторів альдозоредуктази для корекції метаболічних порушень при РР-гіповітамінозі, хворобі Паркінсона та за умов діабетичної нейропатії при ІЗЦД.
Вивчення дії нікотиноїл-ГАМК показало доцільність застосування нікотинаміду у комплексній терапії для корекції метаболічних порушень при хворобі Паркінсона та ІЗЦД з метою запобігання як розвитку захворювання, так і усунення його ускладнень.
Особистий внесок здобувача. Результати більшої частини досліджень отримані особисто автором, пошук та аналіз літератури з означеної теми, обговорення одержаних результатів та формулювання висновків здійснені також автором; підрозділ 3.1 та 3.6 виконано автором спільно зі с.н.с. Інституту біохімії Г.В.Чичковською та Г.Й. Фоменко, а підрозділи 3.3 та 3.8 - разом із пров.інж. Інституту біохімії А.П. Клименком.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені в доповідях і обговорювались на Всесоюз. конфер. з нейронаук (Київ, 1986), Всесоюз. Симп. з біохімії ліпідів (Алма-Ата, 1987), X Всесоюз. конфер. з біохімії нервової системи (Горький, 1987), Х Об’єдн. симп. біохім. товариств СРСР-НДР (Ташкент, 1989), конфер. “Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных” (Ташкент, 1990), Всесоюз. конфер. “Клиническая витаминология” (Москва, 1991), XI Iнтерн. симп. з діабету (Регенсбург, Німеччина, 1991), 4-5-му Європейському Конгресах “Control of Metabolism” (Мілан, Iталія, 1990; Нідерланди 1991), 9-му Інтерн. Конгресі з ендокринології (Ніцца, Франція,1992), 6-му Європейському Конгресі “Control of Metabolism and Insulin Action” (Барселона, Іспанія, 1993), Наук. конфер., присвяченій 100-річчю з дня нар. акад. О.І. Черкеса (Київ, 1994), Інтерн. Конгресі з лікування хронічних захворювань ”Patient education 2000” (Женева, Швейцарія,1994), Інтерн. Симп. "Physiological and biochemical basis of brain activity" (Санкт-Петербург, Росія, 1994), робочому симп. США-Японія “Aldose Reductase Workshop” (Кона, Гаваї, 1994), V з’їзді ендокринологів України (Івано-Франківськ, 1994), 6-му Інтерн. cимп. “Pharmacological control of calcium and potassium homeostasis” (Флоренція, Італія, 1994), Міжн. cимп. "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов" (Гродно, Білорусія, 1995), 3-ій конференції біохіміків Узбекистану (Ташкент,1996), 4 Міжн. симп. з діабетичних нейропатій (Нідерланди, 1997), 16-му Міжн. Конгресі Діабетичної Федерації (Хельсинки, Фінляндія, 1997), V-VII Укр. біохім. з’їздах (Київ, 1987, 1992, 1997), 10-11-му Конгресах Європейської Організації з вивчення діабетичних нефропатій, EDNSG (Братислава, Республіка Словакія, 1997; Перес, Франція, 1998), 12-ій Міжн. Конфер. Європейського Товариства з Нейрохімії (Санкт-Петербург, Росія, 1998), 13-му Міжн. Конгресі з Фармакології (Мюнхен, Німеччина, 1998), VI Російскому нац. Конгресі “Человек и лекарство” (Москва, Росія, 1999), 1-2-му Європейському Конгресах з фармакології (Мілан, Італія, 1995; Будапешт, Венгрія, 1999), 4-5-му Світовому Конгресах з нейрохімії Інтерн. Організації з вивчення мозку (Кіото, Японія, 1995; Єрусалим, Ізраїль, 1999), 2,3,6,9-му Конгресах “Neurodiab Diabetic Neuropathy” Європейської Асоціації з вивчення діабету, EASD ( Братислава, Чехословакія, 1992; Стамбул, Туреччина, 1993; Баден, Австрія, 1996; Маастріхт, Нідерланди, 1999), 27,30,32,35-му Щорічному Конгресах EASD (Дублін, Ірландія, 1991; Дюссельдорф, Німеччина, 1994; Відень, Австрія, 1996; Брюсель, Бельгія, 1999), на конференціях та наукових семінарах.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 27 статей та 48 тез доповідей.
Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури (3 підрозділи), опису матеріалів і методів досліджень, результатів та їх обговорення (8 підрозділів), заключення, висновків і списку використаних джерел (678 джерел). Робота викладена на 336 стор. машинописного тексту, ілюстрована 9 схемами, 50 рисунками і 28 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури складається із трьох основних підрозділів. У першому розглянуто біологічну роль вітаміну РР та його похідних, а також їх обмін у живому організмі; у другому проведено аналіз сучасних уявлень про значення вітаміну РР та його похідних, а також пуринергічних сполук у функціонуванні нервової системи; в третьому – наведено літературні дані про зв’язок вітаміну РР та нікотинамідних динуклеотидів з ГАМК-, серотонін- та дофамін-ергічною медіаторними системами та висвітлено роль кожної з них у нервовій системі.
Матеріали і методи досліджень. Для експериментальних досліджень використано щурів-самців лінії Вістар масою 30-300 г.
РР-гіповітаміноз викликали утриманням тварин (масою 30-80 г, 18 діб) на напівсинтетичному раціоні, з виключенням вітаміну РР та внесенням 2% L-лейцину, а також введенням 3-ацетилпіридину (3-АЦП) – антивітаміну РР (50 мг/кг маси тіла). Тварин РР-гіповітамінозної групи розподілено таким чином: а/ тваринам вводили NAm у розрахунку 40 мг/кг маси тіла впродовж 3 діб; б/ вводили NAm у розрахунку 40 мг/кг маси тіла впродовж 7 діб; в/ вводили NAm у розрахунку 40 мг/кг маси тіла впродовж 2-3 тижнів.
Модель хвороби Паркінсона викликали у щурів-самців лінії Вістар масою 200-300 г. внутрішньочеревною ін'єкцією резерпіну (Sigma, 1,5 мг/кг маси тіла) впродовж 7 діб. В експериментах використано тварин з явними ознаками паркінсонізму. Їх поділяли на чотири групи: контрольну, паркінсонічну та дві паркінсонічні групи, які отримували NAm або нікотиноїл-ГАМК (пікамілон) у дозі 200 мг/кг маси тіла щодобово, внутрішньочеревно, впродовж 14 діб.
Експериментальний цукровий діабет моделювали шляхом одноразового внутрішньочеревного введення щурам-самцям лінії Вістар масою 130-160 г стрептозотоцину (Sigma, з розрахунку 70 мг/кг маси тіла). В експериментах використовували тварин, рівень глюкози крові яких досягав 14,5-16,5 ммоль/л. Їх поділяли на чотири групи: контрольну, стрептозотоцин-діабетичну та дві стрептозотоцин-діабетичні, котрі одержували NAm або пікамілон у дозі 200 мг/кг маси тіла щодобово, внутрішньочеревно або внутрішньом’язево впродовж 14 діб, або на п’ять груп, трьом групам стрептозотоцин-діабетичних щурів вводили інгібітори альдозоредуктази: AL-1576, сорбініл, унітіол.
Модель надлишку NAD в організмі викликали: а/ внутрішньочеревним введенням тваринам NAm впродовж тижня по 150 мг/кг маси тіла; б/ введенням NAm впродовж двох тижнів по 200 мг/кг маси тіла; в/ введенням NAm за 6 годин до забою по 500 мг/кг маси тіла.
Адекватність вибраних моделей повністю відповідала меті та завданням досліджень.
Субклітинні фракції (синаптосоми, синаптичні пухирці та синаптичні мембрани) головного мозку щурів, або його окремих відділів, одержували за методом (Abita J. et al., 1977). Окислені NAD(Р) та відновлені NAD(Р)H визначали в кислоторозчинних екстрактах за методом (Klindenberg et al., 1963).
Зв’язування [U-14C]NAD (питома активність 269 мКі/ммоль) синаптичними мембранами головного мозку щурів вивчали радіолігандним методом (Варфоломеев С.Д. и др., 1982). Специфічне зв’язування [U-14C]NAD у кінцевій концентрації 0,32 мкМ визначали як різницю між загальним та неспецифічним зв’язуванням у присутності 1000-кратного надлишку неміченого NAD.
Поглинання та вивільнення [2-14C]серотоніну (57 мКі/ммоль), [2-14C]дофаміну (56 мКі/ммоль), L-[7,8-3Н]норадреналіну (34 Кі/ммоль) та 4-аміно-n[U-14C]ГАМК (228 мКі/ммоль), фірма "Amersham" вивчали згідно (Sanios M.S.V., 1981; Near J.A. et al., 1988; Cuelleron P. et al., 1982; Biggio G. et al., 1986) з деякими модифікаціями.
Кислотні та лужні екстракти печінки, мозку та сідничного нерва одержували при обробці холодною 0,6 н HCIO4 або - 2,8 % розчином КОН на 50% етанолі, в яких кількісно визначали метаболіти: лактат, піровиноградна кислота, малат, сорбітол, фруктоза (Bergmeyer H.U., 1974).
Вміст глюкози визначали оксидазним методом (Marks V. et al., 1963).
Вміст серотоніну та дофаміну визначали методом обернено-фазної ВЕРХ (De Long J. et al., 1983), а вміст ГАМК визначали згідно (Mousah A. et al., 1987).
Активності NAD-глікогідролази (КФ 3.2.2.5), NAD-пірофосфорилази (КФ 2.7.7.1), (Takeshi H., 1986), альдозоредуктази (КФ 1.1.1.21), (Gabbay K.H., 1975) та сорбітолдегідрогенази (КФ 1.1.1.140), (Gerlach U., 1963) визначали спектрофотометрично. Поглинання 45Cа2+ синаптосомами кори головного мозку щурів визначали за (Favre C.J. et al., 1996).
Солюбілізацію, виділення та очищення NAD-зв’язуючого рецепторного білка афінною хроматографією на N6-NAD-модифікованих агарозах здійснювали згідно з розробленими нами методиками. Афінні сорбенти синтезували за: N6-(2-аміноетил)-NAD-агарозу (Егоров А.И. и др., 1978), N6-[(6-аміногексил)-ацетамід]-NAD-агарозу (Mosbach K., 1978; Rieke E.et al., 1979). Ідентифікацію проміжних продуктів і похідних кофермента проводили спектрофотометричними методами у поєднанні з даними тонкошарової та мікротонкошарової хроматографії (Кирхнер Ю., 1981). Ідентифікацію та визначення молекулярної маси NAD-ЗБ проводили електрофоретично в ПААГ з додецилсульфатом натрію (ДСН) (Laemmli U.K., 1970). Трансмембранний потенціал плазматичної мембрани нервових закінчень визначали за поглинанням [3H]тетрафенілфосфонію броміду ([3H]ТФФ+), 20 Кі/ммоль, “Amersham” і розраховували за рівнянням Нернста (Pauwels P.J. et al., 1986).
Результати досліджень та їх обговорення
Нікотинамідні динуклеотиди як складові нервових закінчень та їх зв’язування синаптичними мембранами головного мозку щурів.
Вихідним пунктом дослідження біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі було виявлення їх наявності в головному мозку щурів. Показано, що нікотинамідні динуклеотиди є природними компонентами субклітинних фракцій мозку. Вміст NAD в синаптосомах та синаптичних пухирцях становив 42,0 ± 4,2 і 7,3 ± 0,6, а NADP - 4,3 ± 0,3 і 3,5 ± 0,2 нмоль/г сирої тканини, відповідно.
Було виявлено здатність синаптосом та синаптичних мембран мозку щурів до специфічного розщеплення динуклеотиду NAD-глікогідролазою, 52,4 ± 4,8 і 14,2 ± 1,3З нмоль розщепленого NAD на 1 мг білка/хв. Активність NAD-пірофосфорилази, одного із ферментів синтезу NAD, спостерігалась лише в синаптосомах і становила 0,084 ± 0,006 нмоль синтезованого NAD на 1 мг білка за хв. Оскільки нікотинамідні динуклеотиди є природними компонентами синаптосом, в яких присутні ключові ферменти їх синтезу та розпаду, то було зроблено припущення, що синаптичні мембрани здатні їх рецептувати. Справді, вивчення зв’язування NAD синаптичними мембранами показало, що динуклеотид специфічно зв’язується синаптичними мембранами, при цьому необхідно збереження структурної цілісності його молекули. Аналіз процесу зв’язування NAD у координатах Скетчарда продемонстрував, що на синаптичних мембранах головного мозку щурів існують специфічні NAD-рецепторні ділянки, Кд високоспецифічної компоненти становила 0,34 мкМ, а максимальна кількість місць зв’язування - 4,4 пмоль на 1 мг білка.
Природа NAD-зв’язуючих рецепторних ділянок синаптичних мембран.
Дослідження ділянок синаптичних мембран, які рецептують NAD, дозволило встановити, що в рецепції NAD синаптичними мембранами важливу роль відіграють фосфоліпіди. Використання препаратів фосфоліпаз А2, С та Д показало, що, незважаючи на різний механізм дії на фосфоліпіди мембран, вони однонаправлено діють на процес рецепції NAD, зменшуючи зв’язування [U-14C]NAD на 64, 87 та 60% відповідно. Це є свідченням того, що фосфоліпіди утворюють з білком рецепторний комплекс. При обробці синаптичних мембран нейрамінідазою було встановлено, що гангліозиди також приймають участь у рецепції NAD. Дані результатів обробки синаптичних мембран дитіотреітолом (агент, який відновлює дисульфідні зв’язки білків) та йодацетамідом (агент, що алкілює SH-групи білків) дозволяють стверджувати, що при специфічному зв’язуванні ліганда з білком-рецептором важливу роль відіграють його вільні SH-групи та дисульфідні зв’язки.
Таким чином рецепторні ділянки, що зв'язують NAD є гліколіпопротеїдними комплексами, в ліганд-рецепторний центр котрих входять SH-групи.
Виділення NAD-зв’язуючого білка синаптичних мембран.
У зв’язку з важливістю якісного проведення солюбілізації білків синаптичних мембран, що визначає, у кінцевому результаті, можливість виділення у нативному виді мембранозв’язаних білків, нами було проведено декілька серій експериментів з вибору типу детергента та оптимальних умов солюбілізації.
Для цього вивчали солюбілізуючу здатність холату, дезоксихолату натрію, тритону Х-100 та лубролу РХ. Найкращі солюбілізуючі властивості було виявлено у лубролу РХ при його концентрації 0,5 % і співвідношенні білок-детергент 1:1,5.
На сьогодні одним із кращих методів виділення та очищення рецепторних білків є афінна хроматографія. На основі того, що декілька десятків NAD-залежних дегідрогеназ мають подібну структуру NAD-зв’язуючої ділянки, та приймаючи до уваги, що вони були виділені афінною хроматографією на агарозах з пришитим через С6 –аміногрупу аденілового кільця коферментом, ми припустили, що NAD-ЗБ також можна виділити на афінному сорбенті з лігандом, пришитим до агарози через С6 –аміногрупу аденілового кільця.
Було синтезовано два ліганди: N6-(2-аміноетил)-NAD без "спейсера" та N6-гексаметилен-NAD із "спейсером", які імобілізували на агарозу. На сорбенті без вставки, навіть змінами умов посадки та елюції, не вдалося досягти чіткого розділення білків, тому був використаний сорбент зі "спейсером". Елюйований з афінної колонки NAD-ЗБ виходив одним мажорним піком (рис.1).
Рис.1. Профіль елюції білка-рецептора NAD з колонки N6-[(6-аміногексил) ацетамід]-NAD-агарози (А) та електрофореграма NAD-ЗБ (Б): 1 - NAD-ЗБ; 2 - суміш білків-стандартів (імуноглобулін, 157кД, латротоксин, 130кД, овальбумін, 45кД); 3 – латротоксин і NAD-ЗБ; 4,5 – білки синаптичних мембран.
Методом електрофорезу у ПААГ була визначена молекулярна маса NAD-ЗБ, яка становила близько 120 кД.
Таким чином, у результаті проведених досліджень вдалося підібрати оптимальні умови для солюбілізації NAD-ЗБ без втрати його нативних властивостей. Розроблено методичні підходи для виділення та очищення NAD-ЗБ. Одержані дані свідчать про те, що NAD-ЗБ є функціональною складовою частиною синаптичних мембран нервових закінчень.
Синаптичні пухирці – інструмент для з’ясування нейротропної дії нікотинамідаденіндинуклеотиду в ЦНС.
При вивченні впливу різних концентрацій NAD на поглинання [2-14С]серотоніну, [2-14С]дофаміну, [7-3H]норадреналіну та [U-14С]ГАМК синаптичними пухирцями показано, що поглинання норадреналіну не змінювалося при внесенні в середовище інкубації NAD у концентрації 1 мМ, 1 мкМ, 10 нМ, 1 нМ, 1 пМ (дані не представлені), в той час як поглинання серотоніну збільшувалося на 29, 47, 23, 24 та 18% відповідно (рис.2).
Поглинання ГАМК при внесенні в середовище інкубації NAD в концентрації 10-6 М та 10-3 М зменшувалося на 24 та 30%, відповідно (рис.3). Одержані дані свідчать про те, що NAD модулює процеси поглинання досліджуваних медіаторів синаптичними пухирцями, причому в концентрації 10-6 М ефективніше діє на поглинання [2-14С]серотоніну.
Рис. 3. Поглинання [U-14С] ГАМК синаптичними пухирцями при внесенні NAD: 1 – контроль; 2 – 10-6 М; 3 – 10-3 М.
Вивільнення медіаторів вивчали, виходячи із концепції модулюючої дії NAD, по аналогії з АТР, як на рівні синаптичних пухирців, так і нервових закінчень. Дослідження впливу NAD (10-6 М) на вивільнення серотоніну із навантажених ним синаптичних пухирців показало, що швидкість індукованого NAD вивільнення медіатору найвища впродовж перших чотирьох хвилин, і була підвищенною приблизно на 40% порівняно зі спонтанним вивільненням. Однак, при збільшенні часу інкубації вивільнення сповільнювалось і рівень його ставав постійним (рис.4).
Для з'ясування питання, наскільки специфічною є взаємодія синаптичних пухирців та синаптичних мембран для прояву дії NAD, використано синаптичні мембрани і мембрани еритроцитів. При внесенні в інкубаційне середовище синаптичних мембран мозку щурів та Са2+ спостерігалось збільшення вивільнення серотоніну із пухирців (рис.4). При цьому спонтанне вивільнення серотоніну при внесенні синаптичних мембран і Са2+ збільшувалось на 22%, в той час як при внесенні NAD і Са2+ вивільнення серотоніну зростало більш інтенсивно. Сумісна дія NAD, Са2+ і синаптичних мембран призводила до збільшення вивільнення серотоніну на 28%, порівняно з вивільненням, викликаним тільки NAD та Са2+, що може бути свідченням того, що пресинаптична мембрана відіграє важливу роль у реалізації нейротропної дії NAD. Тобто, пресинаптична мембрана нервових закінчень є одним із можливих місць дії NAD у ЦНС.
Рис.4. Вивільнення [2-14С]серотоніну із синаптичних пухирців:
1-спонтанне; 2-при внесенні синаптичних мембран і Са2+; 3- NAD, 10-6М і Са2+; 4-NAD, Са2+ i синаптичні мембрани.
Підтвердженням цього стали дані, які показали, що ні спонтаннe, ні індукованe NAD вивільнення серотоніну не змінювалось при внесенні мембран еритроцитів.
Вплив нікотинамідаденіндинуклеотиду на трансмембранний потенціал плазматичної мембрани синаптосом кори головного мозку щурів.
Вивільнення та поглинання нейромедіаторів – це процеси, які тісно пов’язані із деполяризацією та реполяризацією мембран, зміною їх трансмембранного потенціалу. Тому важливо було дослідити можливість динуклеотиду впливати на трансмембранний потенціал плазматичної мембрани нервових закінчень, який при різних фізіологічних станах зазнає змін, особливо при дії на мембрани нервових закінчень різноманітних агентів.
Було виявлено, що NAD концентраційно-залежно знижував трансмембранний потенціал плазматичної мембрани синаптосом кори головного мозку щурів, причому найефективніше у концентрації 10-6 М. Дію NAD на трансмембранний потенціал плазматичної мембрани нервових закінчень порівнювали з дією нейротоксину вератридину, який знижує поглинання [3H]ТФФ+ (рис.5).
Рис. 5. Поглинання [3H]ТФФ+ синаптосомами кори головного мозку щурів при дії NAD і вератридину (1 – контроль; 2 – внесення NAD; 3 – внесення вератридину)
NAD також інгібував поглинання [3H]ТФФ+ подібно вератридину, однак його дія була менш значною.
Оскільки нами показано, що NAD концентраційно-залежно впливає на трансмембранний потенціал плазматичної мембрани синаптосом то, вірогідно, що дія нуклеотиду цілком або частково реалізується через іонні канали збудливих мембран.
Вплив NAD на натрієві канали оцінювали за вивільненням [2-14C]серотоніну із синаптосом головного мозку щурів. Їх інкубували в середовищі, до якого вносили тетродотоксин, специфічний блокатор натрієвих каналів, дія котрого на вивільнення медіаторів відома. При внесенні у середовище інкубації тетродотоксину, вивільнення [2-14C]серотоніну із попередньо навантажених медіатором синаптосом знижувалось на 43,7% порівняно з контролем. При вивченні впливу NAD на вивільнення [2-14C]серотоніну на фоні дії тетродотоксину було виявлено, що нуклеотид в концентраціях (10-5-10-7М) послаблював дію тетродотоксину, причому дія динуклеотиду виявилася найефективнішою в концентрації 10-6М. При цій концентрації вивільнення медіатору збільшувалося на 28,4% порівняно з вивільненням, викликаним дією тетродотоксину. Тобто, дія NAD на трансмембранний потенціал плазматичної мембрани, імовірно, здійснюється через натрієві канали пресинаптичної мембрани нервових закінчень.
Функціональний зв’язок вітаміну РР та його похідних з серотонін- та ГАМК-ергічною системами головного мозку щурів при різній забезпеченості організму вітаміном РР.
Для доказу висловленого нами припущення, що терапевтичний ефект вітаміну РР та його похідних може реалізуватися опосередковано через NAD, вивчали вплив нуклеотиду на серотонін- та ГАМК-ергічну медіаторну системи головного мозку за умов різної забезпеченості щурів вітаміном РР. Найбільш зручною моделлю для вивчення цього зв’язку є РР-гіповітаміноз, оскільки внесений до раціону тварин L-лейцин порушує як синтез NAD, так і утворення серотоніну із триптофану. Другу модель РР-недостатності створено введенням 3-АЦП – антивітаміну РР. У печінці та мозку щурів, яких утримували на РР-гіповітамінозному раціоні, вміст NAD знижувався на 30,4 та 30,6 %, NADP - на 88,7 та 81,7 %, NADH - на 35,8 % і NADPH - на 36,7 та 35,3% відповідно, порівняно з контрольними тваринами, які отримували повноцінний напівсинтетичний раціон. Зменшення вмісту нікотинамідних динуклеотидів можна пояснити як відсутністю вітаміну РР у раціоні тварин, так і гальмуванням їх синтезу з триптофану при внесенні L-лейцину. До того ж при РР-гіповітамінозі має місце порушення функціонування NAD(P)-залежних дегідрогеназ у печінці та інших тканинах.
Введення щурам NAm (40 мг/кг маси тіла впродовж 3 діб) за умов недостатності вітаміну РР призводило до нормалізації рівня нікотинамідних
динуклеотидів не тільки у печінці, але і в мозку тварин, що є доказом інтенсифікації їх біосинтезу. При введенні щурам 3-АЦП (50 мг/кг маси тіла, 2 доби) також виявлено зміни вмісту окислених та відновлених нікотинамідних нуклеотидів у печінці та мозку. Наші дослідження показали, що максимальний синтез нікотинамідних динуклеотидів при введенні NAm (500 мг/кг маси тіла) в мозку тварин також досягає максимуму через 6 годин, але менш виражено в порівнянні з печінкою, що можна пояснити обмеженим проникненням NAm у мозок через ГЕБ.
У мозку РР-гіповітамінозних тварин було виявлено зниження рівня серотоніну порівняно з контролем на 20%. Однак, не вдалося виявити кореляції між рівнем NAD та серотоніну при введенні NАm (табл.1). Так, через три доби після введення NAm на фоні нормалізації рівня NAD рівень серотоніну не змінювався. Одержані дані можна пояснити тим, що, очевидно, внесений до раціону РР-гіповітамінозних щурів L-лейцин гальмує синтез серотоніну з триптофану, в той час як із введеного NAm синтезувався NAD. Однак через три тижні при щоденному введенні NАm ( 40 мг/кг маси тіла) вміст серотоніну в мозку досягав рівня контрольних тварин, що в свою чергу супроводжувалося поліпшенням загального стану РР-гіповітамінозних щурів. При стимуляції синтезу NAD введенням NAm в дозі 500 мг/кг маси тіла за 6 годин до забою вміст серотоніну в мозку щурів збільшувався на 17%, що, можливо, відбувається за рахунок інгібування надлишком нікотинаміду активності триптофанпіролази, з утворенням серотоніну з триптофану (табл.1).
Таблиця 1. Вміст NAD та серотоніну у головному мозку щурів за умов різної забезпеченості організму вітаміном РР (M±m, n=7)
Для з’ясування можливого зв’язку систем рецепції NAD та серотоніну в головному мозку щурів вивчали зв’язування, поглинання та вивільнення серотоніну, а також вплив in vitro на ці процеси NAD при різній забезпеченості тварин вітаміном РР.
При РР-гіповітамінозі, водночас зі зниженням специфічного зв’язування NAD спостерігалось зниження рецепції серотоніну синаптичними мембранами на 40 та 20% відповідно, порівняно з контролем, яке поверталось до рівня контролю не через 3 та 7 діб, а лише через 3 тижні при щодобовому введенні NАm. Аналіз даних зв’язування [U-14C]NAD синаптичними мембранами у координатах Скетчарда показав, що при РР-гіповітамінозі не змінюється спорідненість NAD до рецептору, про що свідчить те, що КД1 та КД2, які становлять 0,6 та 1,9 мкМ, відповідно, не відрізняються від відповідних величин контролю, в той час як кількість ділянок зв’язування нуклеотиду знижується, про що свідчить зниження максимального зв’язування ліганда (рис.6).
Рис 6. Специфічне зв’язування [U-14С]NAD синаптичними мембранами (А) та вираження цих даних у координатах Скетчарда (Б): 1 - контроль,
2 - PP-гиповітаміноз.
При введенні 3-АЦП cпостерігалась подібна закономірність, але менш виражена.
Нами показано, що при РР-гіповітамінозі поглинання [2-14C]cеротоніну синаптосомами головного мозку щурів знижувалось як у контрольних, так і піддослідних тварин, яким вводили надлишкові дози NАm (рис.7). У головному мозку РР-гіповітамінозних щурів не тільки знижується поглинання [2-14C]серотоніну синаптосомами, але й гальмуюча дія NAD. Зміну цих
Рис. 7. Поглинання [2-14С]серотоніну при дії NAD (10-5 M) та NAm:
1 - контроль; 2 - контроль + NAD; 3 - контроль + NAm 500 мг/кг за 6 год; 4 - контроль + NAm 500 мг/кг за 6 год. + NAD; 5 - РР-гіповітаміноз; 6 - РР-гіповітаміноз + NAD; 7 - РР-гіповітаміноз + NAm 40 мг/кг, 3 доби; 8 - РР-гіповітаміноз + NAm 40 мг/кг, 3 доби + NAD; 9 - РР-гіповітаміноз + NAm 40 мг/кг, 7 діб; 10 - РР-гіповітаміноз + NAm 40 мг/кг, 7 діб + NAD; 11 - РР-гіповітаміноз + NAm 40 мг/кг, 3 тижні; 12 - РР-гіповітаміноз + NAm 40 мг/кг, 3 тижні + NAD.
показників можна пояснити, по-перше, низьким вмістом серотоніну у мозку тварин при РР-гіповітамінозі, а, по-друге, зменшенням кількості NAD-рецепторних ділянок синаптичних мембран.
Важливе значення для розуміння функціонування серотонінергічної медіаторної системи має дослідження процесу вивільнення медіатору з нервових закінчень.
Виявлено, що початкова швидкість вивільнення [2-14C]серотоніну із попередньо навантажених медіатором синаптосом досить висока і вже через 3 хв інкубації вивільнюється більш ніж 60% поглинутої радіоактивності (рис.8). Внесення NAD (10-5М) in vitro у середовище інкубації призводило до стимуляції вивільнення серотоніну із синаптосом на 25% порівняно із його спонтанним вивільненням. При РР-гіповітамінозі вивільнення міченого серотоніну із попередньо навантажених ним синаптосом головного мозку щурів знижується на 21% порівняно з контролем. За цих умов спостерігається стимулюючий ефект NAD на вивільнення серотоніну із синаптосом, яке досягає рівня вивільнення у контролі. Нормалізація функціонування серотонінергічної медіаторної системи, а саме процесів вивільнення [2-14C]серотоніну із синаптосом головного мозку щурів, а також поглинання, досягається лише через 3 тижні після щодобового введення щурам лікувальної дози вітаміну РР.
Рис. 8. Вивільнення [2-14C]серотоніну із синаптосом головного мозку щурів при дії NAD (10-5 М) in vitro.
Дослідження стану як NAD-рецепторної, так і серотонінергічної медіаторної систем головного мозку щурів при РР-гіповітамінозі дозволяє стверджувати, що їх порушення є однією із причин серйозних розладів нервової системи, які мають місце при пелагрі у людини.
Показана нами модулююча дія NAD на серотонінергічну медіаторну систему не виключає можливості впливу вітаміну РР, а також NAD і на інші важливі медіаторні системи мозку.
Справді, встановлено модулюючу дію NAD і на ГАМК-ергічну медіаторну систему, яка при РР-гіповітамінозі зазнає змін. Так, поглинання [U-14C]ГАМК синаптосомами РР-гіповітамінозних щурів знижується порівняно з контролем на 20% (рис.9).
Рис. 9. Поглинання [U-14C]ГАМК синаптосомами головного мозку щурів: А – контроль, Б - РР-гіповітаміноз.
Внесення NAD (10-6 М) в інкубаційне середовище призводило до зниження поглинання ГАМК на 24% у тварин контрольної групи і всього на 9% - у РР-гіповітамінозних тварин. Менш виражений ефект NAD на поглинання ГАМК у РР-гіповітамінозних тварин спостерігався, можливо, за рахунок зменшення кількості специфічних ділянок зв’язування NAD синаптичними мембранами. Введення NAm знижувало поглинання синаптосомами екзогенної ГАМК, що подовжувало час існування ГАМК у синаптичній щілині та могло б призводити до активації ГАМК-ергічної передачі.
Реалізація нейротропної дії вітаміну РР та його похідних при експериментальному паркінсонізмі щурів.
Для більш детального з’ясування біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі була використана модель хвороби Паркінсона.
При визначенні вмісту нікотинамідних динуклеотидів у мозку та синаптосомах головного мозку щурів із експериментальним паркінсонізмом було виявлено зниження рівня NAD та NADP на 32 і 21% та на 28 і 22% відповідно, порівняно з контролем (табл.2).
При введенні експериментальним тваринам NAm та нікотиноїл-ГАМК (пікамілон), як свідчать представлені в табл. 2 дані, спостерігалось відновлення рівня NAD у мозку та синаптосомах при введенні нікотинаміду, в той час як пікамілон виявився менш ефективним.
|
