|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
ГЛУШАКОВ ОЛЕКСАНДР ВІКТОРОВИЧ
УДК 611.839.3:612.822:615.015.44
АТФІНДУКОВАНІ СТРУМИ В НЕЙРОНАХ ПІДСЛИЗОВОГО СПЛЕТІННЯ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА МОРСЬКОЇ СВИНКИ
03.00.02біофизика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
КИЇВ 1999
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
Науковий керівник– академік НАН України, доктор біологічних наук, професор Скок Володимир Іванович, зав. відділом фізіології вегетативної нервової системи, Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Офіційні опоненти:
1. академік НАН України, доктор медичних наук, професор Шуба Михайло Федорович; зав. відділом нервово-м`язевої фізіології, Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
2. кандидат біологічних наук Войтенко Нана Володимирівна, ст. науковий співробітник Міжнародного Центру молекулярної фізіології.
Провідна установа:
Інститут фізіології при Національному університеті ім. Тараса Шевченка.
Захист відбудеться “ 8 ” червня 1999 р. на засідані вченої ради Д26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 252024 м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
Автореферат розісланий “ 20 ” квітня 1999 р.
Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.
Загальна характеристика роботи
Актуальність проблеми. Сучасні дослідження показують, що аденозин 5`трифосфат (АТФ) приймає участь у міжклітинній сигналізації, що здійснюється в результаті активації специфічних Р2пуринорецепторів, які за функціональними ознаками розділяють на дві основні групи іонотропні (Р2Х), які безпосередньо зв’язані з іонним каналом і метаботропні (P2Y), біологічні ефекти яких здійснюються за участю ГТФзв`язуючих протеїнів (Gбілків) (Abbracchio and Burnstock, 1994). Внаслідок активації постсинаптичних Р2пуринорецепторів, АТФ може брати участь у “швидкій” синаптичній передачі, виступаючи в ролі збуджуючого передавача на багатьох об’єктах, у тому числі в міжнейрональних синапсах центральної (Edwards et al., 1992) та вегетативної нервової системи (Evans et al., 1992; Sylinsky et al., 1992; Galligan and Bertrand, 1994; LePard et al., 1997). Крім того, АТФ може впливати на функціонування інших синаптичних рецепторів, зокрема нікотинових холінорецепторів (НХР), при чому модуляторний ефект здійснюється, або в результаті безпосередньої взаємодії АТФ з НХР (Igusa, 1988; Mozrzymas and Ruzzier, 1992; Nakazawa and Igusa, 1993; Nakazawa, 1994a), або через систему вторинних посередників (Lu and Smith, 1991; Nakazawa, 1994b).
У нейронах інтрамуральних гангліїв кишечника достатньо добре вивчено роль НХР у швидкій збуджуючій синаптичній передачі. Дослідження останніх років дають вагомі підстави розглядати АТФ в якості швидкого збуджуючого нейропередавача в цих гангліях. Відомо, що АТФ може виділятися з ентеральних нейронів у фізіологічних умовах (White, 1982, 1988; White and Leslie, 1982; Burnstock 1972, 1981) і, з іншого боку, АТФ викликає вхідні трансмембранні струми в поодиноких нейронах у результаті активації неселективних іонних каналів, що керуються Р2пуринорецепторами (Bertrand and Galligan, 1992; BarajasLopes et al., 1993, 1994, 1996; Zhou and Galligan, 1996). Детально вивчені Р2пуринорецептори в нейронах міентерального сплетіння. Показано участь постсинаптичних Р2пуринорецепторів у швидкій нехолінергічній синаптичній передачі між даними нейронами (Galligan and Bertrand, 1994; LePard et al., 1997). Пуринорецептори нейронів підслизового сплетіння (ПС) досліджені значно менше, і немає даних про вплив АТФ на НХР.
Мета роботи полягала у вивченні електрофізіологічних і фармакологічних властивостей пуринорецепторів нейронів ПС тонкого кишечника морської свинки, а також вивчення дії АТФ на струми НХР.
Головні завдання.
1. Дослідити механізми активації Р2пуринорецепторів ПС з боку АТФ та вплив мембранного потенціалу та дози АТФ на АТФіндуковані струми.
2. Дослідити дію селективних агоністів та антагоністів на Р2пуринорецептори ПС.
3. Дослідити дію класичних блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми ПС.
4. Вивчити вплив АТФ та інших агоністів пуринорецепторів на струми НХР.
Наукова новизна. У нейронах ПС методом фіксації потенціалу петчклемп у конфігурації “ціла клітина” досліджені АТФ-індуковані струми. Вперше показано наявність у даних нейронах двох типів іонотропних Р2пуринорецепторів— з швидкою та повільною десенситизацією. Вперше для даних нейронів методом петчклемп зареєстровані повільні вхідні К+струми, які виникають внаслідок активації Р2Yпуринорецепторів, що зв`язані з Gбілками. Вивчено дію на АТФ-індуковані струми блокаторів Р2пуринорецепторів сураміну та реактиву синього 2, а також класичних блокаторів НХР триметафану, гексаметонію та dтубокурарину. Вперше зареєстровано ефект пригнічення АХ-індукованих струмів (АХ-індукованих струмів) АТФ, який не пов’язаний із взаємодією АТФ безпосередньо НХР. Висунуто припущення, що пуринорецептори та НХР функціонують у взаємному зв’язку. Результати роботи дозволяють припустити, що АТФ може приймати участь у синаптичній передачі в якості швидкого збуджуючого нейропередавача в більшості нейронів ПС, а також у деяких нейронах може діяти як повільний гальмівний передавач.
Теоретичне та практичне значення роботи. Результати досліджень представляють інтерес для біофізиків, фізіологів та фармакологів, оскільки дають нову інформацію про фунціонування Р2пуринорецепторів та НХР, що лежать в основі міжнейронної синаптичної передачі в ПС і можуть бути використані для дослідження механізмів дії фармакологічних препаратів, що використовуються для лікування захворювань шлунковокишкового тракту.
Особистий внесок здобувача в розробку наукових результатів.:
1. Встановлено існування двох типів іонотропних Р2Хпуринорецепторів, а також метаботропних Р2Y-пуринорецепторів в нейронах ПС і вивчено механізми активації Р2Хпуринорецепторів з боку АТФ та їх електрофізіологічні і фармакологічні властивості.
2. Досліджено дію селективних агоністів та антагоністів АТФ і класичних блокаторів НХР на струми, викликані активацією Р2пуринорецепторів та нікотинових холінорецепторів.
3. Описано зв`язок між Р2Х-пуринорецепторами та НХР.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 200 найменувань. Робота викладенна 126 сторінках та містить 25 рисунків і 1 таблицю.
Апробація роботи. Результати досліджень, наведених в дисертаційній роботі, доповідались і обговорювались на семінарах відділу фізіології вегетативної нервової системи, загальноінститутських семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, на Міжнародній робочій нараді “Внутрішньоклітинна сигналізація” ХХХIII Міжнародного конгресу фізіологічних наук (Київ, 1997) та I Загальноукраїнській конференції по нейронаукам (Київ, 1998). За матеріалами дисертації опубліковано 3 роботи.
Матеріали і методи.
Експерименти проводили на дисоційованих нейронах ПС тонкого кишечника морської свинки. Тварин незалежно від статі вагою 200300 г вбивали зміщенням шийних хребців без анестезії і швидко обезкровлювали розрізанням головних шийних кровеносних судин. Сегмент (23 см в довжину) клубової кишки відрізали на відстані 1520 см від ілеоцекального сфінктера, переносили в нормальний зовнішньклітинний розчин і розрізали уздовж осі. Видаляли слизову оболонку, а потім відділяли підслизову оболонку від прошарку повздовжніх м`язів. Ізольовану підслизову оболонку занурювали в розчин колагенази (2 мг/мл, Sigma, тип 1A) і трипсину (0.2 мг/мл, Boeringer Mannheim), приготованому на безкальцієвому і безмагнієвому зовнішньоклітинному розчині, і витримували при температурі 37°C від 20 до 40 хв. при періодичному піпетуванні. Зовнішньоклітинний розчин мав слідуючий склад (в ммоль/л): NaCl, 164; KCl, 4; MgCl2, 1; CaCl2, 1; MOPS (3[Nморфоліно]пропансульфонова кислота), 5; глюкоза, 11 (значення pH 7.4 встановлювали за допомогою титрування NaOH).
Трансембранні струми реєстрували за допомогою методики петчклемп у стандартній конфігурації “ціла клітина” і у модифікованій- “perforatedpatch”. Мікропіпетки для реєстрації, заповнені внутрішньоклітинним розчином, мали опір 35 MОм. Внутрішньоклітинний розчин мав слідуючий склад (в ммоль/л): Кглюконат, 144; CsF, 1; CaCl2, 1; MgCl2, 1; EGTA, 11; HEPES, 5 (значення pH 7.4 встановлювали за допомогою титрування КOH). В ряді експериментів для усуненя калієвих провідностей Кглюконат заміщували Сsглутаматом або NaCl в еквімолярній концентрації. В частині експериментів у внутрішньоклітинні розчини добавляли Na2ATP (або МgАТФ) у концентрації 2 ммоль/л і Na2ГТФ (або Li4ГТФ-γ-S) у концентрації 0.2 ммоль/л. Для проведення експериментів за допомогою методики “perforatedpatch” у внутрішньоклітинний розчин добавляли вихідний розчин ністатіну до кінцевої концентрації 50 мкг/мл.
Аплікації агоністів і антагоністів проводили за допомогою локальної швидкострумінної системи з двох спарених трубочок. Кінчик подвійної трубочки був розміщений на відстані 3050 мкм від клітини. Нормальний зовнішньоклітинний розчин і розчин, що містив досліджувану речовину витікли з різних трубочок (діаметр кінчика близько 100 мкм). Клітина постійно знаходилась у потоці нормального розчину. Заміну розчинів проводили зміщуючи систему так, щоб клітина опинялась у потоці розчину, що містив досліджувану речовину. В ряді експериментів АТФ та ацетилхолін аплікували іонофоретично через скляні мікроелектроди, заповнені розчинами Na2АТФ (0.5 моль/л) та ацетилхолінхлориду (0.52 моль/л), а інші речовини аплікували через перфузійний розчин.
РЕЗУЛЬТАТИ
Дію екзогенного АТФ було досліджено на 146 нейронах ПС тонкого кишечника морської свинки у таких серіях експериментів.
Загальна характеристика струмів, викликаних аплікаціями АТФ.
При потенціалі на мембрані 50 мВ аплікація АТФ у концентрації 100 мкмоль/л через перфузуючий розчин викликала вхідний струм з амплітудою в декілька сотень пікоампер в 56 з 82 (68%) досліджених нейронів. При використанні швидкої аплікації АТФ під тиском або іонофоретичної аплікації майже всі досліджені нейрони (56 з 58 досліджених нейронів) відповідали появою вхідного струму з швидким наростанням. При таких способах аплікації в деяких нейронах спостерігались повільні вихідні струми.
У більшості нейронів спостерігались відповіді на аплікації як АТФ, так і ацетилхоліну (104 з 146 досліджених) , але траплялись нейрони, що відповідали тільки на ацетилхолін (30 з 146) або тільки на АТФ (8 з 146), або не відповідали на аплікації жодного із даних реагентів (4 з 146). АТФ та АХ-індуковані струми спостерігались незалежно від того, були присутні чи ні у внутрішньоклітинному розчині АТФ (2 ммоль/л) та гуанозин 5`трифосфат (ГТФ) (0.2 ммоль/л), або ГТФ був заміщений гуанозин 5`Отіотрифосфатом в еквімолярній концентрації (n=5) при застосуванні стандартної методики петч–клемп у конфігурації “ціла клітина”, або при застосуванні модифікованої методики “perforated patch”. У всіх випадках при аплікаціях тривалістю 160 с з інтервалами 26 хв. амплітуда АТФ і АХ-індукованих струмів, залишалась на однакому рівні протягом 13 годин.
Два типи струмів, що швидко наростають. При використанні аплікації АТФ під тиском спостерігались два типи відповідей, які відрізнялись між собою кінетікою наростання струму та рівнем десенситизації залучених рецепторів (Рис.1А,Б). АТФ-індуковані струми виникали внаслідок підвищення провідності мембрани. Відповіді першого типу (Рис.1A) спостерігались у 29 з 32 досліджених нейронів. Затримка між включенням аплікації та початком струму складала не більш ніж 50 мс при аплікації під тиском і близько 30 мс при використанні іонофоретичної аплікації і була такою ж, як і для АХ-індукованих струмів (Рис.1В). При повторній аплікації струми такої ж амплітуди спостерігалісь через 2060 с від попередньої аплікації при тривалості аплікацій 210 с.
Відповіді другого типу (Рис.1Б) спостерігалісь у 3 з 32 досліджених нейронів. АТФ-індуковані струми мали таку ж затримку від моменту включення аплікації до початку активації струму, як і в попередньому випадку. Максимального значення АТФ-індукований струм набував через
Рис.1 Два типи вхідних АТФ-індукованих струмів. (Пояснення в тексті).
менш ніж 100 мс від його початку, і цей час був менший, ніж для АХ-індукованих струмів (Рис.1Г). Десенситизація пуринорецепторів ніяк не впливала на АХ-індуковані струми . Аплікація ацетилхоліну (100 мкмоль/л) одразу після аплікації АТФ (50 мкмоль/л), при інтервалі між аплікаціями менше 20 с викликала струми такі ж, як і в контролі (струми, отримані перед і після аплікацій АТФ (50–100 мкмоль/л) з інтервалами між аплікаціями в кілька хв. ), у той час коли, у випадку парних аплікацій АТФ (50 мкмоль/л) тривалістю 1 с з таким же інтервалом між аплікаціями, друга аплікація не викликала появи струму. Для повного відновлення амплітуди АТФ-індукованого струму при парних аплікаціях тривалістю 1 с було потрібно не менше 34 хв.
Повільні вихідні АТФ-індуковані струми . При іонофоретичних аплікаціях АТФ тривалістю декілька секунд і при використанні калієвого внутрішньоклітинного розчину, крім швидких деполяризуючих струмів у 3 нейронах з 26 досліджених спостерігались вихідні струми з повільною активацією та повільною інактивацією. Вихідний струм спостерігали через кілька секунд від початку аплікації АТФ (Рис.2А). У випадку парних аплікацій АТФ, коли друга аплікація відбувалася на фоні повільного вихідного струму, амплітуда сумарної відповіді дорівнювала алгебраїчній сумі значень вхідного і вихідного струмів (Рис.2Б). Вихідний струм, який виникав після другої аплікації, мав таку ж величину, як і після попередньої. Амплітуда повільних АТФ-індукованих струмів поступово зменшувалась під час реєстрації, тобто спостерігався так званий ефект “rundown”. Повільний вихідний струм повністю зникав через 40–50 хв. від моменту встановлення конфігурації ”ціла клітина”, і цей процес значно прискорювався, коли внутрішньоклітинний розчин не містив АТФ і ГТФ. У таких умовах генерація вихідного струму припинялась вже через 5–7 хв. від початку реєстрації.
Рис.2 Повільний вихідний АТФіндукований струм.
А запис струму, викликаного іонофоретичною аплікацією АТФ. Б АТФ-індуковані струми, викликані парною аплікацією АТФ.
Концентраційна залежність вхідних АТФ-індукованих струмів. Концентраційну залежність вивчали шляхом аплікації АТФ у діапазоні концентрацій 11000 мкмоль/л до тієї ж самої клітини при потенціалі на мембрані 50 мВ. Аналіз концентраційної залежності показав, що доза, яка викликає напівмаксимальну відповідь (ЕС50), дорівнює 45.7±3.5 мкмоль/л (з графіка ЛайнуівераБерка). Коєфіцієнт Хілла складав в середньому 2 (з графіка Хілла).
Потенціалозалежність вхідних АТФ-індукованих струмів. Залежність амплітуди АТФ-індукованого струму від потенціалу на мембрані визначали шляхом аплікацій АТФ тривалістю 12 с у концентраціях 50 мкмоль/л та 1 ммоль/л при підтримуваних мембранних потенціалах необхідної величини; інтервали між аплікаціями становили 90 с. Для усунення активації калієвих провідностей при позитивних мембранних потенціалах у дослідах використовували внутрішньоклітинний розчин, основим катіоном в якому був Cs+. Потенціал реверсії АТФ-індукованого струму залежав від концентрації АТФ і мав значення відповідно 16.7±2.7 (n=3) і 27.5±3.3 (n=3) при концентраціях АТФ 50 мкмоль/л і 1 ммоль/л. В області позитивних потенціалів нахил графіків вольтамперної залежності зменшувався, що нагадувало так званий ефект випрямлення, властивий нейрональним НХР. При позитивних потенціалах спостерігався незначний вихідний АТФ-індукований струм. Аплікації ацетилхоліну (50100 мкмоль/л) при позитивних потенціалах не викликали появи струму.
Ефект двовалентних катіонів. Вилучення із зовнішньоклітинного розчину двовалентних катіоннів Са2+ та Mg2+ призводило до збільшення АТФ-індукованого струмуу, і середня амплітуда струму в цьому випадку складала 117±6% (n=3) від контрольного значення. Той факт, що АТФіндуковані струми спостерігаються, коли клітини знаходяться в розчині, де відсутні двовалентні катіони говорить про те, що дані струми виникають за рахунок взаємодії з рецептором АТФ у формі аніона, а не комплексу MgАТФ або СаАТФ.
Eфекти структурних аналогів АТФ.
Для визначення підтипу пуринорецепторів було проведено серію експериментів по вивченню дії селективних агоністів та структурних аналогів АТФ.
Аплікації аденозину (100300 мкмоль/л), α,βМеАТФ (100 мкмоль/л), β,γМеАТФ (100 мкмоль/л) і β,γімідоАТФ (100300 мкмоль/л) не викликали появи трансмембранних струмів. При аплікації АТФ (100 мкмоль/л) у присутності α,βМеАТФ (100 мкмоль/л) амплітуда АТФ-індукованого струму складала близько 50% контрольного значення (n=3). Даний ефект був оборотним. Речовини β,γМеАТФ, β,γімідоАТФ і аденозин у цьому аспекті були неактивними. Аплікація α,β-Me-ATP до нейронів з відповідями на АТФ з швидким спадом також викликала вхідні струми. Амплітуда відповіді на α,β-Me-ATФ (100 мкмоль/л) була такою ж, як і у випадку ATФ (100 мкмоль/л). Приведені результати дозволяють висунути припущення, що струми з повільним і швидким спадом викликані в результаті активації різних P2X-пуринорецепторів.
Дія блокаторів Р2пуринорецепторів.
Блокатор Р2пуринорецепторів сурамін у концентрації 50300 мкмоль/л з преінкубацією протягом 13 хв. не виявляв помітного впливу на струми, що були викликані аплікацією АТФ (100 мкмоль/л) через перфузію (Рис.3А), а також на АХ-індуковані струми . При апплікації АТФ під тиском у насичуючій концентрації (200 мкмоль/л) у присутності сураміну (100 мкмоль/л) спостерігався вплив на кінетику активації АТФ-індукованого струму, без помітного впливу на амплітуду струму (Рис.3Б).
Блокатор Р2Yпуринорецепторів реактив синій 2 (30100 мкмоль/л) (Abbracchio and Burnstock, 1994), у випадку преінкубації до 4 хв. оборотно збільшував амплітуду АТФ-індукованого струму в порівнянні з контрольним значенням (n=7). Коли реактив синій 2 аплікували одночасно з АТФ, амплітуда струму складала 110130% від контрольного значення. При аплікації реактиву синього 2 у відсутності АТФ активації трансмембранного струму не спостерігалось. При довготривалій (понад 4 хв. ) преінкубації нейронів у розчині реактиву синього 2 спостерігалось поступове зниження амплітуди АТФ-індукованого струму. Через 20 хв. амплітуда АТФ-індукованого струму складала близько 80% контрольного значення. Після відмивання протягом 1015 хв. амплітуда залишалась на такому ж рівні (n=3). Реактив синій 2 у вищезгаданних концентраціях оборотно пригнічував ацетилхолінові струми. Амплітуда струму в присутності реактива синього 2 (40 мкмоль/л) складала 61±3% і 58±5% від контрольного значення відповідно у вприсутності та у відсутності АТФ (1 ммоль/л) та ГТФ (0.2 ммоль/л) у внутрішньоклітинному розчині.
Вплив АТФ на АХ-індуковані струми .
При іонофоретичних аплікаціях ацетилхоліну під час аплікації АТФ через перфузію амплітуда сумарного струму (АТФ+АХ-індукованого струму) не перевищувала амплітуди струму, що був викликаний аплікацією тільки ацетилхоліну (Рис.4).
При аплікаціях ацетилхоліну під час АТФ-індукованого струму, і навпаки, амплітуда сумарного АТФ+АХ-індукованого струму не перевищувала контрольного значення АХ-індукованого струму або АТФ-індукованого струму, в залежності від того, яка величина струму була в момент аплікації другої речовини, інакше кажучи, спостерігалась “оклюзія” струмів. Пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ спостерігалось тільки в нейронах, що відповідали на аплікацію АТФ появою струму. У нейронах, які не генерували АТФ-індукованих струмів, АХ-індукований струм у присутності АТФ (100500 мкмоль/л) був таким же, як і в контролі (Рис.5). У випадку вихідних струмів, що виникають в результаті активації мускаринових холінорецепторів ефекту “оклюзії” не спостерігалось.
Дія структурних аналогів АТФ на АХ-індуковані струми . АХ-індуковані струми , що були викликані аплікаціями ацетилхоліну в присутності α,βМеАТФ (100 мкмоль/л), β,γМеАТФ (100 мкмоль/л), β,γімідоАТФ (100300 мкмоль/л), а також аденозину (100300 мкмоль/л), не відрізнялись від АХ-індукованих струмів у контролі, в той час, як при аплікації ацетилхоліну в присутності АТФ (100250 мкмоль/л) спостерігалась “оклюзія” АХ-індукованого струму. Відсутність впливу аденозину свідчить, що ефект “оклюзії” не є наслідком активації аденозинових рецепторів.
Залежність пригнічення АХ-індукованих струмів від концентрації АТФ та ацетилхоліну. Амплітуда АТФ+АХ-індукованого струму не залежала від концентрації АТФ і дорівнювала амплітуді АХ-індукованого струму в контролі. У випадку тривалих аплікацій АТФ спостерігалось поступове зменшення амплітуди АТФ-індукованого струму внаслідок десенситизації пуринорецепторів. При аплікаціях ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму амплітуда сумарного АТФ+АХ-індукованого струму залишалась на постійному рівні незалежно від амплітуди АТФв момент аплікації ацетилхоліну (Рис.4). При аплікації різних доз ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму амплітуда сумарних відповідей у всіх випадках не превищувала амлітуди АХ-індукованих струмів, які були викликані відповідними дозами ацетилхоліну у відсутності АТФ (Рис.6).
Залежність ефекту пригнічення АХ-індукованого струму від відносної величини АТФ та АХ-індукованих струмів . Результати, що були описані вище, стосуються випадків, коли амплітуда АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну була нижча, ніж амплітуда АХ-індукованого струму в контролі. В таких умовах величина АХ-індукованого струму визначалась різницею між амплітудою АХ-індукованого струму в контролі і величиною АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну в більшості нейронів (в деяких нейронах величина АХ-індукованого струму в присутності АТФ була дещо вищою).
У незначної кількості нейронів відповіді на аплікацію АТФ (50100 мкмоль/л) через перфузію перевищували за амплітудою відповіді на іонофоретичні аплікації ацетилхоліну. Такі відповіді спостерігались незалежно від того, який внутрішньоклітинний розчин застосовувався в експерименті: були чи не були присутні у внутрішньоклітинному розчині трифосфати (АТФ (2 ммоль/л) і ГТФ (0.2 ммоль/л)); а також від того, за допомогою якої методики була проведена реєстрація: стандартної методики петчклемп в конфігурації “ціла клітина” або модифікованої методики “perforated patch”. У таких випадках аплікації ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму викликали відповіді, які були значно менші по величині, ніж відповіді в контролі, хоча сумарний АТФ+АХ-індукований струм був вищим, ніж амплітуда струмів, викликаних аплікаціями тільки АТФ або тільки ацетилхоліну.
При одночасній аплікації ацетилхоліну і АТФ під тиском, значення АТФ+АХ-індукованого струму дорівнювало значенню більшого струму, що спостерігався при аплікації тільки ацетилхоліну чи тільки АТФ при різних концентраціях даних речовин.
Вплив реактиву синього 2 на ефект пригнічення АХ-індукованого струму АТФ. Реактив синій 2 викликав підвищення амплітуди АТФ-індукованого струму і часткове пригнічення АХ-індукованого струму (розглянуто вище). При аплікаціях ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму в присутності реактиву синього 2 спостерігалось зменшення амплітуди АХ-індукованого струму пропорціонально до величини АТФ-індукованого струму, за контрольне значення приймали амплітуду АХ-індукованого струму в розчині реактиву синього 2 у відсутності АТФ. За величину АТФ-індукованого струму приймали значення струму в момент аплікації ацетилхоліну.
Дія форсколіну на АХ та АТФ-індуковані струми . Відомо, що фізіологічні ефекти АТФ можуть бути опосередковані активацією або пригніченням аденілат циклази (Sato et al., 1992; Zimmerman, 1994). Було проведено серію експериментів по вивченню можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на АХ та АТФ-індуковані струми. Було проведено серію експериментів по вивченню можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на АХ і АТФ-індуковані струми. Підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ викликали шляхом преінкубації нейронів протягом 520 хв. у розчині форсколіну, акти-ватора аденілат циклази (1020 мкмоль/л). Форсколін у вищезазначених концентраціях не мав впливу на струми , що були викликані аплікаціями АТФ (3 нейрони) та ацетилхоліну (7 нейронів).
Дія блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми . Оскільки при одночасній аплікації
dтубокурарин (2050 мкмоль/л, n=4) (Меліщук, 1993) ніяк не впливали на АТФ-індуковані струми (50100 мкмоль/л). У той же час дані блокатори у вищезгаданих концентраціях повністю оборотно блокували АХ-індуковані струми у присутності і у відсутністі АТФ. Відсутність впливу блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми показує, що дані струми, а також, “оклюзія” АХ-індукованого струму, не є наслідком активації НХР АТФ або відкрвання іонних каналів НХР в результаті активації пуринорецепторів.
ОБГОВОРЕННЯ.
Дія екзогенного АТФ на нейрони ПС.
Відповіді на аплікації АТФ можна розділити на дві групи – швидкі вхідні катіонні струми та повільні вихідні струми, при чому, у тому ж самому нейроні можуть бути представлені обидва типи відповідей.
Два типи вхідних АТФ-індукованих струмів, що швидко наростають. Відомо, що ацетилхолін є основним швидким збуджуючим передавачем у нейронах ентеральних гангліїв (Wood, 1989). Тому не виключалась можливість. що в нейронах ПС АТФ-індуковані струми виникають у результаті активації НХР. Але, як показали результати експериментів, АТФ-індуковані струми є результатом активації специфічних пуринорецепторів. Ці рецептори відмінні від НХР, тому що: а) АТФ-індуковані струми виникають у відповідь на аплікацію АТФ в умовах, коли НХР знаходяться в десенситизованому стані внаслідок тривалої аплікації ацетилхоліну; б) АТФ-індуковані струми не пригнічуються як конкурентними, так і неконкурентними блокаторами НХР; в) АТФ-індуковані струми і АХ-індуковані струми реверсують при різних потенціалах (в умовах, коли основним внутрішньоклітинним катіоном є Cs+, потенціал реверсії АТФ-індукованого струму складав 27.5±2.5 і 16.7±2.7 мВ в залежності від концентрації АТФ відповідно 50 мкмоль/л і 1 ммоль/л, коли для ацетилхолінового струму потенціал реверсії становив 2.8±1.1 мВ (Меліщук, 1993). г) канали НХР та пуринорецепторів мають різну проникність для катіонів, оскільки при позитивних мембранних потенціалах аплікація ацетилхоліну не викликала появи струму, в той час коли аплікація АТФ викликала вихідні струми амплітудою до 50% амплітуди вихідного АТФ-індукованого струму при мембранному потенціалі 50 мВ.
Швидка активація цих струмів і незначна затримка між початком аплікації та початком струму, яка була такою ж, як і для АХ-індукованих струмів, говорять про те, що пуринорецептори в нейронах ПС належать до родини йонотропних рецепторів. На користь цього висновку також свідчить стабільність протягом одноїдвох годин вхідних АТФ-індукованих струмів, що швидко наростають, у дослідах, що були проведенні з використанням внутрішньоклітинних розчинів, які не містили трифосфатів (АТФ (2 ммоль/л) та ГТФ (0.2 ммоль/л.)) і у випадку заміщення ГТФ на ГТФ-γ-S. Така стабільність відповідей на дію агоністів характерна для струмів, що виникають у результаті активації йонотропних рецепторів (Derkach et al., 1989).
Два типи вхідних струмів можуть свідчити про існування двох різних підтипів пуринорецепторів. Наші результати можна порівняти з даними, що були отримані на міентеральних нейронах, де також спостерігалось два типи відповідей на АТФ, що мали, як і в нашому випадку, різну десенситизацію, і які крім того, мали різний профіль активності агоністів (Zhou and Galligan, 1996). На основі цих даних більш вірогідним здається існування в нейронах ПС двох різних підтипів Р2Xпуринорецепторів, які є йонотропними рецепторами.
Повільні вихідні АТФ-індуковані струми . Той факт, що повільні вихідні АТФ-індуковані струми спостерігались, після виключення аплікації, коли АТФ був відсутній у зовнішньоклітинному середовищі, свідчить, що генерація даних струмів пов`язана з активністю внутрішньоклітинних вторинних посередників. Такі струми мали місце лише у випадку використання внутрішньоклітинного розчину на основі іонів К+, і їх стабільність у процесі реєстрації залежала від присутності у внутрішньоклітинному розчині АТФ та ГТФ. В експериментах із застосуванням внутрішньоклітинних досліджень в деяких нейронах аплікація АТФ викликала повільну гіперполяризацію внаслідок активації Са2+залежних К+каналів (Katayama and Morita, 1989; Barajas-Lopez et al., 1994), і відкривання цих каналів здійснюється за участю Gбілків у результаті активації особливих Р2Yпуринорецепторів Такі рецептори є у частини АНнейронів ПС (Barajas-Lopez et al., 1994) та міентерального сплетіння (Katayama and Morita, 1989), і відмінні від іонотропних пуринорецепторів, які також присутні в даних нейронах. Порівнюючи результати, які були отримані в даній роботі, з даними, отриманими за допомогою внутрішньоклітинних відведень, можна припустити, що повільні вихідні струми виникають в результаті активації Р2Yпуринорецепторів, які через активацію Gбілків керують Са2+залежною К+провідністю. Той факт, що повільні вихідні струми спостерігались лише у незначної частини нейронів, узгоджується з відносно малою долею АНнейронів у ганліях ПС (Surprenant, 1984a,b).
Концентраційна залежність АТФ-індукованих струмів
Пуринорицептори нейронів ПС мали чутливість до АТФ, близьку до чутливості пуринорецепторів деяких вегетативних гангліїв, наприклад, верхнього шийного ганглія щура. Пуринорецептори нейронів ПС були менш чутливі до АТФ ніж пуринорецептори нейронів гангліїв дорсальнних корінців (Robertson et al., 1996), симпатичних нейронів жабибика (Bean et al., 1990), нейронів вузловатого ганглія щура, сонячного сплетіння морської свинки (Khakh et al., 1995a), сенсорних нейронів щура та кішки (Krishtal et al., 1983) і нейронів спірального органа морської свинки (Nakagawa et al., 1990) ЕC50 для цих об’єктів складала від 2.7 до 12 мкмоль/л. Але пуринорецептори ПС були значно більш чутливі до АТФ, ніж пуринорецептори нейронів центральної нервової системи трігемінального мезенцефального ядра (ЕС50=437 мкмоль/л).
Ефекти двовалентних катіонів
Підвищення амплітуди АТФ-індукованого струму після вилучення двовалентних катіонів спостерігалось і на інших об`єктах, але цей ефект був більш вагомим, ніж у представлених результатах. На культуральних нейронах інтракардіальних парасимпатичних гангліїв щура спостерігалось двократне збільщення амплітуди АТФ-індукованих струмів після вилучення Са2+ і Mg2+ із зовнішньоклітинного розчину (Fiber and Adams, 1991). Вхідні АТФ-індуковані струми в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині були вищими за струми в нормальному розчині і в зовнішніх волоскових клітинах спірального органа морської свинки (Raybould and Housley, 1997). Пригнічення АТФ-індукованого струму підвищенням зовнішньоклітинної концентрації іонів Са2+ в межах 0.330 ммоль/л спостерігалось у клітинах, які експресували Р2Х2пуринорецептори клітин РС12, у той же час, у клітинах які експресували Р2Х1пуринорецептори міоцитів сечового міхура людини, такого ефекту зареєстровано не було (Evans et al., 1996). Рівень десенситизації пуринорецепторів в сенсорних нейронах, що були експресовані в ооцитах Xenopus laevis, залежав від присутності іонів Са2+ у зовнішньоклітинному розчині (King et al., 1997). Ефект зменшення амплітуди струму в присутності двовалентних катіонів характерний не тільки для пуринорецепторів, а і інших іонотропних рецепторів, зокрема, НХР смугастих м`язів. Цей ефект може бути пояснений більш повільним проходженням двовалентних катіонів у порівнянні з іонами Na+ через неселективний катіонний канал , і в момент проходження двовалентним катіоном канал закритий для проходження Na+, що приводить до зменшення середнього струму через іонний канал. Другий можливий механізм пригнічення струму може полягати в наявності ділянки зв`язування двовалентних катіонів Са2+ або Mg2+ в межах катіонного каналу (Hille, 1984).
Ефекти агоністів та структурних аналогів АТФ.
Той факт, що аплікація аденозину не викликала помітних відповідей, і у той час, аплікація АТФ обумовлювала генерацію трансмембранного струму, говорить про те, що АТФ-індуковані струми виникають у результаті активації пуринорецепторів Р2підтипу. Відомі агоністи Р2Хпуринорецепторів α,βМеАТФ та β,γМеАТФ (Khakh et al., 1995b) не викликали струму в концентрації 100 мкмоль/л. Відсутність ефекту (або дуже низька ефективність) при аплікації α,βМеАТФ та β,γМеАТФ характерна для більшості нейрональних пуринорецепторів (Khakh et al., 1995a, 1997; Fieber and Adams, 1991; Allen and Burnstock, 1990; BarajasLopez et al., 1994, 1995; Ueno et al., 1992; Buell et al., 1995; Lewis et al., 1995; Seguela et al.,1996; Soto et al., 1996; Bo et al., 1995). Поясненням зменшення АТФ-індукованого струму в присутності α,βМеАТФ може бути десенситизація популяції пуринорецепторів (Khakh et al., 1995; Fieber and Adams, 1990; Аllen and Burnstock, 1991) або антагоністичний ефект α,βМеАТФ (Khakh et al., 1995).
Ефекти блокаторів Р2пуринорецепторів.
Неселективний блокатор Р2пуринорецепторів сурамін у даній роботі не справляв помітного впливу на величину АТФ-індукованих струмів, хоча і прискорював їх наростання. Відсутність блокуючої дії сураміну спостерігалась також і в нейронах міентерального сплетіння, де сурамін, навпаки, підсилював струми, що були викликані аплікацією АТФ (BarajasLopez et al., 1993; BarajasLopez et al., 1996)
У нейронах обох ентеральних сплетінь, пiдслизового та мiентерального, дiя сурамiну на АТФiндукованi струми вiдрiзнялась вiд його ефектiв на АТФкерованi iоннi канали iнших об'єктів таких, як гладенькi м'язи (Dunn et al., 1988; Leff et al., 1990; Urbanek et al., 1990), клiтини PC12 (Inoue et al., 1991), нейрони симпатичних (Nakazawa, 1994a; Cloues et al., 1993; Evans et al., 1994; Khakh et al., 1995a) та сенсорних (Li et al., 1993; Li et al., 1997b) ганглiiв, нейронів центральної нервової системи (Inoue et al., 1992; Khakh et al., 1997), а також на рекомбiнантнi рецептори (Seguela et al., 1996).
Блокатор Р2Yпуринорецепторів реактив синій 2 (Abbracchio and Burnstock, 1994) викликав незначне пригнічення АТФ-індукованого струму лише при тривалій преінкубації (до 20 хв. ) нейронів у розчині блокатора. Коли реактив синій 2 добавляли в розчин разом з АТФ, або аплікацію АТФ проводили після короткотривалої преінкубації нейронів у розчині цього блокатора, спостерігалось помітне підсилення АТФвідповіді. Подібний ефект реактив синій 2 проявляв на культурі інтракардіальних нейронів морської свинки (Allen and Burnstock, 1991) і нейронах міентерального сплетіння (BarajasLopez et al., 1996). На деяких інших об`єктах реактив синій 2 проявляв блокуючий ефект на АТФ-індуковані струми. Наприклад, у нейронах гангліїв дорсальних корінців жабибика (Li et al.,1997) і у культурі нейронів верхнього шийного і вузловатого гангліїв щура та сонячного сплетіння морської свинки (Khakh et al., 1995a).
Сурамін та реактив синій 2 потенціювали відповіді на аплікацію агоністів і в дослідах з експресованими Р2Х2пуринорецепторами (Bo et al., 1995). Відсутність сильної блокуючої дії реактиву синього 2 на АТФ-індуковані струми в наших експериментах свідчать, що пуринорецептори в нейронах ПС не належать до підтипуР2Y.
Пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ.
Ефект “оклюзії” спостерігався тільки у випадку струмів, які були викликані в результаті активації НХР. При аплікації АТФ на фоні повільних вихідних струмів, які з`являлись у результаті активації мускаринових холінорецепторів або Р2Yпуринорецепторів, величина сумарного струму визначалась алгебраїчною сумою цих струмів. Для пояснення “оклюзії” АТФ-індукованих струмів і АХ-індукованих струмів можна припустити або пряму взаємодію АТФ з НХР, або дію АТФ через активацію пуринорецепторів, тобто існує зв`язок між НХР і пуринорецепторами безпосередній чи через систему вторинних посередників. На деяких об`єктах ефекти АТФ можна пояснити безпосередньою активацією НХР (Nakazawa, 1994a; Nakazawa and Inoue, 1993; Igusa, 1988).
Було проведено серію експериментів для перевірки прямої дії АТФ на НХР і, як показали результати цих досліджень, ефект пригнічення АХ-індукованого струму неможливо пояснити такою взаємодією, а також блокуванням АТФ пізнаючого центра чи іонного каналу НХР. Доказами відсутності такої взаємодії є: а) відсутність дії болкаторів НХР, як конкурентного— триметафану так і неконкурентних— dтубокурарину та гексометонію; б) залежність пригнічення АХ-індукованого струму від величини АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну, а не від концентрації АТФ; в) відсутність впливу АТФ на АХ-індукований струм у нейронах, що не відповідали на АТФ і відсутність впливу на АХ-індуковані струми неактивних аналогів АТФ. З другого боку, цей ефект неможливо пояснити блокуванням пуринорецепторів ацетилхоліном, оскільки АТФ-індуковані струми в присутності ацетилхоліну, під час тривалих аплікацій, мали таке ж значення, як і в контролі, у той час, коли в результаті десенситизації НХР АХ-індуковані струми не спостерігались.
Не виключена можливість, що ефект пригнічення АХ-індукованого струму АТФ здійснюється у результаті залучення інших рецепторів, які активуються АТФ. В ентеральних нейронах, зокрема у нейронах міентерального сплетіння, присутні метаботропні Р2Yпуринорецептори, яктивація яких призводить до підвищення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+; ці рецептори чутливі до блокатора Р2Yпуринорецепторів реактиву синього 2 (Christofi et al., 1997; Kimball et al., 1996). У нейронах обох ентеральних сплетіннь є аденозинові рецептори. Біологічний ефект активації цих рецепторів зійснюється шляхом активації аденілатциклази і, як наслідок, підвищення внутрішньоклітинного рівня цАМФ (Wood et al., 1985; BarajasLopez, 1993; Xia et al., 1997). Для перевірки гіпотези про залучення вищезгаданих рецепторів було вивчено вплив реактиву синього 2 на ефект пригнічення АХ-індукованого струму, а також дію аденозину на АХ-індуковані струми . Як показали результати експериментів, припущення про участь цих рецепторів не підтвердилось.
АТФ може здійснювати біологічні ефекти шляхом активації або пригнічення аденілатциклази (Sato et al.,1992). Влив АТФ на НХР за участю вторинних посередників спостерігався в клітинах скелетних м`язів (Lu and Smith, 1991). Для вивчення можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на швидкі АТФ та АХ-індуковані струми , було дослідженно дію форсколіну, активатора аденілатциклази (Seamon and Daly, 1981; Kilmer and Garsen, 1984; Laurenza et al., 1989). У представлених результатах форсколін не впливав ні на АХ, ні на АТФ-індуковані струми. Ці дані свідчать, що в регуляцію активності НХР та Р2пуринорецепторів не включаються механізми за участю цАМФ.
“Оклюзію” АХ-індукованого струму неможливо пояснити дією вторинних посередників, оскільки ефект розвивається за дуже короткий час (менший ніж час наростання АТФ чи АХ-індукованого струму до пікового значення). Для ефектів, які здійснюються за участю вторинних посередників, потрібний значно більший час. З другого боку, ефект пригнічення залишається незмінним (відсутній “rundown”) в процесі тривалої (13 год) реєстрації петчклемп у конфігурації “ціла клітина” в умовах, коли у внутрішньоклітинному розчині відсутні АТФ і ГТФ, або присутній ГТФ-γ-S.
Отже, найбільш вірогідним поясненням ефекту “оклюзії” є припущення про існування прямого зв`язку між НХР та Р2пуринорецепторами. Активація одного рецептора, НХР або Р2пуринорецептора, робить неактивним інший, або обумовлює закривання іонного каналу, що керується іншим рецептором.
Ефекти блокаторів НХР.
Відсутність дії гексаметонію на АТФ-індуковані струми узгоджується з результатами дослідів на культурі нейронів ПС, що були проведені методом внутрішньоклітинних відведень, де АТФіндукована деполяризація була резистентною до дії даного блокатора (Barajas Lopez et al., 1994). Відсутність дії блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми свідчить, що ці струми не є результатом дії АТФ на нікотинові холінорецептори. У протиположність цьому, на об`єктах, де АТФ безпосередньо активував НХР, АТФ-індуковані струми пригнічувались блокаторами НХР (Igusa, 1988)
Можлива фізіологічна роль пуринорецепторів у нейронах ПС
Припущення про можливу участь АТФ у синаптичній передачі між нейронами ПС підтверджує також той факт, що АТФ може виділятися із ентеральних нервів у фізіологічних умовах (Burnstock 1972, 1981; White, 1982, 1988; White and Leslie, 1982). Присутність іонотропних Р2пуринорецепторів на мембрані соми нейронів ПС дозволяє припустити, що АТФ може приймати участь у швидкій збуджуючій нехолінергічній передачі в ролі нейропередавача в міжнейрональних синапсах гангліїв ПС. Існування нейронів, які містять пуринорецептори і не містять НХР, дає підстави вважати пуринергічну передачу в цих нейронах основною збуджуючою передачею. На основі отриманих результатів можна припустити, що АТФ також може виконувати роль повільного гальмівного нейропередавача в деяких нейронах (можливо АНнейронах) гангліїв ПС тонкого кишечника морської свинки.
Порівняння пуринорецепторів нейронів ПС з пуринорецепторами інших об`єктів
Р2Xпуринорецептори, що швидко десенситизуються, по кінетичним характеристикам схожі на клоновані пуринорецептори Р2Х1 та Р2Х3підтипів, а також на нативні пуринорецептори гладеньких м’язів та сенсорних нейронів (Krishtal et al., 1983; Bean et al., 1990; Bean, 1992), які десенситизуються протягом секунд у присутності АТФ. Р2Xпуринорецептори ПС, що десенситизуються повільно, по ряду активності агоністів та десенситизації нагадують клоновані пуринорецептори Р2Х2 та Р2Х5 підтипів, а також пуринорецептори клітин РС12, інтракардіальних парасимпатичних і, у меншій мірі, симпатичних нейронів.
ВИСНОВКИ
1. За допомогою стандартного методу фіксації потенціалу петчклемп у конфігурації “ціла клітина” та модифікованої методики “perforated patch” було досліджено АТФ-індуковані струми в нейронах підслизового сплетіння тонкого кишечника морської свинки. Показано, що аплікація АТФ викликає в більшості нейронів вхідні катіонні струми, пов`язані з підвищенням провідності мембрани внаслідок активації специфічних пуринорецепторів. Вперше показано наявність у даних нейронах двох підтипів іонотропних Р2Xпуринорецепторів— з швидкою та повільною десенситизацією. Досліджено електрофізіологічні властивості Р2Xпуринорецепторів з повільною десентизацією, які присутні в більшості нейронів підслизового сплетіння. Дані пуринорецептори за електрофізіологічними та фармакологічними властивостями схожі з Р2пуринорецепторами інших інтрамуральних гангліїв і за фармакологічним профілем відмінні від пурнинорецепторів екстрамуральних гангліїв.
2. Вперше для даних нейронів методом петчклемп зареєстровані повільні вихідні К+струми, які виникають у деяких нейронах внаслідок активації Р2Yпуринорецепторів, що зв`язані з Gбілками.
3. Вивчено дію на АТФ-індуковані струми блокаторів Р2пуринорецепторів сураміну та реактиву синього 2, а також класичних блокаторів нікотинових холінорецепторів триметафану, гексаметонію та dтубокурарину. Показано, що реактив синій 2 підвищує амплітуду АТФ-індукованого струму, а сурамін прискорює наростання струму без впливу на амплітуду. Блокатори нікотинових холінорецепторів не впливають на відповіді на аплікацію АТФ, і в той же час повністю пригнічують ацетилхолінові струми як в присутності, так і у відсутності АТФ. Дані результати свідчать, що АТФ діє через рецептори, які відмінні від НХР, і дані рецептори мають унікальні фармакологічні характеристики.
4. Вперше зареєстровано ефект пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ, який не пов’язаний із взаємодією АТФ безпосередньо з НХР. Висунуто припущення, що пуринорецептори та НХР функціонують у взаємному зв’язку.
5. Результати роботи дозволяють припустити, що АТФ може приймати участь у синаптичній передачі в якості швидкого збуджуючого нейропередавача в більшості нейронів підслизового сплетіння, діючи на іонотропні Р2пуринорецептори двох типів, а також у деяких нейронах може діяти як повільний гальмівний передавач, підвищуючи рівень К+провідності в результаті активації метаботропних Р2Yпуринорецепторів.
Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисетації.
Статті:
Глушаков А.В., Мелищук А.И., Скок В.И. АТФиндуцированные токи в нейронах подслизистого сплетения морской свинки// Нейрофизиология. 1996. Т. 28. № 2/3. С. 100110.
Глушаков О.В., Глушакова О.Ю., Скок В.І. Два типи Р2хпуринорецепторів у нейронах підсли-зового сплетеннятонкого кишечнику морської свинки// Нейрофизиология. 1998. № 4/5. С. 301304.
Glushakov A.V., Glushakova H.Y., Skok V.I. Modulation of nicotinic acethylcholine receptor activity in submucous neurons by intracellular messengers// J. Auton. Nerv. Syst. –1999 Т. 75. С. 16-22.
Тези:
Glushakov A., Glushakova H., The role of phosphorylation in тicotinic acetylcholine receptor activity// Neurophysiology 1997. Т. 29. № 4/5. С. 367.
Глушаков А.В. АТФиндуцированные токи в нейронах подслизистого сплетения тонкого кишечника морской свинки. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02биофизика, Институт физиологии им. А.А. Богомольца, НАН Украины, Киев, 1999.
При помощи метода фиксации потенциала пэтчклэмп в стандартной конфигурации “целая клетика” и модифицированной— “perforated patch”, исследованы АТФиндуцированные токи в диссоциированных нейронах подслизистого сплетения тонкого кишечника морской свинки. При потенциале на мембране -50 мВ аппликации АТФ (50500 мкмоль/л) через перфузирующий раствор вызывала трансмембранные токи, связанные с повышением проводимости мембраны, в 68% (n=82) нейронов. При исспользовании аппликации АТФ под давлением в концентрации 501000 мкмоль/л, или ионофоретической аппликации наблюдались два типа входящих АТФиндуцированных токов с быстрым наростанием в большинстве исследованых нейронов (98%, n=56). Кроме того, в некоторых нейронах (10%, n=26) наблюдались также медленные выходящие K+токи, вызванные в результате активации связанных с Gбелками P2Yпуринорецепторов. Ко всем исследованным нейронам применяли также аппликации ацетилхолина (АХ) ионофоретические или под давлением в концентрации 50-300 мкмоль/л, которые вызывали в большинстве нейронов быстрые входящие катионные токи, связанные с активацией никотиновых холинорецепторов (НХР), а также в некотрых нейронах– медленные выходящие K+токи, в результате активации мускариновых холинорецепторов. В большинстве нейронов наблюдались ответы как на АТФ, так и на АХ (103 из 146 исследованных нейронов), но имели место нейроны, которые отвечали только на АТФ (8 из 146), или только на АХ (30 из 146), или не отвечали ни на одно из данных веществ. Быстрые АТФ- и АХиндуцированные токи возникали независимо от того присутствовали или нет во внутриклеточном растворе ГТФ (0.2 ммоль/л)и АТФ (2 ммоль/л), или когда ГТФ был замещен ГТФ-γ-S в еквимолярной концентрации. 90% нейронов, чувствительных к АТФ, содержали P2Xпуринорецепторы, которые характеризовались медленной десенситизацией. В данных нейронах полной десенситизации P2Xпуринорецепторов не наблюдалось при длительных (несколько минут) аппликациях АТФ (200 мкмоль/л). Аппликации через перфузирующий раствор аналогов АТФ: β,γимидоАТФ, α,βметиленАТФ и β,γметиленАТФ в концентрациях 100 мкмоль/л, а также активатора Р1пуринорецепторов аденозина (100-300 мкмоль/л)не вызывали в данных нейронах генерации ионных токов. Концентрация, вызывающая полумаксимальный ответ (ЕС50) составляла 45.7±3.5 мкмоль/л, коэффициетнт Хилла равен в среднем 2. Избирательный блокатор Р2Yпуринорецепторов реактив синий 2 (30100 мкмоль/л) увеличивал амплитуду АТФиндуцированного тока, а также частично обратимо угнетал АХ-индуцированный ток. Амплитуда АТФиндуцированного тока в присутствии реактива синего 2 (30 мкмоль/л) составляла110-130% контрольного значения. Неселективный блокатор Р2пуринорецепторов сурамин (50200 мкмоль/л) уменьшал время наростанния АТФ индуцированного тока до максимального значения без влияния на амплитуду тока и не оказывал влияния на АХиндуцированные токи. В 10% нейронов, чувствительных к АТФ, P2Xпуринорецепторы характеризовались быстрой десенситизацией. АТФ (50 мкмоль/л) и α,βметиленАТФ (100 мкмоль/л) вызывали в данных нейронах подобные токи с быстрым (около секунды) спадом в присутствии АТФ. Время полного восстановления этих рецепторов из десенситизированого состояния составляло несколько минут. Во всех случаях АТФ и АХ не вызывали перекрестной десенситизации соответственно НХР и пуринорецепторов.
При аппликациях АТФ одновременно с АХ во всех исследованных нейронах наблюдалась генерация токов (АТФ+АХ-индуцированные токи), амплитуда которых не была равна сумме контрольных значений АТФ- и АХ-токов. В большинстве случаев амплитуда АТФ+АХиндуцированного тока не превышала амплитуды большего тока– АТФ- или АХиндуцированного тока, то есть наблюдалась взаимная окклюзия этих токов. Данный эффект наблюдался как в присутствии, так и в отсутствии во внутриклеточном растворе ГТФ (или ГТФ-γ-S, 0.2 ммоль/л) и АТФ (2 ммоль/л). Не наблюдалось взаимной окклюзии в случае АТФиндуцированного тока и медленных АТФ- или АХ-индуцированных K+токов. В нейронах, которые не генерировали АТФиндуцированных токов аппликации АХ в присутствии АТФ (100500 мкмоль/л) вызывала такие же ответы, как и в контроле. Аналоги АТФ: β,γимидоАТФ, α,βметиленАТФ и β,γметиленАТФ в концентрациях 100 мкмоль/л, а также активатор Р1пуринорецепторов аденозина (100300 мкмоль/л), которые не вызывали ионных токов, не оказывали заметного влияния на АХиндуцированный ток. Блокатор P2Yпуринорецепторов реактив синий 2 (30 мкмоль/л не устранял эффекта окклюзии. Активатор аденилат циклазы форсколин (10 мкмоль/л) не оказывал заметного влияния ни на АТФ, ни на АХиндуцированные токи. Блокаторы НХР триметафан (30 мкмоль/л), гексаметоний (50 мкмоль/л)и dтубокурарин (40 мкмоль/л)не оказывали влияния на АТФ-индуцированные токи, но в тоже время полностью блокировали АХ-индуцированные токи как в присутствии, так и в отсутствии АТФ. Данные результаты показывают, что угнетение активности НХР и Р2Xпуринорецепторов в результате активации этих рецепторов АТФ– не связан с взаимодействием АТФ непосредственно с НХР.
В результате работы было установлено, что нейроны подслизистого сплетения експрессируют два различных подтипа ионотропных Р2Xпуринорецепторов, а также метаботропные Р2Yпуринорецепторы., которые могут вовлекаться в различные процессы. Представленные результаты позволяют предположить, что АТФ может принимать участие в синаптичнеской передаче в качестве как быстрого возбуждающего, так и медленного тормозного нейропередатчика в синапсах между нейронами подслизистого сплетения. P2Xпуринорецепторы с медленной десенситизацией и НХР не являются функционально независимыми, возможно, в результате существования прямой связи между этими рецепторами.
Ключевые слова: нейроны подслизистого сплетения, пэтч-клэмп, Р2пуринорецептор, никотиновый холинорецептор.
|
