|
К И Ї В С Ь К И Й Н А Ц І О Н А Л Ь Н И Й У Н І В Е Р С И Т Е Т
імені Т А Р А С А Ш Е В Ч Е Н К А
БОГДАНОВА ОЛЕНА ВІКТОРІВНА
УДК 577.152:612.112:599.323.4 + 613.648.4
АКТИВНІСТЬ ТИРОЗИНОВИХ ПРОТЕЇНФОСФАТАЗ
В ЛІМФОЇДНИХ КЛІТИНАХ ЩУРІВ ЗА УМОВ ВПЛИВУ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ
03. 00. 04 – біохімія
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії
біологічного факультету Київського національного університету
імені Тараса Шевченка.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Остапченко Людмила Іванівна,
завідувач кафедри біохімії
Київського національного університету
Імені Тараса Шевченка
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Палладіна Тетяна Олександрівна,
Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного
НАН України,
провідний науковий співробітник
відділу клітинної біології та анатомії рослин
доктор біологічних наук, професор
Виноградова Руфіна Петрівна,
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
НАН України
провідний науковий співробітник
відділу науково-інформаційних та
патентно-ліцензійних досліджень
Провідна установа: Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України
Захист дисертації відбудеться 23 червня 2005 р. о 14 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д26.001.24 в Київському національного
факультету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова 2,
корпус 12 (біофак), ауд.434.
Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64,
спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету:
вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий 20 травня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Ферменти фосфорилювання білків є одними з ключових компонентів системи регуляції клітинних функцій. Серед них важлива роль належить тим, що здійснюють модифікацію залишків тирозину – тирозиновим протеїнкіназам (ТПК-азам) ATФ: протеїн-тирозин O-фосфотрансферазам, КФ 2.7.1.112, та тирозиновим протеїнфосфатазам (ТПФ-азам) протеїн-тирозинфосфат фосфогідролазам, КФ 3.1.3.48, оскільки вони залучені до процесів клітинної проліферації та диференціації, а у клітинах лімфоїдної тканини - до регуляції передачі сигналу від цитокінів, ростових факторів, гормонів та антигенів [Wang, 2003].
Показано зв’язок ряду захворювань імунологічної природи з порушенням функціонування ТПК-аз та ТПФ-аз [Liebow, 1992]. Дослідження змін у функціонуванні цих ферментів за умов впливу на організм несприятливих чинників оточуючого середовища, зокрема, іонізуючих випромінювань, є актуальною біохімічною проблемою. Радіаційно-індуковані імунодефіцитні стани, аутоалергічні дисбаланси та неопластичні утворення лімфогенного походження, які супроводжуються змінами активності ТПК-аз, є наслідками дії цих чинників [Suzuki, 2001]. Особливої уваги заслуговує дослідження ТПФаз імунокомпетентних клітин, як найбільш радіочутливих, оскільки роль цих ферментів у реалізації післяпроменевих реакцій недостатньо вивчена.
Ферментативне фосфорилювання - дефосфорилювання тирозинових залишків білків є важливою складовою універсального механізму регуляції клітинних функцій, інтегративна роль якого полягає у об’єднанні окремих, навіть дистанційованих компонентів різних сигнальних каскадів у цілісну систему метаболічних процесів, тому встановлення взаємозв’язків між активністю ТПК-аз, ТПФ-аз та функціонуванням інших месенджерних систем, зокрема, циклазного каскаду, у лімфоїдних клітинах є важливим для з’ясування молекулярних механізмів клітинних реакцій за умов впливу іонізуючого випромінювання.
Показано, що біологічно активні речовини, які мають радіозахисні, імуномодулюючі та цитопротекторні властивості, здатні корегувати стан організмів, підданих іонізуючому опроміненню [Kelly, 1999]. Розуміння їх впливу на функціонування ферментів тирозинового фосфорилювання-дефосфорилювання білків у лімфоїдних клітинах дає можливість з’ясувати механізми залучення цих ферментів у реалізацію адаптаційної реакції клітини за умов дії іонізуючої радіації.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана згідно з тематичним планом НДР № державної реєстрації 0101U002291 “Розробка наукових основ пошуку біологічно активних сполук радіозахисної дії” в рамках комплексної наукової програми “Здоров’я людини”.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановити особливості функціонування ТПФ-аз в лімфоїдних клітинах селезінки та тимусу щурів за умов дії низьких доз іонізуючого випромінювання. Для досягнення мети до завдань роботи входило:
Дослідити активність ТПК-аз в плазматичних мембранах та цитозолі лімфоцитів щурів за умов тотального рентгенівського опромінення тварин у дозах 0,5 та 1,0 Гр.
Вивчити активність ТПФ-аз в плазматичних мембранах та цитозолі лімфоцитів за умов тотального рентгенівського опромінення тварин у дозах 0,25; 0,5; 0,75 та 1,0 Гр.
Ізолювати ферментативний препарат тирозинової протеїнфосфатази лімфоїдних клітин CD45 з лімфоцитів тимусу щурів в контролі та за умов дії іонізуючої радіації.
Вивчити вплив біологічно активних сполук з різними механізмами внутрішньоклітинної дії (сквалену, циклоферону, інтерлейкіну 12, клітинно-зв’язаного білка А з мікробних клітин St.aureus) на активність ТПФ-аз за умов опромінення тварин.
Визначити вміст циклічних нуклеотидів в лімфоїдних клітинах тварин за умов дії променевого фактору у досліджуваних дозах.
Об’єкти дослідження: біохімічні механізми функціонування тирозинових протеїнфосфатаз в лімфоїдних клітинах селезінки і тимусу контрольних та опромінених щурів.
Предмет дослідження: активність ТПК-аз та ТПФ-аз, вміст циклічних нуклеотидів.
Методи дослідження: в роботі використані біохімічні, радіоізотопні, імунологічні, спектрофотометричні методи, методи афінної хроматографії та математичної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження активності ТПФ-аз у плазматичних мембранах та цитозолі лімфоїдних клітин у контролі та за умов тотального рентгенівського опромінення в дозах 0,25; 0,5; 0,75 та 1,0 Гр. Ізольовано та очищено препарат ТПФ-ази CD45 з плазматичних мембран тимоцитів та вивчено її кінетичні властивості. Післярадіаційні модифікації активності ТПФ-аз в клітині можуть бути пов’язані з конформаційними перебудовами молекули ферменту, що виявляються у змінах кінетичних характеристик. Встановлено участь тирозинзалежних фосфатаз у реакціях лімфоїдних клітин на введення біологічно активних сполук з різним механізмом дії за умов опромінення тварин. Вперше проведено комплексне дослідження взаємозв’язків систем тирозинового фосфорилювання-дефосфорилювання білків та циклічних нуклеотидів у лімфоїдних клітинах селезінки та тимусу щурів, опромінених у низьких дозах.
Практичне значення одержаних результатів. Результати мають значення для розуміння ролі ТПФ-аз у формуванні післяпроменевої відповіді лімфоїдних клітин. Аналіз післяпроменевих змін активності ізольованої ТПФ-ази CD45 дає можливість для науково-обгрунтованих підходів фармакологічної корекції виявлених метаболічних порушень. Результати експериментальної роботи, що показали участь ТПФ-аз у реалізації ефектів біологічно активних речовин, можуть бути використані для розробки нових фармакологічних схем профілактики імунодефіцитних патологічних станів, викликаних променевим ураженням організму.
Особистий внесок здобувача. Здійснення інформаційного пошуку та аналіз літературних даних, проведення експерименту, обговорення та оформлення матеріалів дослідження виконані дисертантом особисто. Планування експерименту, розробка методичних підходів та узагальнення результатів дисертаційної роботи проведені з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на ІІ всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених” (Київ, 2002); VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); Всеукраїнській науковій конференції “Психофізіологічні функції в нормі і патології” (Київ, 2002); ІІІ Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 2002); ІХ Міжнародній конференції “Інформотерапія: теоретичні аспекти та практичне застосування” (Київ, 2003); Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine (Kyiv, 2003); ІV всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2004); First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004); 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies (Warsaw, Poland, 2004); FEBS Forum for young scientists (Warsaw, Poland, 2004); Х конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Чернівці, 2004); Российской научной конференции “Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты” (Санкт-Петербург, Россия, 2004); 19 Всероссийской конференции с международным участием “Физиология и патология пищеварения” (Сочи, Россия, 2004); International Conference “Carotenoids and Dietary Lipids in Health and Desease” (Krakow, Poland, 2004); The Physiological Society Meeting (London, Great Britain, 2004).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 6 статей у фахових виданнях та 15 тез у матеріалах конгресів, конференцій, з’їздів.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаної літератури, що включає 244 джерела. Дисертація викладена на 142 стор., містить 16 рисунків, 9 таблиць.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Досліди проводили на білих щурах лінії Вістар обох статей масою 130-150 г. Тварин опромінювали на установці РУМ-17 в дозах 0,25; 0,5; 0,75 та 1,0 Гр за умов: потужність дози - 24,5 сГр/хв, фільтри - 0,5 мм Сu + 1 мм Аl, напруга - 200 кВ, сила струму - 5 мА, шкірнофокусна відстань - 50 см. Дослідження проводили через 12 годин після опромінення тварин, що є терміном найбільш виражених порушень основних ланок метаболізму лімфоїдних клітин після впливу іонізуючої радіації в таких дозах [Кучеренко, 1996; Остапченко, 1998].
Сквален піддослідним тваринам вводили перорально протягом 3 діб перед опроміненням у кількості 50 мкг/кг маси у вигляді 10% розчину на рослинній олії двічі на добу згідно з [Kelly, 1999]. Циклоферон вводили внутрішньом’язево протягом 5 діб 2 рази на добу у кількості 62 мг/кг маси згідно з [Popovich, 2000].
Інкубацію клітин, отриманих з лімфоїдних органів контрольних та опромінених тварин з епідермальним ростовим фактором (5 мкг/106 клітин) [Li, 1997], інтерлейкіном 12 (1 нг/106 клітин) [Mariani, 2000] та клітинно-зв’язанним білком А з мікробних клітин St.aureus (3 мкг/106 клітин) проводили згідно з рекомендаціями [Пастер, 1989].
Лімфоцити селезінки отримували центрифугуванням клітинної суспензії на градієнті Ficoll-Paque (густина 1,077) за методом [Boyum, 1968]. Тимоцити із суспензії клітин тимусу виділяли за методом [Морозов, 1985]. Отримання фракцій плазматичних мембран та цитозолю проводили за рекомендаціями [Рыбальченко, 1988] центрифугуванням на 30% сахарозному градієнті (густина 1,127).
Ізолювання та очищення препарату тирозинової протеїнфосфатази СD45 проводили з використанням методу імуноафінної хроматографії з плазматичних мембран тимоцитів щурів [Бин, 1988]. Електрофорез у блоці поліариламідного гелю за присутності додецил-сульфату натрію проводили згідно з [Laemmli, 1970]. Визначення кінетичних характеристик ферментативного препарату проводили з використанням паранітрофенілфосфату (1-8 ммоль/л) та фосфотирозину (16 ммоль/л) як субстратів та 0,2 ммоль/л ванадату натрію як інгібітору.
Активність ТПК-аз визначали за включенням 32Рі із (γ-32Р/-АТР) в специфічний білковий субстрат [Boutin, 1996]. Радіоактивність проб визначали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107 на лічильнику “Delta300” (США). Питому активність ферментів розраховували за кількістю фосфату, який було включено в білковий субстрат, у пмоль 32Рi за 1 хв на 1 мг білка.
Активність ТПФ-аз визначали за методом [Desai, 1993] та розраховували за кількістю неорганічного фосфату, який відщеплювався від субстрату в нмоль Рі за 1 хв на мг білка.
Вміст циклічних нуклеотидів визначали згідно з [Steiner, 1972] з використанням стандартних наборів для визначення вмісту циклічних нуклеотидів фірми “Amercham”, Великобританія; результати обраховували у пмоль на мг білка.
Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики із застосуванням стандартного пакету прикладних програм на ЕОМ.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
На теперішній час показано дію ушкоджуючих чинників зовнішнього середовища, в тому числі іонізуючої радіації, на активність ферментів фосфорилювання білків. Так, суттєві порушення функціонування цих ферментів відбуваються протягом першої доби за умов впливу сублетальних доз іонізуючого випромінювання [Остапченко, 1999].
З огляду на це, нами було проведено дослідження активності ТПК-аз в лімфоїдних клітинах селезінки щурів (табл.1). У лімфоїдних клітинах мембранопов’язані та цитозольні ТПК-ази є різними за функцією, і тому нами було визначено активність цих ферментів у фракції плазматичних мембран та цитозолі спленоцитів. Оскільки відомо, що за умов променевого впливу суттєво порушуються процеси сигнальної трансдукції [Uckun, 1992], нами було досліджено вплив інкубації клітин з епідермальним ростовим фактором на активність ТПК-аз за подібних умов. Епідермальний ростовий фактор є одним з важливих цитокінів, реалізація клітинної відповіді на який є опосередкованою тирозиновим фосфорилюванням білків [Burke,1997].
Таблиця 1
Активність тирозинових протеїнкіназ у плазматичних мембранах та цитозолі лімфоїдних клітин селезінки щурів
за умов впливу іонізуючого випромінювання
на тлі інкубації клітин з епідермальним ростовим фактором, пмоль Рі * (хв * мг білка)-1, n=5
- ЕРФ- у відсутності епідермaльного фактору росту;
+ ЕРФ – у присутності епідермального фактору росту;
*- р≤ 0,05 порівняно з контролем у відсутності епідермального фактору росту
Встановлено стимулюючий вплив епідермального ростового фактору на ферменти фракції плазматичних мембран, тоді як у цитозолі такого ефекту не спостерігалося. Вплив іонізуючого випромінювання знижував стимулюючу дію епідермального ростового фактору (табл.1).
Оскільки дефосфорилювання білків-мішеней здійснюється за допомогою протеїнфосфатаз, для комплексної оцінки функціонування системи тирозинового фосфорилювання – дефосфорилювання білків за умов променевого впливу нами було досліджено активність ТПФ-аз в плазматичних мембранах та цитозолі лімфоїдних клітин селезінки та тимусу щурів (рис.1).
В тимоцитах найбільше зростання активності ТПФ-аз визначено після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр. Вплив випромінювання у вищих дозах призводив до пригнічення активності ферменту в плазматичних мембранах тимоцитів. В цитозольних фракціях клітин тимуса активність ТПФ-аз також зменшувалася після опромінення тварин у дозах 0,75 та 1,0 Гр, (у порівнянні зі значеннями за умов іонізуючого опромінення у дозі 0,5 Гр), проте не досягала контрольного рівня (рис.1).
Дослідження активності ТПФ-аз в лімфоїдних клітинах селезінки дозволило встановити, що у мембраноасоційованих фракціях лише після опромінення у дозі 0,5 Гр спостерігалося вірогідне збільшення цього показника. Активність цитозольних форм ферменту найістотніше зростала за дії іонізуючої радіації у дозі 0,25 Гр та знижувалася за умов опромінення в дозі 1,0 Гр (рис.1).
Для з’ясування причин встановлених нами післяпроменевих змін активності ТПФ-аз нами було здійснено ізолювання та очищення ферментативного препарату трансмембранної ТПФ-ази CD45 з плазматичних мембран тимоцитів щурів після опромінення у дозі 0,5 Гр - за умов, коли були встановлені найбільш суттєві порушення функціонування ТПФ-аз. Було досліджено залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації різних субстратів - паранітрофенілфосфату та фосфотирозину, та визначено максимальну швидкість реакції (V max), константи Міхаеліса (Km) та Хіла (h) для цих двох субстратів (табл.2).
Таблиця 2
Кінетичні характеристики ферментативного препарату тирозинової протеїнфосфатази CD45, ізольованої з тимоцитів щурів
за умов впливу іонізуючого випромінювання, n=15
*- р≤ 0,05 порівняно з контролем
Встановлено, що фермент виявляє найбільшу спорідненість до фосфотирозину. Особливістю взаємодії ферменту з фосфотирозином є наявність позитивної кооперативності. Дослідження протікання реакції дефосфорилювання у присутності інгібітору протеїнфосфатаз ванадату натрію дозволили встановити конкурентний тип інгібування, за якого інгібіторна молекула блокує активний центр ферменту (табл.2).
Нами було проведено оцінку кінетичних параметрів реакції дефосфорилювання за участю ферменту, отриманого з тимоцитів опромінених тварин з метою з’ясування механізму ТПФ-азної реакції у післяпроменевому періоді (табл.2). Показано, що іонізуюче опромінення тварин призводило до зниження початкової максимальної швидкості ферментативної реакції як при використанні паранітрофенілфосфату, так і фосфотирозину. Уявна константа Міхаеліса для паранітрофенілфосфату зменшувалась, що свідчить про зростання спорідненості цього, менш специфічного, субстрату до ферменту за умов променевого впливу. У випадку фосфотирозину константа Міхаеліса значно зростала в присутності ванадату натрію у разі визначення активності ферментативного препарату, отриманого з тимусу опромінених тварин (табл.2).
Зростання коефіцієнту Хілла після променевого впливу може свідчити про збільшення кооперативних взаємодій між двома протеїнтирозинфосфатазними доменами ферменту та фосфотирозином. Вплив променевого фактору у випадку введення у реакційну суміш ванадату натрію полягав у заміні конкурентного інгібування змішаним типом, за якого змінювалась не тільки спорідненість ферменту до фосфотирозину, а й максимальна швидкість реакції (табл.2).
Оскільки умови ізолювання ферменту з тимоцитів контрольних та опромінених тварин істотно не відрізнялись, разом такі порушення можуть свідчити про радіаційно-індуковані зміни молекули досліджуваного ферменту.
Для подальшого з’ясування механізмів функціонування досліджуваних ферментативних систем лімфоцитів за умов впливу іонізуючого випромінювання було застосовано ряд речовин, які мають різні способи реалізації своїх протипроменевих та імуностимулюючих властивостей. Серед таких речовин нами було обрано сквален, циклоферон, клітинно-зв’язаний білок А мікробного походження та інтерлейкін 12.
Сквален є сполукою природного походження, яка складається з шести ізопренових одиниць та має протипухлинну, імуностабілізуючу, ранозагоюючу та радіопротекторну дію на організм в цілому [Kelly, 1999]. Введення сквалену нормалізує вміст ТБК-активних сполук, знижує вміст дієнових кон’югатів, підвищує активність антиоксидантних ферментів [Дробінська, 2004], у той же час механізм його дії на клітиному рівні детально не вивчено.
Нами було встановлено, що за відсутності променевого впливу введення сквалену знижувало активність ТПФ-аз у більшості випадків, крім цитозольних ферментів тимоцитів (табл.3).
Дослідження активності ТПФ-аз в плазматичних мембранах та цитозолі тимоцитів за умов тотального рентгенівського опромінення тварин показало, що введення сквалену приводило до істотного зростання активності ТПФ-азних систем тимоцитів відносно контрольного рівня (особливо за впливу променевого фактору у невисоких дозах 0,25 та 0,5 Гр) (табл.3).
Таблиця 3
Активність тирозинових протеїнфосфатаз в плазматичних мембранах та цитозолі лімфоїдних клітин селезінки та тимусу щурів
за умов впливу іонізуючого випромінювання на тлі введення
сквалену та циклоферону, нмоль Рі * (хв * мг білка)-1 , n=6
*- р≤ 0,05 порівняно з контролем без введення речовин
У клітинах селезінки активність ТПФ-аз на тлі введення тваринам сквалену набувала максимальних значень за дії іонізуючої радіації при вищих дозах – 0,75 та 1,0 Гр (табл.3).
Відомо, що інтерферон-індукована сигнальна трансдукція здійснюється за участю ферментів системи тирозинового фосфорилювання білків. Нами було проведене дослідження ефекту введення піддослідним тваринам циклоферону, який є імуноселективним індуктором інтерферону, на активність ТПФ-аз в лімфоїдних клітинах селезінки та тимусу контрольних та опромінених щурів (табл.3). Згідно з даними сучасних фундаментальних досліджень, введення циклоферону створює умови для активації систем сигнальної трансдукції після променевого впливу [Михайлик, 2002].
За відсутності променевого впливу введення циклоферону контрольним тваринам приводило до інгібування мембраноасоційованої активності ТПФ-аз; цитозольні форми ферменту набували більш значної дефосфорилюючої активності (табл.3).
Підвищення активності ТПФ-аз тимоцитів на тлі введення циклоферону було встановлено за умов впливу іонізуючого випромінювання у більш високих дозах – 0,75 Гр для цитозольних ферментів та 1,0 Гр для мембраноасоційованих ТПФ-аз (табл.3).
Для мембранозв’язаних ТПФ-аз клітин селезінки опромінених щурів максимальне зростання ферментативної активності було встановленено за умов впливу променевого фактору у дозі 1,0 Гр на тлі введення тваринам циклоферону. Для цитозольних ТПФ-аз спленоцитів тварин, які отримували циклоферон, характерним було більш значне зростання активності за дози 0,25 Гр.
При інкубації клітин з інтерлейкіном 12 - молекулою міжклітинної сигналізації, яка реалізує свій ефект безпосередньо за участі ферментів тирозинового фосфорилювання-дефософорилювання білків, активність ТПФ-аз значно зростала як у плазматичних мембранах, так і у цитозолі лімфоїдних клітин селезінки щурів. Опромінення тварин у дозах 0,5 та 1,0 Гр зменшувало цитокін-стимульоване зростання активності ТПФ-аз.
Для визначення участі ТПФ-аз у формуванні імунної відповіді за умов дії променевого фактору ми використовували клітинно-зв’язаний білок А – мітоген мікробного походження, який стимулює імунні функції Т-та В- лімфоцитів. Введення цього агенту у клітинну суспензію тимоцитів приводило до значного зростання активності ТПФ-аз як у плазматичних мембранах (у 4,2 рази), так і у цитозолі (у 3,5 рази). Здатність ТПФ-аз активуватися внаслідок дії мітогену під впливом променевого фактору не спостерігалася. Опромінення тварин не змінювало встановлений стимулюючий ефект мітогенного агенту на досліджуваний фермент як у плазматичних мембранах, так і у цитозолі клітин селезінки.
Системи передачі сигналів у клітинах перебувають у взаємозв’язку: показано наявність взаємної регуляції ферментів фосфотирозинового балансу та системи циклічних нуклеотидів [Lorenz, 1998]. Особливого значення у випадку визначення функціонального стану лімфоїдних клітин набуває співвідношення циклічних нуклеотидів цАМФ/цГМФ, і тому нами було визначено цей показник у клітинах тимуса та селезінки щурів за умов дії досліджуваних доз іонізуючого випромінювання.
Знайдено, що тотальне опромінення тварин у дозах 0,25 Гр та 1,0 Гр призводить до зростання співвідношення цАМФ/цГМФ у клітинах тимусу. За умов перорального введення сквалену зростання показника цАМФ/цГМФ у тимоцитах було виявлено після впливу променевого фактору у дозі 0,75 Гр, і посилювалося за 1,0 Гр. Введення циклоферону спричиняло значне зростання співвідношення цАМФ/цГМФ у клітинах тимусу за умов впливу променевого фактору у дозі 0,5 Гр.
У клітинах селезінки опромінених тварин найбільш істотне зростання співвідношення цАМФ/цГМФ спостерігалось за умов опромінення у дозі 0,25 Гр. Введення піддослідним тваринам сквалену приводило до зростання цього показника після опромінення тварин у більш значних дозах – 0,75 та 1,0 Гр. Ефект парентерального введення циклоферону полягав у незначних змінах співвідношення цАМФ/цГМФ за умов опромінення у дозах 0,25-0,75 Гр та збільшенні цих значень при дозі 1,0 Гр.
Таким чином, встановлені зміни активності ТПКаз та ТПФ-аз та зміни співвідношення цАМФ/цГМФ у клітинах селезінки та тимусу щурів на тлі введення різних біологічно активних речовин розкривають одну зі сторін механізму реалізації протипроменевих властивостей цих речовин. Це вказує на залучення досліджуваних ланок сигнальних каскадів у формування адаптаційної реакції лімфоцитів тимусу та селезінки щурів при опроміненні низькими дозами.
ВИСНОВКИ
Досліджено роль тирозинових протеїнфосфатаз у формуванні післяпроменевої реакції лімфоїдних клітин селезінки та тимусу щурів, опромінених у дозах 0,25; 0,5; 0,75 та 1,0 Гр.
Показано, що інкубація клітин з епідермальним ростовим фактором збільшувала активність мембраноасоційованих тирозинових протеїнкіназ в клітинах селезінки щурів. Цей стимулюючий ефект знижувався за умов тотального опромінення тварин у дозах 0,5 та 1,0 Гр.
Найбільше зростання активності тирозинових протеїнфосфатаз спостерігалось за умов впливу іонізуючої радіації в дозі 0,5 Гр.
Досліджено кінетичні властивості очищеного ферментативного препарату тирозинової протеїнфосфатази CD45, ізольованого з плазматичних мембран клітин тимусу контрольних та опромінених у дозі 0,5 Гр тварин. Фосфотирозин був більш специфічним субстратом для ізольованого ферменту, ніж паранітрофенілфосфат. Фермент виявляв позитивну кооперативність до фосфотирозину, яка зростала за умов променевої дії. Для ферменту, отриманого з клітин тимусу тварин, опромінених у дозі 0,5 Гр показано зниження спорідненості до фосфотирозину та пригнічення максимальної швидкості фосфатазної реакції.
Введення контрольним тваринам сквалену знижувало активність тирозинових протеїнфосфатаз в усіх дослідженнях, крім ферментів цитозолю тимоцитів; циклоферону – знижувало активність тирозинових протеїнфосфатаз в плазматичних мембранах та підвищувало її в цитозолі клітин як тимусу, так і селезінки. За іонізуючого опромінення тварин введення сквалену приводило до найбільшого зростання активності тирозинових протеїнфосфатаз в клітинах тимусу після впливу променевого фактору в дозах 0,25 та 0,5 Гр, а в клітинах селезінки – в дозі 1,0 Гр. Найвищі значення активності мембраноасоційованих тирозинових протеїнфосфатаз клітин як тимусу, так і селезінки за умов введення циклоферону були знайдені після опромінення тварин у дозі 1,0 Гр, цитозольних ферментів тимоцитів – у дозі 0,75 Гр, спленоцитів – у дозі 0,25 Гр.
Інкубація лімфоїдних клітин з інтерлейкіном 12 та клітинно-зв’язаним білком А приводила до підвищення активності ТПФ-аз у клітинах тимусу та селезінки як контрольних, так і опромінених тварин.
Встановлено однакову спрямованість змін активності тирозинових протеїнкіназ, тирозинових протеїнфосфатаз та вмісту циклічних нуклеотидів у клітинах селезінки та тимусу щурів на тлі введення різних біологічно активних речовин за умов опромінення щурів у дозах 0,25, 0,5, 0,75 та 1,0 Гр.
| 
