|
КИЇВСЬКИЙ УНІВЕРСИТЕТУ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ЛАЗАРЕНКО Лариса Михайлівна
УДК 576.3+575.224.23
ЦИТОГЕНЕТИЧНА ОЦІНКА МУТАБІЛЬНОСТІ
Allium fistulosum L. (Liliacea, Magnoliophyta)
ПРИ СТАРІННІ НАСІННЯ
14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Київському університеті імені Тараса Шевченка
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Бариляк Ігор Романович, Український науковий центр медичної генетики МОЗ і НАН України, директор
кандидат медичних наук Кравчук Олександр Павлович, НДІ екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, завідувач лабораторією мутагенезу
Провідна установа:
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, відділ цитофізіології та генетичної інженерії, м. Київ – 143, вул. Заболотного, 148
Захист дисертації відбудеться "20" жовтня 1999 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 в Київському університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 252022, Київ – 22, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського університету імені Тараса Шевченка за адресою: 252033, Київ – 33, вул. Володимирська, 58
Автореферат розісланий "03" вересня 1999 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Давидовська Т.Л.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Мутагенез завжди мав статус проблеми: для біології взагалі й еволюційного вчення зокрема, для селекційної практики й медицини (Ауэрбах, 1978). Існувала навіть проблема пошуку нових мутагенів – для потреб селекції (Шкварников, 1966; Коваленко, 1967; Рапопорт и др., 1980). Однак сьогодні, у зв'язку з забрудненням природного середовища генотоксичними речовинами, проблема мутагенезу вже невіддільна антимутагенезу – як проблеми захисту від мутагенів (ВОЗ, 1989; Бариляк, 1998). Особливо гостро проблема ця стосується України, де екологічна ситуація ускладнюється радіаційним забрудненням внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС (Нац. допов., 1993). Оскільки матеріальну основу мутацій складають хімічні зміни в структурі гена, спонтанність природного мутаційного процесу взагалі умовна, і рівень природного мутування залежить від стану оточуючого середовища, як щодо його хімічного вмісту, так і відносно радіаційного забруднення (Алекперов, 1984; Корогодин, 1995). На клітинному рівні показником мутаційного процесу є хромосомні аберації (ХА), підвищений рівень яких розглядається як хромосомна нестабільність ( Фогель, Мотульски, 1989; Гилева и др., 1996). Хромосомна нестабільність, гіпермутабільність, має місце при розвитку злоякісних новоутворень (Jackson, Loeb, 1998; Strauss, 1998). В той же час вона природньо підвищується при старінні (Орлова, 1972). Створення нової концепції гігієнічного нормування потенційно мутагенних речовин, що надходять у середовище (Кравчук, 1998), вимагає знань про особливості та закономірності природного, спонтанного мутування. Тому мутаційним дослідженням нині надається велике значення (Drake, 1998).
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках двох програм ДКНТ: "Вивчення антимутагенних та генопротекторних властивостей біологічно активних речовин природного походження" (N державної реєстрації 0194U031070, шифр 01.01.01/021 /005К-95) та " Розробка наукових основ та рекомендацій застосування індукторів та пролонгаторів дії інтерферону з метою використання його як антимутагену" (N державної реєстрації 0194U031071, шифр 01.01.05/005 /005К-95), які входили до комплексної Державної Програми "Захист генофонду населення України".
Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у вивченні цитогенетичних особливостей вікової динаміки мутабільності Allium fistulosum L. Відповідно до мети вирішувались такі задачі:
- Цитогенетичний аналіз вікової динаміки спонтанної мутабільності клітин у насінні Allium fistulosum L.
- Вивчення модифікуючого ефекту доексперементальної обробки насіння.
- Аналіз змін частоти аберантних анафаз у Allium fistulosum L. під дією модельного мутагена.
- Аналіз чутливості клітин кореневої меристеми Allium fistulosum L. до впливу біологічно активних речовин.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено цитогенетичний аналіз динаміки спонтанної мутабільності клітини у Allium fistulosum L. при старінні протягом тривалого часу. Встановлено нерівномірно коливальний характер та неоднакову швидкість вікової динаміки спонтанної мутабільності клітин у насінні різних партій.
Встановлено наявність у насіннєвій шкірці молодого насіння речовин, які протягом певного часу не являються аутомутагенами, а набувають мутагенної активності згодом, при старінні насіння. Видалення цих речовин приводить до гальмування вікового прискорення мутагенезу.
Практичне значення одержаних результатів. Швидкість вікових змін цитогенетичних показників мутабільності клітин кореневої меристеми у проростаючому насінні різних партій різна, що необхідно враховувати при використанні Allium fistulosum L. як тест-об'єкту у дослідженнях, пов'язаних з тестуванням речовин. Показана можливість застосування формальдегіду (орієнтовної концентрації 0,00004 %) як модельного мутагену в рослинних тест-системах. Результати дослідження використовуються у практикумі з цитогенетики на кафедрі загальної та молекулярної генетики Київського університету імені Тараса Шевченка.
Особистий внесок здобувача. Пошукувач була відповідальним виконавцем планової НДР (№ державної реєстрації 0194U031070, шифр 01.01.01/021 /005К-95) "Вивчення антимутагенних та генопротекторних властивостей біологічно активних речовин природного походження", яка входила до комплексної Державної Програми "Захист генофонду населення України"; приймала участь у визначенні мети та конкретних завдань дослідження. Нею висіяно на ділянці насіння, одержано урожай насіння в 1994 та інших роках для подальших досліджень, поставлено 58 серій експериментів за темою дисертації, власноручно виготовлено та проаналізовано близько 4600 препаратів, проведено мікрофотозйомки препаратів, опрацьовано результати та опубліковано основний зміст дисертаційної роботи.
Апробація роботи. Результати роботи оприлюднені на Міжнародних симпозіумах "Біологічні механізми старіння" (Харків, 1996; Харків, 1998) та на "Наукових читаннях", присвячених 100-річчю відкриття подвійного запліднення у покритонасінних рослин професором університету Святого Володимира С.Г. Навашиним (Київ, 1998).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт: 4 роботи у фахових наукових журналах, 1 – в збірнику наукових праць, 2 – в тезах симпозіумів.
Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень та їх обговорення, висновків та списку використаної літератури. Робота викладена на 120 сторінках, містить 37 рисунків та 25 таблиць. Список літератури містить 161 джерело.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень
Вікову динаміку утворення хромосомних аберацій (ХА) досліджували на 5 партіях насіння: насіння урожаю 1990 р.; насіння урожаю 1994 та 1995 рр., одержане з насіння 1990 р.: 1994 та 1995-А – насіння, вирощене в Чернігівській обл., 1995-В та 1995-С – вирощене відповідно у Васильківському та Баришівському районах Київської обл. Насіння зберігали в скляному посуді в лабораторних умовах.
Насіння пророщували в термостаті при температурі 24°С. Схожість визначали через 72 год після замочування насіння. Для мікроскопічного аналізу готували тимчасові давлені препарати, фарбовані ацеторсеїном (Дарлингтон, 1980). Клітини кореневої меристеми проростків A. fistulosum L. аналізували анафазним методом (Паушева, 1988). Обчислювали частоту аберантних анафаз (ЧАА) – частку анафаз з абераціями від загальної кількості анафаз, виражену в %; пошкодженість аберантної клітини (ПАК) – кількість аберацій, що припадає на 1 аберантну клітину (в %); частку мостів від загальної кількості аберацій (ЧМ, %), та частку мостів хромосомного типу – дицентриків, від загальної кількості мостів (ЧД, %). Математичну обробку даних проводили згідно загальновизнаних методик (Лакин, 1990), попарну кореляцію та регресійний аналіз проводили з використанням пакету програм "STATISTIKA" (Боровиков, 1998).
Доекспериментальна обробка насіння полягала у промиванні його розчинами KMnO4 (0,05 %), NaHCO3 (0,3 %) та дистильованою водою за описаною методикою (Лазаренко и др., 1995). Промите насіння зберігалось також у скляному посуді в лабораторних умовах.
Для вивчення чутливості клітин батуна до формальдегіду (ФА) та біологічно активних речовин (БАР) рибофлавіну й тимогену, насіння пророщували у розчині досліджуваних речовин та в суміші ФА та рибофлавіну чи тимогену досліджуваних концентрацій.
Автор виражає глибоку подяку Сіренку І.П. за допомогу в компьютерній обробці даних.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вікові особливості спонтанної мутабільності клітин кореневої меристеми Allium fistulosum L. Вікові зміни всіх цитогенетичних показників у насінні всіх досліджених партій відбуваються нерівномірно (табл. 1 – 4). Не завжди високим значенням ЧАА відповідають високі значення ПАК і навпаки. І лише після 3-х років зберігання насіння 1994 р. та на 3-ому році зберігання насіння партії 1995-В високі значення ЧАА супроводжуються високою пошкодженістю аберантної клітини (табл. 1, 3).
Таблиця 1
Утворення хромосомних аберацій в клітинах кореневої меристеми
Allium fistulosum L. при старінні насіння (урожай 1994 року)
Показник ЧАА для 1-місячного насіння партій 1994 та 1995-А рр., вирощеного за одних і тих же географічних умов, суттєво відрізняється (табл. 1, 2).
Наростання показника ЧАА в клітинах насіння трьох партій одного й того ж, 1995 року врожаю відбуваються з різною швидкістю (табл. 2 – 4). У насінні 1995-С, незважаючи на найвище вихідне значення ЧАА (табл. 4), зростання його відбувається найбільш повільно. Саме ці дані спонукали нас до регресійного аналізу, який дозволив кількісно оцінити швидкість цитогенетичних змін мутабільності та внесок віку як фактору в утворення хромосомних аберацій.
Коефіцієнт регресії частоти аберантних анафаз за віком насіння – bЧАА, дорівнює середній швидкості наростання показника ЧАА - % міс.
Таблиця 2
Утворення хромосомних аберацій в клітинах кореневої меристеми
Allium fistulosum L. при старінні насіння (урожай 1995-А р.)
Таблиця 3
Утворення хромосомних аберацій Allium fistulosum L.
при старінні насіння (урожай 1995 – В р.)
Таблиця 4
Утворення хромосомних аберацій Allium fistulosum L.
при старінні насіння (урожай 1995 – С р.)
Коефіцієнт детермінації R2 – показник тісноти кореляційного зв'язку, що показує, яка частка варіації однієї ознаки залежить від варіювання іншої ознаки, тобто наскільки зміни частоти аберантних анафаз зумовлюються віком насіння (Лакин, 1990). З рисунків 1 – 4 видно характер та швидкість вікової динаміки ЧАА в кореневій меристемі насіння A. fistulosum L. 1994 та 1995 (А,В,С).
Незважаючи на те, що насіння 1995 (А,В,С) р. одержане з однієї партії насіння 1990 р., вікові зміни ЧАА відбуваються по різному в усіх трьох партіях, як за швидкістю (коефіцієнт регресії b), так і за характером наростання. У насінні 1995-В швидкість цитогенетичних змін найвища, коливання ЧАА найбільш виражені, амплітуда коливань при наростанні ЧАА також збільшується.
Різна середня швидкість мала місце також в динаміці інших цитогенетичних показників. Для порівняння швидкості вікової динаміки мутабільності вирішено скористатись умовною класифікацією, за якою низька швидкість – при b= 0 – 0,3; середня швидкість - коли b = 0,3 – 0,7; висока швидкість – коли b = 0,7 – 1,0 за абсолютною величиною (табл. 5).
Таблиця 5
Цитогенетичні показники мутабільності клітин кореневої меристеми
у насінні Allium fistulosum L. різних партій
Примітки:
b- коефіцієнт регресії (швидкість вікової динаміки - %/міс);
R2 - коефіцієнт детермінації;
(*) – низька швидкість; (**) – середня швидкість; (***) – висока швидкість.
За різних умов формування насіння внесок віку, як фактора, у розвиток інших цитогенетичних показників (ПАК, ЧМ, ЧД) також неоднаковий, як про це свідчить коефіцієнт детермінації. Проте в основному частота аберантних анафаз визначається віком у насінні всіх партій ( R2 > 0,5). Зміни інших цитогенетичних показників (ПАК, ЧМ, ЧД) у насінні різних партій в більшості визначаються іншими, неврахованими, факторами.
Аналіз попарної кореляції показав, що вік насіння 1994 та 1995-В позитивно корелює з показниками ЧАА та ПАК. У насінні 1995-А вік не корелює з ПАК, хоча сильно корелює з ЧАА, яка з ПАК достовірно корелює (р ≤ 0,05). Негативна кореляція між віком та ЧМ і позитивна – між віком та ЧД мала місце у насінні 1994, 1995-А та 1995-В. У насінні 1995-С єдина статистично вірогідна (позитивна) кореляція спостерігалась лише між віком насіння та ЧАА. Привертає увагу відсутність кореляції між схожістю насіння та будь-яким з цитогенених показників, а також між віком та схожістю насіння всіх досліджених партій.
Розвиток мутабільності у A. fistulosum L. при старіння насіння, промитого розчином перманганату калію. Складний характер вікової динаміки утворення ХА та пошкодженість клітин (рис. 5) у насінні 1990 р. на 2 році зберігання змусили нас припустити, що , можливо, насіння було оброблене фунгіцидом, який, розчиняючись у воді при проростанні насіння, проникає в клітини кореневої меристеми.
Рис.5. Хромосомні аберації в клітинах кореневої меристеми Allium fistulosum L. : а – анафаза з подвійним мостом; б – анафаза з кільцем та множинними фрагментами й мостами. Фарбування ацетоорсеїном. Зб. ок. 10, об. 40.
Спроба видалити фунгіцид шляхом промивання насіння перманганатом калію (0,05 %), дистильованою водою та бікарбонатом натрію (0,03 %) виявила значний антимутагенний ефект перманганату калію (рис. 6).
Рис.6. Цитогенетичний ефект промивки насіння батуна: 2 – перманганатом калію (0,05 %); 3 – дистильованою водою; 4 – бікарбанатом натрію (0,03 %); 1 - насіння непромите.
Протягом наступних 10-ти місяців у промитому перманганатом калію насінні спостерігались значно нижчі значення та відсутність наростання частоти аберантних анафаз, про що свідчить коефіцієнт регресії b (рис. 7, 8). Значення ЧАА протягом 1 року після промивки насіння коливались в межах 10 - 13 %.
Далі утворення ХА прискорюється, але абсолютне значення ЧАА – в більшості статистично нижчі порівняно з такими у непромитому насінні.
У насінні 1994 р., промитому у віці 1,5 міс., очікуваний антимутагенний ефект перманганату калію був відсутній, як і в щойно промитому насінні, що мало на час промивки 9 міс. Антимутагенний ефект KMnO4 виявився, коли насіння досягло 18 місяців: у промитому насінні ЧАА, наростаючи, все ж була на рівні, що достовірно відрізнявся від такого у непромитому насінні (табл. 6).
Таблиця 6
Зміни хромосомних аберацій у Allium fistulosum L.
при старінні насіння (урожай 1994 року)
| 
