|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ВЕЧЕРЯ ОЛЕГ ОЛЕКСАНДРОВИЧ
УДК 599:539.1.047:577.346
ХРОНІЧНА ДІЯ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ ТА КАДМІЮ НА КЛІТИНИ ПЕЧІНКИ І СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ЩУРІВ
03.00.01— радіобіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ-2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету
Київського національного університету імені Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Войціцький Володимир Михайлович,
Київський національний університет
Імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
Дружина Микола Олександрович,
Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник;
доктор біологічних наук,
Кутлахмедов Юрій Олексійович,
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач лабораторії радіоекологічної надійності екосистем.
Провідна установа: Національний науковий центр радіаційної медицини АМН України, Інститут експериментальної радіобіології, лабораторія радіаційної біохімії, м. Київ
Захист відбудеться 24.02.2003 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, проспект Глушкова 2, корпус, 12, біологічний факультет, ауд. 215.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64;
Спецрада Д 26.001024, біологічний факультет
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:
м. Київ, вул. Володимирська, 58
Автореферат розісланий “22” січня 2003 року
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.
Актуальність теми. Дослідженя сумісної дії іонізуючої радіації та хімічних забруднювачів довкілля є однією з актуальних проблем, оскількі ці чинники призводять до розвитку патологічних станів. Саме дослідження реакції організму на клітинному рівні дає змогу виявити первинні механізми такої дії, визначити можливість прояву захисно-компенсаторних реакцій, розробити шляхи зменшення негативного впливу на організм зазначених чинників.
Іонізуюча радіація та токсичні хімічні речовини, зокрема солі важких металів, негативно впливають на організм навіть у відносно низьких дозах [Городзинський, 2000; Трахенберг, 1994]. До одного з токсичніших техногенних забрудників оточуючого середовища відноситься кадмій. Він здатний всмоктуватись в тонкому кишечнику, накопичуватись переважно в клітинах печінки та нирках, де може затримуватись довгий час та негативно впливати на організм [Богомазов, 1985; 1986; 1992].
Біологічні мембрани, як надмолекулярні інтегруючі системи, які формують клітину та внутрішньоклітинне середовище, забезпечують прояв усіх важливих функцій організму [Кучеренко та ін., 1995]. Вони є основними мішенями дії як фізичних, так і хімічних чинників. Порушення структурно-функціональних властивостей біомембран викликає розвиток багатьох паталогічних процесів [Барабой, Судковой,1997].
Сумісна дія іонізуючої радіації та інших чинників довкілля, в тому числі важких металів [Руднев и др., 1994], призводить до появи різноманітність біохімічних змін в організмі. В дослідженнях [Войцицкий и др., 1994; 1997; Хижняк, 1997; Хижняк и др., 1998; 1999; 2000; Hizhnyak et al., 1996, 2001] визначені основні шляхи дії іонізуючої радіації (рентгенівського випромінювання) в сублетальних дозах на структурно-функціональні властивості ентероцитів слизової оболонки тонкого кишечника при одноразовому опроміненні, та за сумісної дії з іонами кадмію. В той же час, ще не достатньо досліджені особливості сумісної хронічної дії цих чинників.
Таким чином, значної актуальності набуває дослідження особливостей хронічної сумісної дії сублетальних доз іонізуючої радіації низької інтенсивностей та низьких доз кадмію на структурно-функціональні властивості клітин печінки та слизової оболонки тонкого кишечника.
Зв'язок з науковою тематикою організації. Робота виконана у рамках теми № 97083 “Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації” кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Мета та завдання дослідження. Визначити особливості та характер взаємодії хронічного сумісного впливу іонізуючої радіації малої потужності та низьких концентрацій іонів кадмію на структурно-функціональні властивості клітин печінки та слизової оболонки тонкого кишечника.
В зв'язку з цим були поставлені такі завдання:
1. Дослідити окрему та сумісну хронічну дію іонізуючої радіації (потужність дози 0,72 сГр/добу, та хлориду кадмію (потрапляв в організм з питною водою, яка містила 0,01 мг/мл СdСl2 (10 ГДК), що в середньому становить 250 мкг СdСl2 на добу) на:
а) морфометричні показники та проліферативну активність клітин печінки і різних відділів тонкого кишечника (дванадцятипала та порожня кишки);
б) активність мембранозв'язаних ферментів клітин печенки та слизової оболонки тонкого кишечника;
в) кількісний склад ліпідів в клітинах печінки, слизової оболонки кишечника та апікальної мембрани ентероцитів;
г) протікання процесів ПОЛ в мембранах гепатоцитів та ентероцитів слизової оболонки тонкого кишечника, їх антиокисну активність.
2. Провести факторний аналіз досліджуваних показників з метою встановлення тих із них, які мають суттєве значення при оцінці структурно-функціонального стану печінки та слизової оболонки тонкого кишечника за умов сумісної хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію.
3. Визначити характер взаємодії іонізуючої радіації та кадмію в клітинах печінки та слизової оболонки тонкого кишечника за умов досліджень.
Об'єкт дослідження: окрема та сумісна хронічна дія іонізуючої радіації та СdСl2 на організм.
Предмет дослідження: ентероцити слизової оболонки тонкого кишечника та гепатоцити.
Методи дослідження: Радіобіологічні, спектрометричні, морфологічні, гістологічні, світлова мікроскопія, математичні.
Наукова новизна. Проведено та систематизовано комплексні морфологічні, гістологічні та біохімічні дослідження як окремої так і сумісної хронічної дії іонізуючої радіації з потужністю дози 0,72 сГр/ добу при досягнення дози 0,3 Гр, 0,6 Гр і 1,0 Гр та низьких концентрацій кадмію (250 мкг СdСl2 за добу) на структурно-функціональний стан клітин печінки та слизової оболонки тонкого кишечника.
Встановлено, що поряд з радіаційним фактором у структурних порушеннях клітин печінки значний внесок належить хронічному впливу кадмію, що пов'язано з переважним накопиченням кадмію в клітинах печінки та його токсичними властивостями.
За хронічної сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію виявлено здатність ентероцитів слизової оболонки тонкого кишечника посилювати процеси регенерації. Спостерігаються зміни ліпідного матриксу мембран цих клітин та інгібування активності мембранозв'язаних ферментів, які посилюються з підвищенням дози діючих чинників.
Встановлено, що хронічна сумісна дія іонізуючої радіації та кадмію в умовах досліджень призводить до порушення окисно-антиоксидантної системи клітин печінки та слизової оболонки тонкого кишечника в результаті посилення процесів ліпідної пероксидації і виявляється в дисбалансі накопичення продуктів ПОЛ.
Застосування методу головних компонент дозволило визначити найсуттєвіші за умов проведення досліджень показники серед вибраних параметрів, які визначають стан клітин печінки та слизової оболонки тонкого кишечника за хронічної сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію. Зроблена класифікація об'єктів дослідження, тобто, віднесення їх до тієї чи іншої визначеної групи, що дало можливість обгрунтувати висновки про дію досліджуваних чинників на організм.
Встановлено, що за хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію в умовах проведення досліджень їх взаємодія має антагоністичний характер.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть слугувати науковим обґрунтуванням розробки методів корекції та запобігання порушень структурно-функціональних властивостей клітин печінки та слизової оболонки тонкого кишечника за дії іонізуючої радіації та кадмія.
Показана доцільність використання методу головних компонент для виявлення “прихованих” закономірностей, які регулюють протікання досліджуваних процесів.
Викладені в роботі положення можуть бути включені до навчальних програм вузів, де викладаються курси “Радіобіологія”, “Радіаційна медицина”, “Радіаційна біохімія” тощо.
Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто провів пошук та аналіз наукової літератури за темою роботи та статистичну обробку результатів, а також брав участь у виконанні всіх експериментальних робіт. За участю наукового керівника та співавторів публікацій проведено інтерпретацію результатів роботи, обговорення положення, які висунуті на захист, та висновки.
Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи були висвітлені на: Міжнародній науковій конференції “Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде” (Семипалатинск, 2000), Міжнародному екологічному конгресі “Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности” (Санкт-Петербург, 2000), Міжнародній науковій конференції “Биоард-2001. Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиактивное загрязнение среды” (Сиктивкар, 2001), Всеукраїнській науково-практичній конференції Інституту ядерних досліджень НАН України (Київ, 2001), Науково-практичних конференціяї професорсько-викладацького складу Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2000; 2001).
Публікація матеріалів. Основні положення дисертаційної роботи викладено в 6 наукових публікаціях, з яких 3 статті у профільних виданнях.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду наукової літератури, опису матеріалів та методів дослідження, власних досліджень з обговоренням, заключення, висновків, списку використаної літератури, що включає 227 посилань.
Робота викладена на 140 сторінках машинопису, ілюстрована 8 рисунками та 16 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження були проведені на білих безпородних щурах-самцях, масою 180-200 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію та які постійно знаходились в приміщенні, де було розташоване джерело іонізуючого випромінювання направленої дії, а які не піддавали дії іонізуючого випромінювання, були додатково захищені від нього свинцевим екраном. Після закінчення досліджень, експерементальних тварин забивали шляхом декапітації.
Хронічне зовнішнє g-опромінення експериментальних тварин здійснювали на установці “Еталон” Інституту ядерних досліджень НАН України, яка як джерело випромінювання містила 60Со. Потужність дози становила — 0,72 сГр/добу. Експериментальні тварини разом з питною водою споживали хлорид кадмію Ї 0,01 мг/мл CdCl2 (10 ГДК). Із урахування того, що за добу щур випиває близько 25 мл води , то за 1 добу до його організму з питною водою надходило приблизно 250 мкг CdCl2.
Тварин ділили на 13 груп в залежності від мети експерименту:
1. Контроль на початку досліду;
2. Контроль; тривалість дослідження — 42 доби.
3. Тварин піддавали дії кадмію; тривалість дослідження — 42 доби.
4. Тварин піддавали дії g-опромінення в сумарній дозі 0,3 Гр; тривалість дослідження — 42 доби.
5. Тварин піддавали сумісній дії g-опромінення в сумарній дозі 0,3 Гр та кадмію; тривалість дослідження — 42 доби.
6. Контроль; тривалість дослідження — 84 доби.
7. Тварин піддавали дії кадмію; тривалість дослідження — 84 доби.
8. Тварин піддавали дії g-опромінення в сумарній дозі 0,6 Гр; тривалість дослідження — 84 доби.
9. Тварин піддавали сумісній дії g-опромінення в сумарній дозі 0,6 Гр та кадмію; тривалість дослідження — 84 доби.
10. Контроль; тривалість дослідження — 145 діб.
11. Тварин піддавали дії кадмію; тривалість дослідження — 145 діб.
12.Тварин піддавали дії g-опромінення в сумарній дозі 1,0 Гр; тривалість дослідження — 145 діб.
13. Тварин піддавали сумісній дії g-опромінення в сумарній дозі 1,0 Гр та кадмію; тривалість дослідження — 145 діб.
Перед початком досліду, а також 2 рази на тиждень в період досліджень проводили дозиметричний контроль, і вводились при необхідності відповідні корегування.
Для дослідження морфометричних показників парафінові напівтонкі зрізи готували згідно з методикою [Волкова та ін., 1982; Карупу, 1984]. На парафінових та напівтонких зрізах за допомогою окулярмікрометра вимірювали висоту ентероцитів одношарового епітелію щіткової облямівки. Вимірювання діаметру ядер гепатоцитів та площі поперечного перерізу ядер ентероцитів проводили на напівавтоматичній установці “Інтеграл-2МТ” за програмою “Маркер”. Мітотичний індекс визначали згідно методики [Астауров, 1974] та підраховували кількість клітин, які припадають на крипту. При даних дослідженнях за 2 год до забою тваринам перорально вводили розчин колхіцину в концентрації 0,2 мг на 100г живої маси.
Активність лужної фосфатази визначали згідно [Chijsen, 1980], активність g-глутамілтрансферази—згідно [Lin et all, 1981], активність аланінаминотрансферази — згідно [Expert, 1976]. Визначення Мg2+-АТФазної та Nа+,К+-АТФази активності проводили згідно [Chijsen, 1980].
Вміст ТБК (2-тіобарбітурова кислота)Їактивних продуктів, за рівнем яких оцінювали кількість малонового діальдегіду (МДА) визначали за методом [Орехович, 1977]. Визначення шиффових основ проводили згідно [Tappel, 1978], а дієнових кон'югатів (ДК) — [Орехович, 1977]. Визначення антиокисної активності (АОА) проводили за методом [Семенов и др., 1985]. Кількость триацилгліцеролів, холестеролу та загальних фосфоліпідів визначали ферментативним методом за допомогою біхроматичної фотометричної системи “STAT FAX 1904 PLUS” (США).
Для визначення ступеня взаємного впливу різних параметрів досліджуваних процесів та виявлення об'єктивно існуючих закономірностей використовували метод факторного аналізу [Харман, 1972; Браверман, 1983].
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Цитоморфометричні дослідження стану слизової оболонки тонкої кишки і печінки. Встановлено, що хронічне опромінення вже при сумарній дозі 0,6 Гр викликає перебудову архітектоніки печінки. Спостерігаються поліморфізми гепатоцитів, діаметр ядер зменшується, окремі ядра та цитоплазма лізовані. Дія сумарної дози 1,0 Гр ще більш виражена. Хронічне надходження в організм дослідних тварин кадмію приводить до більш значних дистрофічних змін паренхіми печінки, ніж лише дія іонізуючої радіації в умовах проведення досліджень. За сумісної дії іонізуючої радіації та іонів кадмію також виявлені суттєві порушення архітектоніки печінки. В той же час гістоструктура епітелію тонкого кишечника піддається менш вираженим змінам. За сумісної дії іонізуючого випромінювання та кадмію спостерігається збільшення висоти ентероцитів. Виявлене зменшення площі ядер ентероцитів свідчить, мабуть, про пригнічення функціональної активності ентероцитів слизової оболонки тонкого кишечнику при хронічній дії іонізуючої радіації та кадмію. Епітелій тонкого кишечнику відноситься до таких клітинних систем, які найбільш швидко оновлюються. Про порушення процесів диференціації ентероцитів свідчить встановлене зменшення кількості клітин у проліферативній зоні при дії як окремо, так і спільно іонізуючої радіації та кадмію (табл.1). Найбільші зміни відбуваються при сумісній дії іонізуючої радіації та кадмію.
Активність ферментів тонкого кишечника та печінки. В ентероцитах слизової оболонки тонкого кишечника та гепатоцитах присутні гідролази та трансферази, серед яких важливе значення мають лужна фосфатаза (ЛФ), g-глутамілтрансфераза (ГТТ) та аланіламінотрансфераза (АлАТ) [Becciolini, 1987]. Вплив на клітинні структури таких факторів оточуючого середовища, як іонізуюча радіація та важкі метали приводить до функціональних порушень мембранозв'язаних ферментних систем [Рискулова, 1986; Трахенберг, 1994]. Встановлено (табл. 2), що активність зазначених ферментів в клітинах епітелію тонкого кишечника знижується за умов дії всіх чинників у зазначені терміни проведення досліджень, але вірогідні зміни спостерігаються тільки у певних випадках. Так, іони кадмію викликали вірогідне зменшення тільки ГТТ ( в середньому на 15%) при тривалості досліду 145 діб. Дія іонізуючої радіації в дозі 0,6 Гр та 1,0 Гр викликала вірогідне зниження активності ЛФ в середньому на 16% та 17% відповідно, а ГТТ за цих умов — на 21% та 18,5%. В той же час сумісна дія іонізуючої радіації та іонів кадмію приводила до суттєвішого зниження активності всіх зазначених ферментів і у всі терміни досліджень.
Провідна роль у підтримці внутрішньоклітинного гомеостазу належить Na+, К+-АТФазі та Мg2+-АТФазі. Встановлено, що іонізуюча радіація викликала зменшення активності Na+, К+-АТФази в клітинах слизової оболонки тонкого кишечника в середньому на 23% при дозі опромінення 0,6 Гр та збільшення активності цього ферменту в 2,2 рази при опроміненні в дозі 1,0 Гр. Сумісна дія іонізуючої радіації та іонів кадмію за даних умов викликала підвищення активності Na+,К+-АТФази в середньому на 44% та 37% відповідно. Активність Мg2+-АТФази в препаратах слизової оболонки тонкого кишечника збільшувалося як при окремій дії іонізуючої радіації, так і
Таблиця 1
Загальна кількість клітин в крипті та мітотична активність стовбурних клітин крип дванадцятипалої та порожньої кишки за хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію (M±m, n=5-7)
Група тварин Мітотичний індекс
Дванадцятипала кишка Порожня кишка
Контроль на початок досліду 0,18±0,03 0,13±0,04
Тривалість досліду 42 доби:
контроль 0,19±0,04 0,12±0,03
CdCl2 0,18±0,03 0,14±0,04
г-опромінення (0,3 Гр) 0,30±0,04* 0,19±0,04*
г-опромінення (0,3 Гр) + CdCl2 0,15±0,03 0,07±0,02*
Тривалість досліду 84 доби:
контроль 0,18±0,03 0,13±0,04
CdCl2 0,19±0,04 0,08±0,03*
г-опромінення (0,6 Гр) 0,20±0,05 0,19±0,04*
г-опромінення (0,6 Гр) + CdCl2 0,17±0,04 0,21±0,03
Тривалість досліду 145 діб:
контроль 0,19±0,04 0,13±0,03
CdCl2 0,04±0,02* 0,05±0,02*
г-опромінення (1,0 Гр) 0,22±0,04 0,20±0,04*
г-опромінення (1,0 Гр) + CdCl2 0,24±0,05 0,22±0,04*
* p?0,05 по відношенню до контролю на початок досліду та у відповідних грах за тривалістю досліду
| 
