|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут молекулярної біології і генетики
УДК 57.085.23, 577.122.5, 577.217.535
Негруцький Борис Сергійович
Функціональна компартменталізація апарату білкового синтезу у вищих еукаріот
03.00.03 - молекулярна біологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ - 1999
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі механизмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України
Науковий консультант:
доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Єльська Г.В.
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, зав. відділом.
Офіційні опоненти:
докт.біол.наук, професор Виноградова Р.П., кафедра біохімії Київського університету ім. Т.Г.Шевченка, професор
докт.біол.наук, ст.н.сотр. Галкін А.П., завідувач відділу біоінженерії Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України
докт.біол.наук, ст.н.сотр. Козлов Е.О., провідний науковий співробітник відділу ензимології білкового синтезу Інституту молекулярної біології і генетики НАН України
Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м.Київ
Захист відбудеться “ 20 ” квітня 1999 року о 10-00 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, Київ-143, вул. Заболотного, 150
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Автореферат розісланий 13 березня 1999 року
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Лукаш Л.Л.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Біосинтез білка реалізує генетичну інформацію, закладену в ДНК, для забезпечення життєдіяльності клітини. Насьогодні стало очевидним значне ускладнення процесу білкового синтезу у вищих еукаріот в порівнянні з прокаріотами. Для підтримання ефективності трансляції в значно збільшених за об’ємом клітинах вищих еукаріот є необхідним якісно новий рівень організації, функціонування та регуляції активності трансляційного апарату. Наочним свідоцтвом на користь його існування може бути нерівномірний розподіл, або компартменталізація, компонентів білок-синтезуючого апарату в еукаріотичній клітині (Ryazanov et al, 1987). На час початку наших досліджень було отримано ряд непрямих доказів компартменталізації апарату трансляції, зокрема, виявлено спорідненість аміноацил-тРНК синтетаз до рибосом (Irvin et al, 1972, Ovchinnikov et al, 1978), утворення високомолекулярних комплексів аміноацил-тРНК синтетаз (Deutscher, 1984), співлокалізація різних компонентів апарату трансляції в еукаріотичних клітинах (Howe et al, 1984, Shestakova et al, 1993). Всі ці дані, хоча й свідчили на користь структурної, статичної компартменталізації білкового синтезу у вищих еукаріот, але не давали ніякої інформації про можливу функціональну роль цього явища.
Одним із основних проявів функціонального значення компартменталізації може бути ченелінг, або пряма передача проміжних продуктів даного метаболічного шляху від одного компонента системи до іншого без дисоціації в розчин (Srere, 1987). Відомо, що такий механізм має місце для деяких метаболічних процесів, проте експериментальних даних щодо його ролі в біосинтезі білка на час початку наших досліджень отримано не було (Спирин, 1989). Крім того, важливим свідоцтвом потенційного регуляторного значення компартменталізації може бути зміна внутрішньоклітинної локалізації компонентів трансляційного апарату в залежності від зовнішніх умов.
Отже, оскільки без з’ясування функціональної ролі компартменталізації неможливе побудування загальної моделі організації, функціонування та регуляції біосинтезу білка у вищих еукаріот, то детальна експериментальна і теоретична розробка концепції функціональної компартменталізації апарату трансляції є однією з найбільш актуальних фундаментальних проблем сучасної молекулярної біології білкового синтезу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (бюджетні теми № 2.2.4.9 “Вивчення стадії елонгації біосинтезу білка у еукаріот” та “Молекулярні основи компартменталізації білкового синтезу вищих еукаріот”). Робота виконувалась також при сприянні отриманих на конкурсних засадах вітчизняних та міжнародних проектів: № 5.2/130 “Компартменталізація як один з механизмів регуляції білкового синтезу” ДКНТ України, № 5.4/61 “Неканонічні взаємодії компонентів білок-синтезуючого апарату вищих еукаріот” і № 5.4/73 “Локалізація факторів елонгації трансляції у фібробластах людини. Вплив стану функціональної активності трансляційного апарату та фаз клітинного циклу” УФД Міністерства науки та технологій України, гранта INTAS № 96-1594 “the organization and regulation of EF-1α-mediated tRNA/aminoacyl-tRNA channeling in eukaryotic protein synthesis”, короткочасних грантів FEBS та EMBO.
Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було розробити та експериментально обгрунтувати концепцію функціональної компартменталізації апарату білкового синтезу, визначити важливість феномену компартменталізації для організації, функціонування та регуляції процесу трансляції в клітинах вищих еукаріот.
Виходячи з мети роботи, було сформульовано такі основні задачі:
- розробити методи перфорації цитоплазматичної мембрани клітин вищих еукаріот, які дозволяють зберегти високу активність пермеабілізованих клітин в трансляції;
n дослідити компартменталізацію та ченелінг аміноацил-тРНК безпосередньо в клітинах ссавців;
n визначити вплив фосфокреатину на локалізацію різних субодиниць фактора елонгації 1 (EF-1Н) у фібробластах людини;
n розробити методи отримання високоочищених препаратів фактора елонгації 1α (EF-1α), фенілаланіл-тРНК синтетази та комплексу валіл-тРНК синтетази з EF-1H і вивчити взаємодію EF-1α з різними аміноацил-тРНК синтетазами;
n дослідити неканонічний комплекс EF-1α*GDP*тРНК, зокрема визначити ділянки тРНК, які приймають участь у взаємодії із фактором, та можливість конформаційних змін компонентів комплексу.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше безпосередньо в клітинах ссавців показано компартменталізацію та ченелінг аміноацил-тРНК під час трансляції мРНК.
Експериментально доведено існування передбачуваної гіпотезою ченелінга тРНК/аміноацил-тРНК функціональної взаємодії аміноацил-тРНК синтетаз із EF-1α та показано різні шляхи її здійснення.
Вперше продемонстровано утворення неканонічного комплексу EF-1α*GDP*тРНК і запропонована функція такого комплексу, що полягає в транспортуванні тРНК від рибосоми до аміноацил-тРНК синтетази, а також показано формування четвертинного комплексу EF-1α*GDP*тРНК*аміноацил-тРНК синтетаза.
Показана можливість зміни внутрішньоклітинної локалізації компонентів апарату трансляції в залежності від зовнішніх умов, що свідчить про ймовірність існування нового рівня регуляції білкового синтезу за рахунок його компартменталізації - декомпартменталізації. Виявлено інгібіторний вплив неактивних конформерів тРНК, які утворюються в організмі за несприятливих умов, на трансляцію мРНК, що є новим свідоцтвом на користь їх участі в регуляції білкового синтезу в клітинах ссавців.
Вперше розроблено схему ченелінга тРНК/аміноацил-тРНК, яка детально описує різні варіанти передачі тРНК між компонентами апарату трансляції під час білкового синтезу. Зокрема, висунуто припущення про протилежно направлену дію комплексів EF-1α*GDP и EF-1α*GTP в перенесенні тРНК від рибосоми до аміноацил-тРНК синтетази та аміноацил-тРНК від синтетази до рибосоми відповідно.
Грунтуючись на отриманих даних, вперше представлено концепцію функціональної компартменталізації апарату білкового синтезу у вищих еукаріот та висунуто гіпотетичну модель структурно-функціональної організації трансляційного компартменту.
Теоретична та практична цінність одержаних результатів. Основним результатом виконання даної роботи стала розробка концепції функціональної компартменталізації трансляції у вищих еукаріот, що є істотним вкладом у розвиток теорії еукаріотичного білкового синтезу і має загальнобіологічне значення у розумінні фундаментальних основ життєдіяльності клітини. Результати досліджень широко цитуються міжнародною науковою спільнотою та створюють підгрунтя для подальших досліджень біосинтезу білка та ченелінга метаболітів. Отримані результати рекомендуються для використання в загальному курсі “Молекулярна біологія” та спецкурсі “Біосинтез білка” для студентів університетів зі спеціальності “біохімія” та “молекулярна біологія”. Отримані за розробленим нами методом препарати фактора елонгації 1α використовуються для вивчення різних аспектів білкового синтезу в групі фізики нуклеопротеїнів Інституту Білка, Пущіно, Росія, у відділі медичної біохімії Університету м.Лейден, Нідерланди, в Лабораторії молекулярної ензимології CNRS, Жіф-сюр-Івет, Франція, та в Центрі Здоров’я Університету Конектікута, Фармінгтон, США.
Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні та експериментальні ідеї, що розроблялися в дисертації, належать автору. Експерименти, що описані в розділах 3, 4 та 6, здійснено особисто автором. Один експеримент в роботі із пермеабілізованими клітинами виконано в тісному співробітництві з Р.Стапульонісом. У виконанні експериментів, що представлені в розділі 5, крім автора, приймали участь співробітники відділу механизмів трансляції генетичної інформації ІМБіГ НАНУ Т.В.Будкевич, З.М.Петрушенко і В.Ф.Шалак. Дослідження ендогенної флуоресценції EF-1α виконано в тісному співробітництві з О.С. Ладохіним. Отримані в співробітництві результати опубліковано як спільні наукові статті.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були оприлюднені на Школі-конференції “Структура и функция биополимеров”, Львів, 1988; VI Симпозіумі ”Macromolecules in functioning cell” USSR-Italy, Ленінград, 1988; Міжнародному симпозіумі “Regulation of translation”, Рига, 1989; 14 Робочій Нараді з тРНК, Познань, Польща, 1991; Дослідницькій Гордоновській конференції “Макромолекулярна організація та функція клітин”, Окснард, США, 1995; 16 Робочій Нараді з тРНК, Медісон, США, 1995; Міжнародній конференції “Frontiers in Translation”, Вікторія, Канада, 1995; 17 Робочій Нараді з тРНК, Шіба, Японія, 1997; 17 Міжнародному Конгресі з Біохімії та Молекулярної Біології, Сан-Франціско, США, 1997; Міжнародній конференції “Молекулярная генетика и биотехнология”, Мінськ, Бєларусь, 1998; Робочій нараді зі структури та функції аміноацил-тРНК синтетаз, Мітельвір, Франція, 1998.
Наукові результати доповідалися також на семінарах відділу механізмів трансляції генетичної інформації ІМБіГ НАН України, відділу біохімії Університету штату Конектікут, США, лабораторії медичної генетики Лейденського Університету, Нідерланди, Інституту молекулярної біології Університету Віттен-Хердеке, Німеччина, Лабораторії молекулярної ензимології CNRS, Франція, групи фізики нуклеопротеїнів Інституту Білка, Росія.
Публікації. Матеріали дисертаційної роботи в повному об’ємі надруковані в 27 публікаціях, з них 18 статей у вітчизняних та міжнародних фахових наукових виданнях.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення, загальних підсумків, висновків та списку літератури, який включає 371 посилання. Робота викладена на 336 сторінках машинописного тексту і містить 74 рисунки та 4 таблиці.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи. Клітини яєчника китайського хом’ячка (СНО) надано Д.Пактером (США). Первинну культуру фібробластів людини VH 25 (15-18 пасажі) була отримана від Я.Дейка (Нідерланди). тРНК з печінки кроля отримували прямою депротеїнізацією гомогената тканини фенолом та хроматографією на DEAE-целюлозі, як описано нами раніше (Негруцкий и др., 1985). 40S і 60S рибосомні субчастинки отримували, як описано нами раніше (Негруцкий, 1981). Аміноацил-тРНК в препаративній кількості була синтезована як описано (Yang et al, 1971). тРНКPhe и тРНКLeu були очищені з сумарної тРНК печінки кроля хроматографією в системі HPLC Gold на колонці Hypersil 5C4 (Beckman). 32P-мічення тРНК проводили згідно (Silberclang et al, 1977). Очищення EF-1α здійснювали за розробленим нами методом, який складається з таких етапів: гельфільтрація на сефакрилі S-400, хроматографія на DEAE-целюлозі та SP-сефарозі. Чистота препарату EF-1α становила більш ніж 90%. Препарат білка мав високу активність в обміні GDP/3H-GDP, каталізі зв’язування фенілаланіл-тРНК з полі(U)-запрограмованими рибосомами та синтезі полі(Рhe) на полі(U)-запрограмованих рибосомах. Очищення фенілаланіл-тРНК синтетази здійснювали згідно із запропонованою нами методикою фракціонуванням постмітохондріального супернатанту ПЕГ6000, хроматографією на гідроксіапатиті та фосфоцеллюлозі, гельфільтрацією на Sephacryl S-300. Чистота препарату фенілаланіл-тРНК синтетази становила більш ніж 80%, згідно електрофорезу в денатуруючих умовах. Очищення комплексу валіл-тРНК синтетази і EF-1H з печінки кролів проводили за такою схемою: фракціонування ПЕГ6000, гельфільтрація на BioGel A5m, хроматографія на тРНК-сефарозі та на аніонообміннику SourceQ. Дисоціацію компонентів комплексу під дією NaSCN та обмежений протеоліз цих компонентів проводили, як описано (Bec, 1989). Вплив EF-1α на каталітичну активність аміноацил-тРНК синтетаз вивчали в 100 мкл стандартної суміші для аміноацилювання тРНК (Bec et al, 1989) з додаванням 10% гліцерину та 100 мкМ GTP або GDP. До суміші вносили 5 - 50 пмоль EF-1α або контрольних білків. Вплив EF-1α на ATP/PPi обмін, який каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза, вивчали в 100 мкл суміші, що містила 100 мМ НЕРЕS рН 7.5, 5 мМ МgСl2, 1 мМ фенілаланін, 2.5 мМ АТР, 1мМ 32Р-РРі (100 Кі/моль), 1 мг/мл БСА, 0.5 мМ дітіотреітол, 10 % гліцерин.
Пермеабілізацію суспензії клітин СНО здійснювали 75 мкг/мл сапоніном, клітин VH 25 in situ – 125 мкг/мл сапоніном в оптимізованих для різних клітин умовах. Біосинтез білка в пермеабілізованих клітинах VH25 вивчали під час їх інкубації в суміші, що містила 130 мМ цукрозу, 50 мМ ацетат калію, 50 мМ KCl, 20 мМ HEPES, pH 7.4, 0.5 мМ DTT, 5 мМ ATP, 13 мМ фосфокреатин, 5 мМ глюкозу, 6 мМ ацетат магнію, 0.4 мМ GTP, 30 мкг/мл креатинкіназу, 240 мкM радіоактивну амінокислоту та решту немічених амінокислот, 240 мкM кожної, при 370C. Для клітин СНО кінцеві концентрації деяких реагентів були іншими, зокрема: 0.8 мМ ATP, 0.07 мМ GTP, 7.5 мМ фосфокреатин, 1.3 мМ ацетат магнію, суміш п’яти чи п’ятнадцяти 14С-амінокислот та решту немічених амінокислот, 250 мкМ кожна. Радіоактивність, що залишалась в ТХО-осаді після кип’ятіння, свідчила про кількість синтезованих поліпептидів, а різниця між радіоактивністю осадів, що були отримані обробкою гарячою та холодною ТХО, вказувала на кількість аміноацил-тРНК в інкубаційній суміші. Трансляцію полі(U) та глобінової мРНК в білоксинтезуючій системі із зародків пшениці та ендогенний білковий синтез в лізаті ретикулоцитів кроля проводили як описано (Клеменс, 1987).
РНКаза А з підшлункової залози бика та тРНК були модифіковані відповідно ФІТЦ та флуоресцеїнсемікарбазидом згідно раніше описаних методик (Melan et al, 1992). З метою флуоресцентної модифікації EF-1α та EF-1δ діалізували проти 100 мМ карбонатного буфера, pH 8. 3, 50 мМ NaCl, 20% гліцерину та інкубували в присутності ФІТЦ (0.1 мг/мл). Мічення зупиняли NH4Cl (кінцева концентрація 50 мМ), і білки відокремлювали від ФІТЦ хроматографією на сефадексі G-25. Внутрішньоклітинну флюоресценцію вивчали на живих або фіксованих 3.7% формальдегідом клітинах, використовуючи конфокальний мікроскоп Bio-Rad MRC-600 або світловий мікроскоп, обладнаний для реєстрації флуоресценції.
Флуоресценцію триптофанілових залишків в молекулі EF-1α вимірювали на спектрофлуориметрі SLM-8100 (SLM/Aminco) при довжині хвилі збудження 297 нм із шириною щілини 2 нм для збуджуючого променя і 8 нм для променя, що випускається. Узагальнені спектри емісії були отримані для 10-30 вимірювань від 310 до 500 нм з інтервалом в 1 нм. Обмежений РНКазний гідроліз та модифікацію тРНК етилнітрозосечовиною проводили, як описано раніше (Boutorin et al., 1981, Jekowsky et al., 1977, Петрушенко и др, 1990). Утворення четвертинного комплексу EF-1α-GDP-тРНКPhe-фенілаланіл-тРНК синтетаза перевіряли в 0.7% агарозному гелі, спостерігаючи за затримкою 32Р-тРНКPhe в гелі внаслідок взаємодії з білкoм.
Компартменталізація та ченелінг аміноацил-тРНК в клітинах ссавців. На першому етапі досліджень функціональної компартменталізації ми вважали за необхідне довести принципову можливість ченелінга аміноацил-тРНК безпосередньо в клітинах ссавців. Для досягнення цієї мети потрібно було розробити спосіб доставки аміноацил-тРНК до цитоплазми, оскільки за нормальних умов тРНК не здатна проходити крізь клітинну мембрану. При цьому було абсолютно необхідно дотримуватися двох умов: забезпечити вільний доступ екзогенних макромолекул до клітини та максимально зберегти при цьому інтактність організації її білок-синтезуючого апарату.
Для перфорації цитоплазматичної мембрани клітин СНО було обрано два методи – електропорацію та обробку детергентами, зокрема сапоніном. Пермеабілізація сапоніном виявилася більш м’якою процедурою, яка не ушкоджувала внутрішньоклітинну організацію апарату білкового синтезу. В таблиці 1 наведено дані типового експерименту по визначенню розподілу РНК та білка в клітинах СНО, що інкубувалися в присутності 3Н-уридину або суміші 3Н-амінокислот, між пермеабілізованими клітинами та міжклітинним простором. З таблиці 1 видно, що обробка сапоніном призводить до незначного зменшення
Таблиця 1.
Вихід пресинтезованих 3Н-РНК та 3Н-білка з пермеабілізованих клітин СНО.
кількості інтактних клітин, причому кількість РНК та білків, що вивільнились із пермеабілізованих клітин, приблизно дорівнює кількості зруйнованих клітин. Таким чином, деяка популяція клітин (близько 20%) є чутливою до сапоніну та руйнується під час пермеабілізації, вивільняючи свою РНК та білок назовні, в супернатант, але решта клітин, незважаючи на перфорованість їх мембран, зберігають РНК та білок. Слід підкреслити, що внутрішній об’єм таких клітин є цілком доступним екзогенним макромолекулам, які швидко та рівномірно розподілялися в цитоплазмі пермеабілізованих клітин. Останнє було доведено конфокальною мікроскопією клітин, до яких було додано флуоресцентно модифіковані тРНК або РНКазу А. Таким чином, отримані дані свідчать про принципову можливість компартменталізації РНК та білків в клітинах ссавців. Але наскільки активними в трансляції мРНК є пермеабілізовані за запропонованою методикою клітини? Для відповіді необхідно порівняти швидкість білкового синтезу в пермеабілізованих та інтактних клітинах. Після оптимізації концентрацій низькомолекулярних компонентів білок-синтезуючого апарату в пермеабілізованих клітинах було досягнуто практично ідентичну з інтактними клітинами швидкість трансляції на протязі щонайменш 30 хвилин (рис. 1). Таким чином, вперше було створено систему сполученої пермеабілізації-трансляції в клітинах ссавців, яку можна використовувати для вивчення структурно-функціональної організації апарату білкового синтезу in vivo. Досягнення високої ефективності білкового синтезу свідчить про максимальне збереження інтактності апарату трансляції в пермеабілізованих клітинах. Це також підтверджує низький рівень виходу з них макромолекул білкової та рибонуклеїнової природи (див. табл. 1). Але відкритим залишалося питання, чи здатні низькомолекулярні кофактори трансляції вільно дисоціювати із перфорованих клітин? Для перевірки можливості компартменталізації низькомолекулярних сполук, які беруть участь у трансляції, було вивчено їх вплив на ефективність біосинтезу білка в пермеабілізованих клітинах СНО. Дані типового експерименту наведено в табл. 2. Видно, що вилучення АТР або АТР разом з GTP
Рис. 1. Включення 14С-амінокислот до ТХО-нерозчинного осаду в пермеабілізованих сапоніном (1) або інтактних (2) клітинах СНО. Наведено включення мітки в 9.4*107 інтактних або пермеабілізованих клітин.
Таблиця 2.
Важливість низькомолекулярних сполук та креатинкінази для білкового синтезу в пермеабілізованих клітинах СНО.
із суміші для білкового синтезу, в якій проводили інкубацію клітин, зменшувало швидкість білкового синтезу лише наполовину. Відсутність екзогенного GTP зовсім не впливала на трансляцію. Не спостерігалось значного ефекту і при відсутності екзогенної креатинкінази. Кардинальний позитивний вплив на білковий синтез мала лише присутність екзогенного фосфокреатину. Можна зробити висновок, що вся АТР, що залишається в клітинах після пермеабілізації, швидко утилізується, але може бути ефективно регенерована в присутності екзогенного фосфокреатину. Відсутність істотної залежності від екзогенних фосфокреатинкінази та GTP може свідчити про входження до трансляційного компартменту ферментів, які не мають прямого відношення до трансляції – креатинкінази та нуклеозиддифосфокінази. Цікаво, що за відсутності екзогенних амінокислот та в умовах значного розбавлення клітинного вмісту в пермеабілізованих клітинах швидкість білкового синтезу падала тільки удвічі. Це свідчить на користь компартменталізації амінокислот у клітинах ссавців [Smith et al., 1988, Samarel et al., 1991]. Також цікавим є отриманий результат, що додавання надлишку тРНК (до 1 мг/мл) до пермеабілізованних клітин ніяк не впливає на білковий синтез. Ці дані та відсутність дисоціації РНК з пермеабілізованих клітин (див табл.1) були першими, що свідчать про можливукомпартменталізацію тРНК в клітинах ссавців. Виявлена нами відсутність істотної різниці в спектрах білків, що були синтезовані в пермеабілізованих та інтактних клітинах, свідчить, що мРНК теж можуть залишатися імобілізованими в перфорованих клітинах. Таким чином, система білкового синтезу в пермеабілізованих клітинах як кількісно, так і якісно відповідає білковому синтезу в інтактних клітинах. Тому така система може бути використана для вирішення одного з основних завдань роботи - доказу компартменталізації та ченелінга аміноацил-тРНК in vivo.
Якщо аміноацил-тРНК дійсно компартменталізована в клітинах СНО, вона не повинна виходити із клітин і після іх пермеабілізації. Тому вивчаючи розподіл аміноацил-тРНК між внутрішньоклітинним та позаклітинним об’ємами, можна підтвердити чи спростувати існування такої компартменталізації. Отже, суміш 15 14С-амінокислот та відповідних 3Н-аміноацил-тРНК була додана до пермеабілізованих клітин. Центрифугуванням аліквот клітин через певні часові інтервали було визначено відносну кількість екзогенної (3Н) аміноацил-тРНК, яка слугувала за внутрішній контроль, та ендогенно синтезованої (14С) аміноацил-тРНК у клітинній фракції та в супернатанті (рис.2). Виявилося, що розподіл ендогенної та екзогенної аміноацил-тРНК між цими двома фракціями дуже відрізняється. Для екзогенної аміноацил-тРНК співвідношення її кількості усередині та поза клітинами було еквівалентне співвідношенню клітинного та позаклітинного об’ємів (приблизно 0.2), що свідчило про безперешкодний обмін екзогенної аміноацил-тРНК між позаклітинним та внутрішньоклітинним просторами. Навпаки, у випадку ендогенної аміноацил-тРНК спостерігалася її затримка (в наведеному експерименті більш ніж в 25 разів в порівнянні з екзогенною аміноацил-тРНК) та наступна дуже повільна дисоціація із пермеабілізованих клітин.
Ще одним критерієм компартменталізації ендогенної аміноацил-тРНК може бути її стійкість до дії доданої до пермеабілізованих клітин РНКази. Схема експерименту була такою ж - 3Н-аміноацил-тРНК додавали екзогенно, а 14С-аміноацил-тРНК синтезувалася безпосередньо в клітинах. Вплив РНКази А на екзогенну та ендогенну аміноацил-тРНК наведено на рис.3. Видно, що 3Н-радіоактивність швидко зникає при РНКазній обробці,
Рис.2 Співвідношення внутрішньоклітинної та позаклітинної аміноацил-тРНК після інкубації пермеабілізованих клітин СНО із сумішшю 14С-амінокислот (1) та відповідних 3Н-аміноацил-тРНК (2). 3 – співвідношення клітинного та зовнішнього об’ємів в даному експерименті.
Рис.3. Вплив РНКази А на ендогенну (1) та екзогенну (2) аміноацил-тРНК в пермеабілізованих клітинах СНО, а також на ендогенну аміноацил-тРНК (3) в гомогенаті клітин. 100% для кожного випадка - кількість аміноацил-тРНК за відсутності РНКази.
вказуючи на повну доступність для РНКази екзогенної аміноацил-РНК. В той же час ендогенна 14С-аміноацил-тРНК захищена від дії РНКази. Слід підкреслити, що низька ефективність РНКазного гідролізу 14С-аміноацил-тРНКне є наслідком утрудненого доступу РНКази А до пермеабілізованих клітин, бо, як згадувалося вище, флуоресцентно модифікована РНКаза А має необмежений доступ до таких клітин і розподіляється усередині клітини досить рівномірно. Більш того, якщо пермеабілізовані клітини, що містять ендогенну та екзогенну аміноацил-тРНК, гомогенізувати перед обробкою нуклеазою, то не спостерігається ніякої різниці у рівні гідролізу обох видів аміноацил-тРНК (рис.3, крива 3).
Таким чином, в описаних вище експериментах ми одержали перші суттєві докази компартменталізації аміноацил-тРНК в клітинах ссавців. Але залишалось невідомим, чи існує зв’язок між компартменталізацією апарату трансляції та ефективністю білкового синтезу. Інакше кажучи, потрібно було визначити можливе функціональне значення компартменталізації аміноацил-тРНК. Серед потенційних механізмів, що реалізують перевагу компартменталізації, чільне місце займає ченелінг, або безпосередній, без виходу в розчин, транспорт проміжних продуктів між послідовними учасниками конкретного метаболічного шляху (Srere, 1987, Спирин, 1989). Головним критерієм існування ченелінга метаболітів є неможливість залучення до метаболічного ланцюга пресинтезованих екзогенно проміжних продуктів цих реакцій, тому що, згідно визначенню, каналізований процесс є закритим до останніх (Srivastava et al, 1987). Оскільки проміжна сполука біосинтезу білка – аміноацил-тРНК, то, порівнявши рівень використання для білкового синтезу ендогенної та екзогенної аміноацил-тРНК, можна зробити висновок відносно ченелінга цього метаболіту в клітинах ссавців. Переважне використання ендогенної, синтезованої безпосередньо в клітинах аміноацил-тРНК було б прямим позитивним свідченням щодо існування механізму ченелінга в білковому синтезі.
Для перевірки цього положення знов були використані експерименти із подвійним міченням, в яких ендогенно синтезована аміноацил-тРНК була 14С-міченою, а пресинтезована екзогенна аміноацил-тРНК - 3Н-міченою. В клітинному екстракті не було виявлено переваги жодної аміноацил-тРНК у використанні для білкового синтезу. Це свідчило про відсутність ченелінга ендогенної аміноацил-тРНК в безклітинній білок-синтезуючий системі. Але неможливість продемонструвати ченелінг in vitro ще не свідчить про відсутність цього механізму безпосередньо в клітинах. Цілком можливо, що для функціонування механізму ченелінга необхідна інтактна організація білок-синтезуючого апарату, яку може бути зруйновано під час гомогенізації клітин. Як показано вище, розроблена нами система пермеабілізації-трансляції залишає апарат білкового синтезу майже недоторканим. Беручи це до уваги, аналогічні експерименти було проведено в пермеабілізованих клітинах. 3Н-аміноацил-тРНК та 14С-амінокислоти було добавлено безпосередньо до пермеабілізованих клітин, і включення кожної мітки до поліпептидного ланцюга порівнювали із рівнем відповідної аміноацил-тРНК в клітинах на той же час. Співвідношення цих параметрів було показником ефективності використання екзогенної та ендогенної аміноацил-тРНК. Як видно з рис.4, показники ефективності використання аміноацил-тРНК дуже відрізняються для ендогенного та екзогенного попереднього продуктів. 14С-ізотоп утилізується в 15 разів більш ефективно ніж 3Н-ізотоп, тобто ендогенна аміноацил-тРНК є набагато більш ефективним проміжним продуктом для біосинтезу білка, ніж екзогенна. Аналогічні результати було отримано в системі електропорованих клітин СНО. Необхідно зауважити, що переважне використання ендогенної аміноацил-тРНК спостерігалося незважаючи на те, що, згідно з даними конфокальної мікроскопії, екзогенна
Рис. 4. Білковий синтез в пермеабілізованих сапоніном клітинах СНО з використанням ендогенних (А) та екзогенних (Б) аміноацил-тРНК. 1 – включення мітки до аміноацил-тРНК, 2 – включення мітки до поліпептидних ланцюгів. Кількість клітин в даному експерименті – 3.8*106.
тРНК швидко потрапляє до пермеабілізованих клітин і розподіляється в них досить рівномірно.
Отже, показано, що обидва критерія ченелінга - утрудненість використання екзогенного проміжного продукту, так само як і структурна відокремленість ендогенного попередника, виконуються під час біосинтезу білка в клітинах ссавців. Таким чином, отримано перші експериментальні дані, які свідчать про існування функціональної компартменталізації аміноацил-тРНК. Ченелінг ендогенної аміноацил-тРНК призводить до ефективного, на відміну від екзогенної аміноацил-тРНК, її використання. На базі даних, що викладено в даному розділі, та беручі до уваги відому до початку наших досліджень схему цикла елонгації стало можливим уявити гіпотетичний цикл ченелінга аміноацил-тРНК та тРНК під час трансляції (рис.5). У такому циклі аміноацил-тРНК передається від аміноацил-тРНК синтетази до фактора елонгації EF-1α і далі на рибосому без виходу до розчина. Оскільки експерименти на клітинному рівні не дозволяли судити про можливого посередника в передачі тРНК від рибосоми до аміноацил-тРНК синтетази, умовно було позначено, що тРНК передається з рибосоми прямо до аміноацил-тРНК синтетази. Запропоновано, що ченелінг аміноацил-тРНК від білка до білка відбувається в спеціальних трансляційних компартментах, організація яких руйнується при гомогенізації.
Локалізація фактора елонгації 1 в фібробластах людини. Ефект функціональної активності апарату трансляції. Наступним завданням було отримати більш докладну інформацію про існування трансляційних компартментів та можливість змін в їх організації за різних умов функціонування клітини. Було зроблено
Рис.5 Гіпотетична схема ченелінга аміноацил-тРНК під час елонгації еукаріотичного білкового синтезу. АРС – аміноацил-тРНК синтетаза, А, Р, та Е – сайти зв’язування тРНК на рибосомі, чорні круги позначають аміноацил-тРНК, сірі круги – пептидил- або деацильовану тРНК
припущення, що продемонструвати потенційну лабільність трансляційних компартментів можливо за різних енергетичних станів
клітини, що супроводжуються змінами трансляційної активності. Як маркери було використано білки, що є найбільш ймовірними компонентами таких компартментів - α і δ субодиниці фактора елонгації EF-1. Завданням даного етапу досліджень було з’ясувати, чи змінюється, і яким чином, внутрішньоклітинна локалізація EF-1α и EF-1δ в залежності від вмісту фосфокреатину, відсутність якого в інкубаційній суміші, як показано нами вище, спричиняє повну зупинку білкового синтезу в пермеабілізованих клітинах (див. табл.2).
Оскільки експерименти з вивчення локалізації білків краще проводити на імобілізованих на поверхні клітинах, як модель була вибрана первинна культура фібробластів людини VH25, які росли прикріпленими до поверхні чашок Петрі. Після адаптації методу пермеабілізації, розробленого нами раніше для суспензії клітин СНО, до фібробластів людини, було показано, що швидкість трансляції в пермеабілізованих фібробластах була лінійною на протязі 15-20 хвилин. Цього часу було цілком достатньо для проведення експериментів з вивчення локалізації білків в присутності або за відсутності фосфокреатину.
В цій роботі застосовано методичний підхід для вивчення внутрішньоклітинної локалізації компонентів апарату трансляції, який дещо відрізняється від стандартних імунофлуоресцентних досліджень. Використання розробленої нами системи пермеабілізованих клітин дає змогу легко маніпулювати білковими компонентами апарату трансляції, тобто додавати модифіковані флуоресцеінізотіоціанатом EF-1α та EF-1δ безпосередньо до клітин, які знаходяться в тому чи іншому функціональному стані, та вивчати внутрішньоклітинну локалізацію цих білків безпосередньо під час активної трансляції, або коли її зупинено. Виявлено, що в нормі розподіл EF-1α в фібробластах людини є більш гранулярним, ніж розподіл цього білку в клітинах, інкубованих без фосфокреатину (рис.6 а,б). Цікавим виявився факт наявності EF-1α в клітинному ядрі, особливо за відсутності фосфокреатину, коли переважна більшість молекул цього білку має ядерну локалізацію. На відміну від EF-1α, локалізація EF-1δ не залежить від присутності фосфокреатину в інкубаційній суміші (рис.6 в,г). В обох випадках спостерігається чітко виражена гранулярна картина розподілу цієї субодиниці фактора елонгації в цитоплазмі. Таким чином, дискретна цитоплазматична локалізація в присутності фосфокреатину була притаманна обом білкам, в той час коли виключення фосфокреатину із інкубаційної суміші призводило до перерозподілу EF-1α, але не змінювало локалізацію EF-1δ.
Слід визначити, що для зменшення неспеціфічних ефектів усі експерименти з флуоресцентно модифікованими субодиницями EF-1 проводилися в присутності високої концентрації (6 мг/мл) овальбуміну. Для перевірки функціонального значення зміни локалізації EF-1α було вивчено розподіл в клітині флуоресцентно модифікованого інактивованого EF-1α. Виявлено, що інактивація EF-1α призводила до зменшення кількості цього білка в цитоплазмі і до нагромадження його у ядрі (рис.6д), причому ця картина спостерігалася за умов інкубації клітин у повній, включаючи фосфокреатин, суміші для білкового синтезу. Отже, внутрішньоклітинна локалізація неактивного EF-1α при активному білковому синтезі була подібною до локалізації активного EF-1α за умов, коли білок-синтезуючий апарат практично не функціонує. На базі цих даних можна зробити припущення, що коли EF-1α не приймає участі в трансляції, більша частина його молекул знаходиться у клітинному ядрі. За умов повного збереження функціональної активності системи трансляції, локалізація EF-1α та EF-1δ подібна та має дещо гранулярний характер. Треба відзначити, що гранулярний розподіл EF-1δ у фібробластах людини був нещодавно підтверджений імунофлуоресцентним методом (Sanders et al., 1996). Картина дискретної локалізації субодиниць фактора елонгації EF-1 є подібною до розподілу в олігодендроцитах зерен, які містили мРНК, рРНК, EF-1α та аргініл-тРНК синтетазу (Barbarese et al., 1995). Такі зерна-гранули можуть являти собою трансляційні компартменти, які функціонують в цитоплазмі нервових клітин. Нами встановлено, що надходження такого важливого компоненту апарату трансляції як EF-1α до запропонованих трансляційних компартментів може залежати від ефективності процесу білкового синтезу в клітині (рис.6). Ці дані є
Рис.6 Локалізація флуоресцентно модифікованих EF-1α (А,Б), EF-1δ (В,Г) та інактивованого EF-1α (Д) в пермеабілізованих фібробластах людини, що були інкубовані в суміші для білкового синтезу в присутності (А,В,Д) або без (Б,Г) фосфокреатину.
першими, що свідчать про можливість енергетично-залежної зміни локалізації компонентів апарату трансляції в еукаріотичній клітині.
Беручи за основу модель функціонування комплексу EF-1H (Janssen et al, 1994) можна інтерпретувати одержані нами дані таким чином: EF-1δ є частиною стаціонарного комплексу EF- 1βγδ,ассоційованого із клітинними структурами, EF-1α перебуває в цьому комплексі лише під час GDP/GTP обміну на його молекулі. Внутрішньоклітинна концентрація EF-1α принаймні на порядок перевищує концентрацію EF-1βγδ. Тому при активному білковому синтезі спостерігається подібна локалізація EF-1α та EF-1δ, а при зупинці трансляції відбувається зміна локалізації EF-1α, але не EF-1δ, який залишається імобілізованим на клітинних структурах.
Цікавим є факт локалізації EF-1α в клітинному ядрі. Ці дані були незалежно підтверджені методами імунофлуоресценції та імуноелектронної мікроскопії (Sanders et al, 1996, Barbarese et al., 1995). Ядерна локалізація EF-1α може бути проявом виконання цією молекулою деяких неканонічних функцій, зокрема запропонованою нами участі EF-1α в транспорті щойно синтезованих тРНК з ядра до трансляційних компартментів у цитоплазмі.
Отже, вперше встановлено можливість зміни локалізації компонентів апарату трансляції у відповідь на негативні впливи, зокрема на енергетичну недостатність. Цілком можливо, що перерозподіл молекул EF-1α в залежності від фосфокреатину відзеркалює загальні зміни в структурі лабільних, не зв’язаних тривало із клітинними структурами компонентів трансляційних компартментів. Відсутність змін локалізації EF-1δ свідчить про те, що комплекс EF-1βγδ може бути одним з базових компонентів таких компартментів, які забезпечують “прив’язування” компартментів до конкретного місця синтезу того чи іншого білка. Крім того, ці результати свідчать на користь існування нового рівня регуляції білкового синтезу, який може здійснюватися шляхом асоціації/дисоціації трансляційних компартментів.
Одним із компонентів такої регуляторної системи можуть бути біологічно неактивні конформери тРНК, які з’являються в організмі за несприятливих умов (Мацука и др., 1972). Раніше ми показали, що такі конформери здатні утворювати стабільний непродуктивний комплекс з аміноацил-тРНК синтетазами та рибосомами (Негруцкий и др., 1984, Негруцкий и др., 1986), і висунули припущення, що це може мати певне регуляторне значення. В дисертації продемонстровано, що присутність неактивних конформерів тРНК впливає на трансляцію природних мРНК in vitro, тобто показано принципову можливість регуляторного впливу неактивних конформерів тРНК на трансляцію. Формування стабільних непродуктивних комплексів тРНК з іншими компонентами апарату трансляції може призводити до порушення механізму їх входу до трансляційного компартменту або навіть до розпаду такого компартменту. Чи дійсно такий механізм функціонує у клітинах ссавців, має бути перевірено в подальших дослідженнях.
Взаємодія макромолекул під час ченелінга тРНК в процесі трансляції у еукаріот. Таким чином, в експериментах, проведених з клітинами, отримано ряд даних, що підтверджують можливість існування в них трансляційних компартментів, які забезпечують функціонування механізму ченелінга та обмежують доступ всередину екзогенних аміноацил-тРНК. Крім того, показано, що відсутність таких макроергів як фосфокреатин в клітині може призводити до розпаду компартментів чи, принаймні, до виходу з них окремих компонентів апарату трансляції. Слід відзначити, що недоліком експериментів in vivo є те, що вони здатні вирішити проблему лише в загальному плані, тобто підтвердити можливість ченелінга аміноацил-тРНК в клітинах, але не дають інформацію про детальний механізм ченелінга. Тому було необхідним змоделювати ці взаємодії в дослідах in vitro, вивчаючи можливість асоціації ізольованих компонентів апарату трансляції, що мають спорідненість до тРНК. Оскільки основне місце в ланцюзі ченелінга займає гіпотетичне перенесення аміноацил-тРНК від аміноацил-тРНК синтетази до EF-1α, і ніякої інформації про асоціацію цих двох білків до початку наших досліджень не існувало, ми вважали за доцільне з’ясувати принципову можливість такої взаємодії в дослідах in vitro, на рівні індивідуальних білків.
З точки зору гіпотези ченелінга найбільш придатним для вивчення цього механізму здається стабільний комплекс EF-1H з валіл-тРНК синтетазою, який містить EF-1α, білки, що каталізують GDP/GTP обмін в його молекулі, та аміноацил-тРНК синтетазу. Раніше було виявлено, що кінетичні параметри реакції аміноацилювання не залежать від асоціаціі валіл-тРНК синтетази з EF-1H і практично однакові для вільної та зв’язаної з EF-1H синтетази (Bec et al, 1989). Проте, згідно з гіпотезою ченелінга, що передбачає участь EF-1α в дисоціації аміноацил-тРНК з аміноацил-тРНК синтетази, така дисоціація повинна проходити при формуванні потрійного комплексу валіл-тРНК*EF-1α*GTP. Із цього випливає, що для виявлення якогось ефекту кількість молекул EF-1α в інкубаційній суміші повинна дорівнювати кількості молекул продукта реакції, аміноацил-тРНК, а не кількості молекул ферменту, як спостерігається в комплексі валіл-тРНК синтетаза-EF-1H. Надлишок EF-1α потрібен, щоб забезпечити можливість постійного відтоку аміноацил-тРНК від валіл-тРНК синтетази. Швидкість синтезу валіл-тРНК в присутності надлишку EF-1α та GTP наведено на рис.7. Дійсно, у цьому випадку спостерігається двократне прискорення реакції. Цікаво, що форма кінетичної кривої – двофазова. Швидкість синтезу валіл-тРНК зменшується з 2.5 пмоль/хв в першій фазі до 1.8 пмоль/хв у другій. При відсутності надлишку EF-1α швидкість синтезу валіл-тРНК становила 1.25 пмоль/хв.
При заміні GTP на GDP стимуляції валіл-тРНК синтетазної активності фактором не спостерігалося (рис.8), що підтверджує можливість участі класичного потрійного комплексу EF-1α*GTP*аміноацил-тРНК в механізмі стимуляції. Дія GMPPNP - аналога GTP, що не гідролізується, була аналогічною, хоч і меншою по амплітуді, ніж дія GTP. Зменшення стимуляції валіл-тРНК синтетази в присутності аналога GTP можна пояснити зниженням здатності βγδ субодиниць EF-1H каталізувати формування EF-1α-GTP внаслідок утворення відносно стабільного комплексу EF-1βγδ*GMPPNP, який виводить частину молекул EF-1H
Рис.7 Швидкість синтезу 14С-валіл-тРНК валіл-тРНК синтетазою в комплексі з EF-1H в присутності (1) чи без (2) EF-1α. Концентрація фермента в пробі - 0.6 нМ. 50 пмоль EF-1α містилося в 100 мкл інкубаційної суміші.
Рис.8 Активність валіл-тРНК синтетази в комплексі з EF-1H в присутності EF-1α (50 пмоль/100 мкл суміші) та GTP (1), GMPPNP (2) або GDP (3). (4) - активність фермента в присутності GMPPNP без EF-1α. Концентрація валіл-тРНК синтетази 2.1 нМ. Концентрації нуклеотидів: 100 мкМ GTP, 140 мкМ GMPPNP, 100 мкМ GDP.
з реакції (Janssen et al, 1988). Ці дані були підтверджені в наших експериментах.
Специфічність ефекту EF-1α була перевірена заміною у вищеописаній системі еукаріотичного фактора EF-1α на прокаріотичний EF-Tu. Оскільки, як виявилося, EF-1βγδ не прискорює обмін нуклеотидів в молекулі EF-Tu, спеціальну увагу було приділено переведенню EF-Tu в GTP-зв’язану форму, використовуючи фосфоенолпіруват та його кіназу. Виявилося, що EF-Tu-GTP не впливає на активність валіл-тРНК синтетази навіть у концентрації, що була в чотири рази більше за концентрацію EF-1α в аналогічному експерименті (рис.9). Отже, просто спорідненості до аміноацил-тРНК виявилося недостатньо для активації валіл-тРНК синтетази.
Одним із факторов, що має вплив на стимуляторний ефект EF-1α, виявився ступінь збагачення сумарного препарату тРНК валіновою тРНК. При порівнянні препаратів тРНК, які містили 2.5% або 20,4% тРНКVal, виявилося, що активація валіл-тРНК синтетази фактором елонгації спостерігається тільки при використанні збагаченого по тРНКVal препарату сумарної тРНК (рис.10). Ми пояснюємо це явище 10-кратним зменшенням (з 22000 до 2500 пмоль на точку прямої) кількості деацильованої тРНК в збагаченому препараті. Якщо EF-1α здатний формувати неканонічний комлекс з деацильованою тРНК (про що буде сказано нижче), її значний надлишок в порівнянні з аміноацил-тРНК в системі призводить до того, що майже всі молекули фактора перебувають в комплексі з деацильованою тРНК, тобто не здатні впливати на активність валіл-тРНК синтетази за
|
