|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Онойко Олена Борисівна
УДК 577.1: 577.152.3
ФОТОСИНТЕТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ ЕЛЕКТРОННОГО
ТРАНСПОРТУ В ХЛОРОПЛАСТАХ ВИЩИХ РОСЛИН
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі мембранології та фітохімії
Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України
Науковий керівник: доктор біологічних наук,
академік НАН України
Ситник Костянтин Меркурійович,
Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України,
головний науковий співробітник
відділу фітогормонології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Палладіна Тетяна Олександрівна,
Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України,
провідний науковий співробітник
відділу клітинної біології та анатомії
кандидат біологічних наук
Воловик Ольга Гнатівна,
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
старший науковий співробітник
відділу фізіології та екології фотосинтезу
Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії
НАН України, м.Київ
Захист відбудеться 17 квітня 2006 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова, 2,
корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58
Автореферат розісланий 15 березня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Андрійчук Т.Р.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Фотосинтез – найважливіший природний процес, завдяки якому відбувається запасання світлової енергії в хімічних зв'язках ATФ і НАДФH, що надалі використовуються у циклі Кальвіна для синтезу органічних речовин із вуглекислого газу та води. Утворення первинних високоенергетичних сполук ATФ і НАДФH здійснюється в системі тилакоїдних мембран хлоропластів у процесі фотохімічних редокс-перетворень компонентів електронтранспортного ланцюга (ЕТЛ). Ці процеси пов'язані з перенесенням електронів від води по ланцюгу мембранних переносників до НАДФ+ (нециклічний транспорт електронів), у якому беруть участь дві фотохімічно активні фотосистеми II і I (ФС II і ФС I). АТФ утворюється в реакції фотофосфорилювання при роботі ферментного комплексу – АТФ-синтази. Значний внесок у вивчення структури та функціонування фотосинтетичного апарату рослин зробили, зокрема, українські вчені (Островская, 1982; Ясников и др., 1989).
Згідно теорії Мітчела (Mitchell, 1966), універсальним інтермедіатом, що регулює швидкість транспорту електронів і синтезу АТФ, є трансмембранна різниця електрохімічних потенціалів іонів водню (Н+). Ступінь спряженості між цими процесами визначається за допомогою фотосинтетичного контролю (ФК), який є відношенням швидкості перенесення електронів по ЕТЛ за умов максимального фотофосфорилювання до швидкості перенесення електронів за відсутності синтезу АТФ (Тихонов, 1999). Чим більшою є величина ФК, тим вищою є спряженість транспорту електронів із синтезом АТФ. В ізольованих хлоропластах фотосинтетичний контроль виявляється в тому, що у присутності субстратів фотофосфорилювання (АДФ + Фн) відбувається прискорення швидкості електронного транспорту, а в присутності продукту (АТФ) – її уповільнення.
Ключову роль у ФК відіграють процеси протонного транспорту: прискорення швидкості перенесення електронів по ЕТЛ у присутності АДФ і Фн пов'язано зі зменшенням величини рН в результаті активації спряженого з фотофосфорилюванням виходу протонів із енергізованих тилакоїдів через АТФ-синтазний комплекс (Portis et al., 1976; Graber et al., 1981), тоді як індуковане АТФ уповільнення швидкості транспорту електронів – із пригніченням витоку протонів через цей комплекс (McCarty et al., 1971). Таким чином, швидкість електронного транспорту в тилакоїдних мембранах контролюється величиною pH.
АТФ-синтаза хлоропластів (АТФ-фосфогідролаза, КФ 3.6.1.3) безпосередньо здійснює перетворення електрохімічної енергії протонного градієнта в енергію макроергічних зв'язків АТФ. Фермент являє собою мультисубодиничний білковий комплекс CF0CF1, що складається з інтегрованого у мембрану фактора CF0, який включає протонний канал, і зовнішньої каталітичної частини CF1, яка є місцем локалізації центрів, що зв'язують нуклеотиди (Senior et al., 2002).
Розрізняють два можливі шляхи виходу протонів через АТФ-синтазний комплекс: фосфорилюючий (пов'язаний із синтезом АТФ) і нефосфорилюючий (Underwood et al., 1980). Умови, що контролюють участь цих шляхів у процесі фотосинтетичної енерготрансформації, вимагають подальшого вивчення.
Н+–АТФ-аза хлоропластів, що репрезентована комплексом CF0CF1, може каталізувати як АТФ-синтазну реакцію, так і реакцію гідролізу АТФ, виконуючи функцію АТФ-синтази або АТФ-гідролази. Її гідролазна активність зазвичай знаходиться в латентній формі, виявляючись в результаті певних структурних змін, що виникають при світловій енергізації тилакоїдної мембрани і зумовлені відновленням дисульфідних зв'язків у субодиниці (Richter et al., 1996; He et al., 2000) та переорієнтацією субодиниці (Suzuki et al., 2003). Процеси синтезу і гідролізу АТФ супроводжуються перенесенням протонів через комплекс CF0CF1, проте молекулярний механізм їх внутрішньоферментного спряження та організація внутрішньоферментного шляху транспорту протонів залишаються нез'ясованими.
Ефективність фотосинтетичного перетворення енергії значною мірою залежить від ступеня спряженості між процесами перенесення протонів, фотофосфорилювання і транспорту електронів. Існує думка, що функціональний стан АТФ-синтази, а також світлозалежні зміни конформації цього комплексу відіграють суттєву роль у регуляції швидкості електронного транспорту (Ryrie et al., 1972; Wagner et al., 1985).
Доведено, що перенесення протонів через АТФ-синтазу впливає на фотохімічну активність ФС II і ФС I, причому цей процес залежить від умов освітлення, а саме, він проявляється за низької інтенсивності діючого світла (Braun et al., 1991). Проте питання щодо участі АТФ-синтази у контролюванні фотохімічної активності кожної фотосистеми за високої інтенсивності світла та зв'язку цього процесу зі змінами рН потребує вирішення.
Таким чином, існуючі відомості свідчать, що механізми регуляції швидкості електронного транспорту в хлоропластах, які відіграють важливу роль при вирішенні загальної проблеми фізіологічної регуляції фотосинтезу, вивчені недостаньо. Тому дослідження ролі АТФ-синтази у фотосинтетичному контролі транспорту електронів є актуальним.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з планами фундаментальних науково-дослідних робіт відділу мембранології та фітохімії Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України: “Вивчення світлозалежних процесів в енергоперетворюючих мембранах фотосинтезуючих організмів” (1992–1996р.р.; № держреєстрації VA01000059P); “Особливості еволюційного становлення систем світлозбору та синтезу АТФ у фотосинтезуючих організмів” (1997–2001р.р.; № держреєстрації 0198U003791).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення ролі АТФ-синтази у координації процесів електронного транспорту та фотофосфорилювання в хлоропластах вищих рослин.
У завдання роботи входило:
встановити кінетичні характеристики протонного транспорту через CF0CF1 у процесі оборотних переходів комплексу із синтазного в гідролазний стан;
2) дослідити зв'язок між змінами протонної провідності комплексу СF0CF1 під впливом аденіннуклеотидів та інгібіторів протонного транспорту і величиною pH;
3) вивчити вплив аденіннуклеотидів на структурні перебудови у мембранній частині комплексу CF0CF1 (CF0) шляхом аналізу протонної провідності CF0 після видалення каталітичної частини (CF1) із тилакоїдних мембран;
4) розробити методичний підхід для оцінки відносного внеску фотосистем I і II у загальну швидкість фотовідновлення екзогенного акцептора електронів фериціаніду калію в хлоропластах;
5) з'ясувати роль АТФ-синтази у регуляції фотохімічної активності фотосистем I і II в залежності від інтенсивності світла.
Об'єкт дослідження – трансформація енергії світла в хімічну енергію у процесі фотосинтезу.
Предмет дослідження – спряження процесів транспорту електронів, перенесення протонів та фотофосфорилювання в хлоропластах.
Методи дослідження – потенціометричний, амперометричний, спектрофотометричний та електрофоретичний методи.
Наукова новизна одержаних результатів.
• Вперше проведено детальний аналіз ролі АТФ-синтазного комплексу у фотосинтетичному контролі фотохімічних реакцій хлоропластів в залежності від рівня енергізації тилакоїдних мембран;
• Встановлено, що конформаційні зміни мембранної частини АТФ-синтази (CF0), які спричинені зв'язуванням аденіннуклеотидів з відповідними центрами, зберігаються і після видалення каталітичної частини (CF1);
• Вперше показано, що модифікація протонного каналу CF0 N,N'-дициклогексилкарбодиімідом (ДЦКД) призводить до внутрішньоферментного роз'єднання синтезу АТФ та протонного транспорту за високих рівнів pH;
• Отримано нову інформацію, що вказує на структурну перебудову шляхів транспорту протонів у процесі оборотних переходів комплексу CF0CF1 із синтазного в гідролазний стан;
• Розроблено методичний підхід, який дозволяє оцінити відносний внесок фотосистем I і II у загальну швидкість відновлення фериціаніду калію в хлоропластах за різних умов освітлення. Вперше визначена відносна активність окремих фотосистем в реакції Хілла за високої інтенсивності діючого світла.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати сприяють розумінню природи енергізованого стану хлоропластів і можуть становити цінність при вирішенні проблеми спрямованої регуляції фотосинтетичної діяльності рослин з метою збільшення їх загальної фотосинтетичної продуктивності. Матеріали можуть бути використані в навчальному процесі учбових закладів при викладенні окремих курсів з біоенергетики та біохімії.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформа-ційний пошук і аналіз даних літератури, проведено усі експериментальні дослідження, обробку й узагальнення одержаних результатів. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок досліджень, висунуто робочу гіпотезу щодо ролі АТФ-синтази у фотосинтетичному контролі електронного транспорту, обґрунтовано методологію проведення експериментів.
Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідались на I Українському біофізичному з'їзді (Київ, 1994); VIII Європейській біоенергетичній конференції “Биоэнергетика фотосинтеза” (Пущино, 1996); VII біохімічному з'їзді (Київ, 1997); VIII біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002); Міжнародній конференції “Photosynthesis and crop production” (Київ, 2002).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 9 наукових робіт, у тому числі 4 статті у фахових виданнях, затверджених переліком ВАК України, та 5 тез доповідей конференцій і з'їздів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з переліку умовних позначень, вступної частини, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень та їх обговорення, висновків і списку літератури, який містить 203 посилання. Роботу викладено на 123 сторінках, включаючи 11 таблиць та 16 рисунків.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Рослинний матеріал. Матеріалом для виділення хлоропластів слугували листки двотижневих рослин гороху посівного (Pisum sativum L.) сорту “Дамір-2”, насіння якого було отримане з Київського Інституту землеробства, а також листки 40-денних рослин шпинату (Spinacia oleracea L.).
Виділення хлоропластів класу “В”. Хлоропласти класу “В” виділяли згідно (Walker, 1980) і ресуспендували в буферному середовищі, яке містило 400 мМ сорбітол, 10 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pН 7,8). Концентрацію хлорофілу визначали за методом Арнона (Arnon, 1949).
Одержання препаратів тилакоїдних мембран, оброблених ДЦКД. ДЦКД є інгібітором транспорту протонів через комплекс CF0CF1. Хлоропласти інкубували з 0,2 мМ ДЦКД при співвідношенні ДЦКД/хлорофіл 0,05 протягом 5 хвилин. Після інкубації мембрани осаджували, суспендували в буферному середовищі з бичачим сироватковим альбуміном (БСА) в концентрації 1 мг/мл і двічі відмивали середовищем без БСА. При дослідженні кінетики інгібування фосфорилювання і активованого світлом гідролізу АТФ ДЦКД-оброблені препарати одержували шляхом інкубації мембран з інгібітором при вказаних в експериментах співвідношеннях ДЦКД/хлорофіл протягом 5 хвилин.
Одержання препарату тилакоїдних мембран, звільнених від каталітичної частини АТФ-синтази (CF1). Видалення каталітичної частини АТФ-синтази (CF1) здійснювали шляхом обробки хлоропластів 2 М NaBr згідно методу (Kamienietzky et al., 1975) і тестували за методом гель-електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) із застосуванням додецилсульфату натрію згідно (Laemmli, 1970).
Визначення швидкості фотофосфорилювання. Швидкість циклічного та псевдоциклічного фотофосфорилювання оцінювали потенціометричним методом (Mills, 1986) по залуженню суспензії хлоропластів (15 мкг хлорофілу/мл) після освітлення білим світлом зі щільністю потоку фотонів 500 мкмоль·м-2·с-1. Реакційне середовище містило 200 мМ сорбітол, 10 мМ KCl, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl2, 3 мМ KH2PO4, 1 мМ трис-HCl (pH 8,0), 0,5 мМ AДФ. Кофакторами циклічного та псевдоциклічного фотофосфорилювання слугували 0,05 мМ феназинметосульфат (ФМС) і 0,1 мМ метилвіологен (MВ), відповідно. Розрахунки проводили з урахуванням буферної ємності реакційної суміші, яку встановили шляхом титрування 10 мМ HCl.
Визначення швидкості активованого світлом гідролізу АТФ. Швидкість активованого світлом гідролізу АТФ визначали потенціометричним методом (Mills, 1986) після тіолової модуляції тилакоїдів за допомогою 10 мМ дитіотрейтолу (ДТТ). Реакційне середовище містило 6 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 0,1 мМ метилвіологен, 6 мМ ДTT, 2 мМ трицин-KOH (рН 8,0) та тіол-модульовані тилакоїди (40 мкг хлорофілу/мл). Реакційну суміш попередньо освітлювали білим світлом зі щільністю потоку фотонів 500 мкмоль·м-2·с-1 протягом 4 хвилин. Відразу після вимикання світла додавали АТФ до концентрації 1 мМ і реєстрували закислення середовища, швидкість якого пропорційна швидкості спряженого гідролізу АТФ.
Визначення швидкості електронного транспорту. Швидкість електронного транспорту від води до метилвіологену (0,1 мМ) визначали за поглинанням кисню амперометричним методом згідно (Allen et al., 1986); швидкість реакції Хілла вимірювали спектрофотометричним методом, визначаючи індуковане світлом відновлення екзогенного акцептора електронів фериціаніду калію (0,4 мМ) за зміною поглинання зразків при 420 нм (Hipkins et al., 1986), та потенціометричним методом за виділенням протонів у реакційне середовище в ході фотовідновлення фериціаніду калію (Онойко и др., 2004). Реакційне середовище містило 200 мМ сорбітол, 5 мМ MgCl2, 10 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 10 мМ трицин-NaOH (pН 8,0) та хлоропласти (20 мкг хлорофілу/мл). При визначенні швидкості електронного транспорту за допомогою амперометричного методу реакційну суміш освітлювали білим світлом зі щільністю потоку фотонів 500 мкмоль·м-2·с-1, тоді як при застосуванні спектрофотометричного та потенціометричного методів щільність потоку фотонів була 50 і 500 мкмоль·м-2·с-1.
Визначення величини індукованого світлом поглинання протонів та кількості протонів, що вийшли з енергізованих тилакоїдів після вимикання світла. Величину індукованого світлом (щільність потоку фотонів 500 мкмоль·м-2·с-1) поглинання протонів та кількість протонів, що вийшли з енергізованих тилакоїдів після вимикання світла, визначали за змінами рН у суспензії хлоропластів (0,1 мг хлорофілу/мл), що містила 100 мМ сорбітол, 10 мМ KCl, 10 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 0,1 мМ метилвіологен, 1 мМ трицин-КОН (pН 7,7) та змінами буферної ємності реакційного середовища, яку вимірювали шляхом титрування 10 мМ HCl. Константи швидкості виходу протонів із енергізованих тилакоїдів (kт) розраховували згідно (Ho et al., 1979).
Одержані результати оброблялися статистично. Експериментальні дані, що наведені в таблицях і на графіках, представлені у вигляді середнього арифметичного, стандартне відхилення якого визначено з урахуванням усіх повторностей (М ± σ, n = 15, Р ≤ 0,05).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Організація протонного транспорту в Н+–АТФ-азі хлоропластів, спряженого із синтезом і гідролізом АТФ. Участь транслокації протонів через Н+–АТФ-азний комплекс (CF0CF1) в реакціях синтезу і гідролізу АТФ досліджувалась шляхом модифікації комплексу за допомогою ДЦКД, який пригнічує активність мембранної частини (CF0). Порівняння кінетики інгібування фотофосфорилювання і активованого світлом гідролізу АТФ показало, що реакція гідролізу є більш чутливою до ДЦКД, ніж реакція синтезу АТФ (рис. 1).
Пригнічення гідролізу АТФ після активації реакції світлом у присутності 10 мМ ДTT в попередньо оброблених інгібітором хлоропластах досягалось при співвідношеннях ДЦКД/хлорофіл більш низьких, ніж для інгібування синтезу АТФ. Так, 50% інгібування фотофосфорилювання (I50) в суспензії хлоропластів, що містила 4,0 мг хлорофілу/мл, спостерігалось при співвідношенні ДЦКД/хлорофіл 0,017, тоді як аналогічне пригнічення активованого світлом гідролізу АТФ - при співвідношенні 0,012 (рис. 1а, графіки 2, 1). I50 для реакції синтезу АТФ в препаратах хлоропластів, що містили 1,8 мг хлорофілу/мл, складало 0,1 і, відповідно, 0,04 для гідролізу АТФ (рис. 1а, графіки 4, 3).
Гідроліз АТФ характеризувався також підвищеною кінетичною кооперативністю. При обробці хлоропластів ДЦКД в концентрованій суспензії (4,0 мг хлорофілу/мл) значення коефіцієнтів Хілла (nХ) для реакцій інгібування синтезу і гідролізу АТФ складали 5,8 і 9,1, відповідно (рис. 1б, графіки 2, 1). Значення коефіцієнтів Хілла для реакцій інгібування синтезу і гідролізу АТФ в більш розведеній суспензії (1,8 мг хлорофілу/мл) складали 2,6 і 3,3, відповідно (рис. 1б, графіки 4, 3).
Рис. 1. Залежність ступеня інгібування фотофосфорилювання (графіки 2, 4) і активованого світлом гідролізу АТФ (графіки 1, 3) від співвідношення між концентраціями інгібітора і пігменту в препаратах хлоропластів у процесі темнової преінкубації (а) та відображення цієї залежності у координатах Хілла (б).
Хлоропласти інкубували з ДЦКД при концентрації хлорофілу 4,0 мг/мл (графіки 1, 2) і 1,8 мг/мл (графіки 3, 4). Числа над прямими - значення коефіцієнтів Хілла (nХ).
Результати виміру кінетики інгібування фотофосфорилювання і активованого світлом гідролізу АТФ, а також значення коефіцієнтів Хілла, що визначають кількість можливих центрів зв'язування інгібітора (Маршелл, 1981), засвідчили різну участь в цих фотохімічних реакціях субодиниць III, які формують протонопровідний канал CF0 і здатні зв'язувати ДЦКД. В концентрованій суспензії (4 мг хлорофілу/мл) ДЦКД пригнічував гідроліз АТФ внаслідок його зв'язку з одним із дев'яти однотипних центрів субодиниць III СF0, тоді як інгібування фотофосфорилювання досягалось при зв'язуванні ДЦКД з одним із шести однотипних центрів субодиниць III CF0 (див. рис. 1б, графіки 1, 2). В більш розведеній суспензії (1,8 мг хлорофілу/мл) участь субодиниць III в реакціях гідролізу і синтезу АТФ також була неоднакова (див. рис. 1б, графіки 3, 4).
Транслокація протонів через CF0 забезпечується за рахунок функціонування олігомеру, який утворюють субодиниці III (Poetsch et al., 2003). Можна припустити, що різна організація протонного каналу в реакціях синтезу і гідролізу АТФ (наприклад, більш компактний канал при фотофосфорилюванні) може спричиняти і різний ступінь олігомеризації субодиниць III у процесі перенесення протонів через CF0.
Таким чином, на підставі інгібіторного аналізу фотофосфорилювання і активованого світлом гідролізу АТФ встановлено різний ступінь кінетичної кооперативності цих фотохімічних реакцій, що дозволило висловити припущення про структурні перебудови шляхів транспорту протонів у процесі оборотних переходів Н+–АТФ-азного комплексу із синтазного в гідролазний стан (Золотарева, Довбыш, Онойко, 2001).
Участь центрів АТФ-синтази, що зв'язують нуклеотиди, у регуляції електронного транспорту в хлоропластах. Вважається, що участь аденіннуклеотидів у регуляції електронного транспорту здійснюється через зміну протонної провідності АТФ-синтазного комплексу, що впливає на величину pH (Underwood et al., 1980; Graber et al., 1981; Золотарева, 1994). Проте існують фактори, які призводять до зміни величини pH, однак їх вплив на перенесення протонів через комплекс CF0CF1 ще не визначено.
Аналіз змін протонної провідності АТФ-синтази при дії аденіннуклеотидів здійснювали на основі результатів виміру швидкості перенесення електронів від води до метилвіологену в контрольних та ДЦКД-оброблених хлоропластах (табл. 1). Після обробки мембранних препаратів ДЦКД, яка викликала повне пригнічення синтезу АТФ, в них зберігалось 70% електронного транспорту. Внесення в середовище AДФ і арсенату або фосфату значно прискорювало швидкість перенесення електронів як у контрольних, так і в ДЦКД-оброблених мембранах. Додавання у середовище 0,25 мМ AДФ і 5 мМ Asi або Фн втричі прискорювало швидкість перенесення електронів від води до метилвіологену, чого не спостерігалось при окремому внесенні самого AДФ. При цьому, фосфат у присутності AДФ стимулював транспорт електронів в ДЦКД-оброблених препаратах практично так само, як і арсенат. Одержані дані демонструють збереження активації швидкості перенесення протонів через комплекс CF0CF1 і, отже, електронного транспорту субстратами фотофосфорилювання при повному пригніченні синтезу АТФ.
Таблиця 1
Вплив субстратів фотофосфорилювання на швидкість перенесення
електронів від води до метилвіологену в контрольних та
ДЦКД-оброблених хлоропластах
Варіанти досліду Швидкість перенесення електронів,
мкмоль О2·мг хл.-1·год-1
Контрольні
хлоропласти ДЦКД-оброблені
хлоропласти
Без субстратів 120 ± 5,7 85 ± 4,2
+ 0,25 мМ AДФ 100 ± 4,8 80 ± 3,7
+ 0,02 мМ AДФ, 5 мМ Asi 160 ± 6,5 135 ± 5,4
+ 0,05 мМ AДФ, 5 мМ Asi 240 ± 10,1 200 ± 8,5
+ 0,1 мМ AДФ, 5 мМ Asi 320 ± 15,5 255 ± 11,6
+ 0,25 мМ AДФ, 5 мМ Asi 360 ± 16,2 270 ± 12,2
+ 0,25 мМ AДФ, 5 мМ Фн 310 ± 14,4 260 ± 13,0
Як відомо, регуляція швидкості перенесення електронів по ЕТЛ здійснюється через величину H+ на тилакоїдній мембрані (Mitchell, 1966). У присутності протонофора NH4Cl, який розсіює трансмембранний протонний градієнт, присутність субстратів фотофосфорилювання викликала прискорення швидкості електронного транспорту як у контрольних, так і в ДЦКД-оброблених препаратах (табл. 2).
Таблиця 2
Вплив 10 мМ NH4Cl на швидкість перенесення електронів від води
до метилвіологену у присутності субстратів фотофосфорилювання
в контрольних та ДЦКД-оброблених хлоропластах
Варіанти досліду Швидкість перенесення електронів,
мкмоль О2·мг хл.-1·год-1
Контрольні
хлоропласти ДЦКД-оброблені хлоропласти
Без субстратів 370 ± 15,2 360 ± 15,8
+ 0,25 мМ АДФ, 5 мМ Asi 440 ± 22,0 425 ± 20,4
+ 0,25мМ AДФ, 5 мМ Фн 440 ± 21,6 425 ± 20,0
Ймовірно, що крім pH-залежної регуляції швидкості електронного транспорту існує й інший регуляторний механізм за участю субстратів фотофосфорилювання, який здійснюється шляхом структурних перебудов у комплексі АТФ-синтази, що впливають на транспорт протонів. Можна припустити, що AДФ і арсенат або фосфат при зв'язуванні з каталітичною частиною комплексу (CF1) індукують підвищену протонну провідність мембранної частини АТФ-синтази (CF0) через зміну її конформаційного стану, що, у свою чергу, посилює швидкість електронного транспорту. При цьому, ДЦКД шляхом ковалентної модифікації субодиниці III протонного каналу CF0 пригнічує синтез АТФ, але не впливає на такий конформаційний перехід.
За нашими даними, АТФ у концентраціях 1-50 мкМ, на відміну від субстратів фотофосфорилювання, уповільнював швидкість перенесення електронів від води до метилвіологену в контрольних і прискорював її в ДЦКД-оброблених хлоропластах (рис. 2).
Рис. 2. Залежність швидкості перенесення електронів від води до метилвіологену в контрольних (графік 1) та ДЦКД-оброблених (графік 2) хлоропластах від концентрації АТФ у реакційному середовищі.
При дії ДЦКД, очевидно, відбувалась зміна властивостей центрів міцного зв'язування АТФ. Так, представлена на рис. 2 залежність швидкості електронного транспорту від концентрації АТФ вказує на те, що перенесення протонів через АТФ-синтазу контролюється двома центрами, що зв'язують АТФ. Заповнення центрів міцного зв'язування АТФ з КМ 5 і 30 мкМ в контрольних хлоропластах призводило до пригнічення швидкості перенесення протонів через комплекс CF0CF1 і до уповільнення швидкості електронного транспорту (рис. 2, графік 1). Після обробки хлоропластів ДЦКД константи зв'язування (КМ), які характеризують спорідненість цих центрів до АТФ, змінювались і складали 10 і 40 мкМ, відповідно. Це викликало збільшення протонної провідності АТФ-синтазного комплексу і прискорення швидкості перенесення електронів від води до метилвіологену (рис. 2, графік 2).
Низькі концентрації АТФ впливали також на швидкість виходу протонів із енергізованих контрольних та ДЦКД-оброблених хлоропластів після вимикання світла (рис. 3).
Рис. 3. Вплив АТФ на кінетику виходу протонів із контрольних та ДЦКД-оброблених хлоропластів після вимикання світла, що представлений у вигляді логарифмічної залежності величин Н+t/H+ст.:
Н+ст. - максимальне поглинання протонів із середовища після вмикання світла; Н+t - кількість протонів, що вийшли з енергізованих хлоропластів у момент часу t після вимикання світла. 1 - контрольні хлоропласти; 2 - ДЦКД-оброблені хлоропласти; 3 - контрольні хлоропласти, що освітлювались у присутності 20 мкМ АТФ; 4 - ДЦКД-оброблені хлоропласти, що освітлювались у присутності 20 мкМ АТФ. Числа під графіками - константи швидкості виходу протонів із тилакоїдів (kт), обчислені із цих графіків.
Обробка хлоропластів ДЦКД практично не впливала на протонну провідність АТФ-синтазного комплексу, оскільки спостерігались незначні зміни виходу протонів із ДЦКД-модифікованих препаратів щодо контролю (рис. 3, графіки 2, 1). Це засвідчували значення констант швидкості виходу протонів (kт), розраховані із графіків логарифмічної залежності величин Н+t/H+ст. від часу, що пройшов після вимикання світла. Однак у присутності в середовищі АТФ у концентрації 20 мкМ протонна провідність комплексу CF0CF1 в контрольних і ДЦКД-оброблених препаратах сильно відрізнялась. Так, в контрольних хлоропластах після внесення 20 мкМ АТФ протонна провідність комплексу знижувалась на 60%, тоді як в ДЦКД-оброблених мембранах відбувалось більш ніж дворазове прискорення виходу протонів (рис. 3, графіки 3, 4).
Ці результати свідчать, що в ДЦКД-оброблених хлоропластах порушується механізм аденілатного контролю швидкості перенесення протонів через комплекс CF0CF1. Можна припустити, що різке зменшення спорідненості центрів міцного зв'язування до АТФ призводить до порушення внутрішньоферментного протонного спряження в хлоропластах на рівні комплексу ATФ-синтази і бере участь у механізмі інгібування фотофосфорилювання ДЦКД.
Одержані відомості розширюють існуючі уявлення про механізм фотосинтетичного контролю, демонструючи, що у здійснені його, крім рН, бере участь також АТФ-синтаза шляхом регулювання швидкості перенесення електронів по ЕТЛ. Конформаційні зміни у ферментному комплексі CF0CF1 позначаються на його протонній провідності, яка залежить від заповнення центрів зв'язування нуклеотидів субстратами або продуктом фотофосфорилювання, а також від стану мембранної частини комплексу (Онойко и др., 2005). При цьому заповнення центрів зв'язування аденіннуклеотидами контролює як співвідношення між фосфорилюючим і нефосфорилюючим потоками протонів через комплекс CF0CF1, так і ступінь спряженості електронного транспорту із синтезом АТФ.
Конформаційні зміни мембранної частини АТФ-синтази, індуковані зв'язуванням аденіннуклеотидів з каталітичною частиною комплексу. Відомо, що центри зв'язування аденіннуклеотидів локалізовані виключно в каталітичній частині комплексу CF0CF1. Серед них розрізняють саме каталітичні центри, в яких синтезуються молекули АТФ із AДФ і фосфату або гідролізується АТФ, а також регуляторні центри, у тому числі центри міцного зв'язування, що відіграють важливу роль у регуляції активності ферменту (Shapiro et al., 1991; Boyer, 1993; Digel et al., 1995).
Дослідження впливу субстратів та продукту фотофосфорилювання, які зв'язуються з каталітичною частиною комплексу CF0CF1 (CF1), на протонну провідність його мембранної частини (CF0) здійснювали шляхом визначення швидкості електронного транспорту в контрольних та ДЦКД-оброблених хлоропластах після видалення CF1 з тилакоїдних мембран за допомогою 2 М NaBr. Було показано, що присутність в середовищі, де знаходились хлоропласти, субстратів або продукту фотофосфорилювання суттєво змінювала протонну провідність CF0 після вилучення CF1 (табл. 3).
Виявилось, що швидкість електронного транспорту, яка залежить від перенесення протонів через CF0, в препаратах, оброблених у темряві AДФ і Фн, а потім позбавлених CF1, була значно вищою, ніж у NaBr-відмитих контрольних мембранах. Попередня обробка хлоропластів АТФ у концентрації 10-50 мкМ, навпаки, призводила до інгібування швидкості перенесення протонів через відкритий протонний канал СF0 і, тому, до пригнічення швидкості електронного транспорту.
Таблиця 3
Вплив аденіннуклеотидів на швидкість перенесення електронів від води до
метилвіологену в NaBr- відмитих контрольних та NaBr- відмитих
ДЦКД-оброблених хлоропластах
| 
