|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
На правах рукопису
РЄЗНІКОВ ВІТАЛІЙ ЛЕОНТІЙОВИЧ
УДК 577.352.4: 612.73
ФАРМАКО-БІОФІЗИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА
ПОТЕНЦІАЛКЕРОВАНИХ ІОННИХ СТРУМІВ ГЛАДЕНЬКОМ'ЯЗОВИХ КЛІТИН
ХВОСТОВОЇ АРТЕРІЇ ЩУРА
03.00.02. – біофізика
Автореферат дисертації
на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ 2001 р.
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в відділі нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук
Шуба Михайло Федорович
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
завідуючий відділом нервово-м'язової фізіології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Веселовський Микола Сергійович
заступник директора Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України
кандидат біологічних наук
Марченко Сергій Михайлович
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
старший науковий співробітник відділу кровообігу
Провідна установа: Інститут фізіології ім. П.Г. Богача, м. Київ
Захист відбудеться “22” травня ” 2001 р. о “14” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий “19 ” квітня 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради, З.О.Сорокіна-Маріна
доктор біологічних наук
Загальна характеристика роботи
Актуальність проблеми. Дослідження показують, що в основному кров'яний тиск регулюється зміною діаметру резистивних судин[, до яких належать артерії малого діаметру та артеріоли. При дії більшості вазоконстрикторів і вазодилятаторів змінюється діаметр переважно судин резистивного типу. Авторегулятивна відповідь кровоносної системи організму на зменшення кровотоку в результаті перетискання аорти зосереджена в основному в цих судинах. Оскільки їх діаметр не перевищує 500мкм, проводити експерименти на резистивних судинах важко. Досліджувати механізми спряження скорочення-збудження найкраще на них, бо невелика товщина стінки судин цих артерій дозволяє, використовуючи оптику Номарського, бачити окремі гладеньком'язові клітини (ГМК). Такі дослідження, правда, без відомостей про електричні властивості мембрани, не дають можливість повністю зрозуміти ці механізми. Результати електрофізіологічних дослідів, виконаних на ізольованих багатоклітинних препаратах резистивних судин, мають переважно якісний характер. Їх можна трактувати двояко. До того ж відсутність ефективних блокаторів різних провідностей не дозволяє з впевненістю розділити і кількісно схарактеризувати іонні струми мембрани ГМК малих артерій. Присутність різних біологічноактивних систем в стінці судин може вносити свої артефакти в отримані результати. Більшість цих недоліків усуваються при дослідженні поодиноких ізольованих ГМК кровоносних судин.
Біля 50% смертності в Європі пов'язано з захворюваннями серцево -судинної системи. Регулювання кровотоку здійснюється за допомогою біологічноактивних речовин, одним з механізмів дії яких є модуляція іонної провідності мембрани ГМК. Наприклад, при патологічних процесах підвищується концентрація цитокінінів, дія яких призводить до збільшення кальцієвого струму ГМК, гіпоксія викликає виділення з ендотелію ендотеліну[, що активує неселективні катіонні канали. Принцип дії багатьох серцево-судинних препаратів заключається в активації чи пригніченні іонної провідності мембрани ГМК і як результат - зміна ступеня скорочення ГМК, що підвищує або знижує кров'яний тиск. Важливо те, що в різних частинах кровоносної системи ГМК мають різні властивості. Наприклад, вазопресин розслаблює малі артерії і скорочує артеріоли. Особливі фармако-біофізичні властивості малих артерій дають можливість для пошуку різних фармакологічних впливів на регуляцію кров'яного тиску.
Хвостова артерія щура за процентною частиною в ній ГМК відноситься також до резистивних судин. Ця судина, окрім регулювання кровўяного тиску, виконує терморегуляторну роль. Також вона є зручним об'єктом для тензометричних досліджень. Багато робіт виконано на багатоклітинних препаратах. Але через те, що стінка цієї судини має велику кількість сполучної тканини, важко отримувати функціонально-повноцінні поодинокі ГМК. Ця обставина є основною причиною того, що до сьогодні є тільки декілька публікацій, присвячених прямому дослідженню трансмембранних іонних струмів у ізольованих поодиноких ГМК цієї судини за допомогою сучасних біофізичних методів.
Мета і завдання дослідження. Головною метою нашої роботи було дослідження фармако-біофізичних характеристик плазматичної мембрани поодиноких ізольованих ГМК хвостової артерії щура за допомогою “patch-clamp” метода Для досягенння поставленої мети необхідно було виконати такі конкретні наукові завдання.
1. Розробити найменш пошкоджуючу методику виділення функціонально повноцінних ізольованих ГМК хвостової артерії щура і застосувати до них метод “петч-клемп”.
2. Отримати при різних фіксованих мембранних потенціалах ГМК інтегральний трансмембранний іонний струм і проаналізувати потенціалзалежність його амплітуди і кінетику.
3. Розділити інтегральний трансмембранний іонний струм на компоненти та дослідити іонну природу, амплітудно-кінетичні і фармакологічні властивості цих компонент. Провести їх аналіз.
4. Дослідити механізми збуджуючої дії агоніста a-адренорецепторів - фенілефрину на вхідні і вихідні іонні струми ГМК.
Новизна отриманих результатів. Розроблена методика виділення поодиноких ізольованих функціонально повноцінних ГМК хвостової артерії щура інкубуванням в ферменті протягом 17 хв. Виконана ідентифікація та описані фармакологічні і кінетичні характеристики калієвих, кальцієвих каналів плазматичної мембрани цих клітин за умов фізіологічної внутрішньо- та зовнішньоклітинної концентрації кальцію. Встановлено, що трансмембранні іонні струми у відповідь на деполяризуюче зміщення мембранного потенціалу переносяться через кальційзалежні і затриманого випрямлення калієві канали та потенціалзалежні L-типу кальцієві канали. Показано, що для виникнення спонтанних вихідних струмів (СВС) потрібен вхід Са2+ через потенціалзалежні кальцієві канали L-типу та його вивільнення з ріанодинчутливого компонента саркоплазматичного ретикулюма.
Дослідженно, що активація a-адренорецепторів призводить до пригнічення калієвої провідності, як в результаті зменшення входу кальцію зовні, через потенціалзалежні кальцієві канали L-типу, так і через дію на самі калієві канали.
Теоритичне і практичне значення отриманих результатів. Розроблена методика виділення фукнкціонально-повноцінних ГМК хвостової артерії щура за короткий час в умовах, наближених до фізіологічних. Отримані результати дозволяють пояснити дію блокаторів калієвих та кальцієвих каналів на багатоклітинні препарати. Краще зрозуміти механізми спряження збудження і скорочення. Пригнічення кальційзалежної калієвої провідності в присутності агоніста ?-адренорецепторів дозволяє пояснити механізми скорочення ГМК судин при дії цих агоністів, глибше зрозуміти механізми регулювання кров'яного тонусу в резистивних судинах.
Oсобистий внесок здобувача. При виконані роботи здобувачем:
- розроблена методика виділення поодиноких ізольованих гладенько-м'язових клітин інкубуванням в ферменті на протязі 17 хв;
- проведено науковий пошук та обгрунтування вибраного напрямку досліджень;
- проведено всю експериментальну роботу та науковий аналіз отриманих результатів.
Апробація дисертації. Oсновні положення дисертації слухали та обговорювали на XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), 6-му Міжнародному симпозіумі з резистивних артерій (Мол, Бельгія, 1998), ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), ІІІ Національному конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000).
Публікації. Матеріали дисертаційного дослідження викладені в 7 публікаціях: у журналах – 3, у тезах доповідей на конференціях, з'їздах – 4.
Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу та розділів: літературний огляд, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення, підсумкових висновків та переліку використаної літератури із 342 джерел. Роботу викладено на 113 сторінках друкованого тексту, вона містить 2 таблиці та 19 рисунків.
Матеріали і методи досліджень
Виділення поодиноких ізольованих гладеньком'язових клітин. Дослідження проводили на поодиноких ізольованих гладеньком'язових клітинах хвостової артерії щурів обох статей, вагою 250-300г, які отримували за допомогою ферментативно-механічного методу ізоляції.
Спочатку виділену хвостову артерію щура поміщали в безкальцієвий розчин на 3хв (безкальцієвий розчин Кребса модифікованого). Після цього артерію переносили до свіжого розчину такого ж складу, очищали від сполучної тканини, розрізали її поздовж і, для впевненості, що ми виділимо ГМК без ендотеліальних клітин, останні руйнували, провівши декілька разів фільтрувальним папером по поверхні ендотелію. Потім смужку артерії переносили до свіжого безкальцієвого розчину, що містив колагеназу (тип ХІ) 0,15%, папаїн 0,15% і бичачий сироватковий альбумін (5 фракція) 0,1%. Інкубування смужки артерії в цьому розчині проводили в термостаті при температурі 340С протягом 17хв. Потім смужка відмивалася від ферменту безкальцієвим розчином 20хв. Для отримання клітин смужку багаторазово пропускали через пастерівську піпетку в безкальцієвому розчині, до якого додавали 0.1% бичачого сироваткового альбуміну. В отриманій таким шляхом суспензії ГМК концентрацію Са2+ доводили до 1мМ. Суспензію зберігали в холодильнику при температурі 40С. Клітини використовували для експерименту протягом 8 годин після виділення.
Ізольовані ГМК в середньому мали довжину 70мкм. Їх вхідний опір був у межах 1-7 ГОм, зберігали компоненти іонних провідностей і у відповідь на дію фенілефрину - агоніста a-адренорецепторів вони скорочувались. Прикріплювалися до дна камери. Вигляділи контрастними під світловим мікроскопом. Все це було доказом нормального функціонального стану і цілосності мембрани ізольованих нами клітин.
Електричні вимірювання. Для вимірювання трансмембранних іонних струмів ізольованих ГМК використали метод фіксації потенціалу. Суспензію клітин вміщували до камери столика інвертованого мікроскопа об'ємом 0.4 мл. Через 5-10 хв, коли клітини осідали на дно камери, розчин, в якому вони знаходилися, замінювався на модифікований розчин Кребса. Клітини, які не прикріпилися до дна камери, вимивалися з неї. Для реєстрації струмів використовували розслаблені та слабо скорочені артеріальні клітини. Заміну зовнішнього розчину проводили в об'ємі всієї експериментальної камери за декілька секунд. Всі досліди проведені при кімнатній температурі (20-240С). Мембранні струми підсилювали підсилювачем біопотенціалів "РОК-3М" з опором зворотнього зв'язку перетворювача струм-напруга 1ГОм. Дифузійний потенціал, що виникав при введенні мікропіпетки в розчин компенсували апаратно. Компенсацію струму витоку майже не використовували. Отримані струми через фільтр 3 кГц відцифровувались аналого-цифровим перетворювачем через 750 мкс, записувались на вінчестер IBM cумісного компьютера для подальшого аналізу за допомогою програми “Screen”, “DataSel”, “pCLAMP 6.0” i “Origin5.0”.
Піпетки для відведення електричних сигналів від ГМК. Мікропіпетки для вимірювання макрострумів та струмів через поодинокі іонні канали, виготовляли з м'ягкого молібденового скла за методикою, описаною Хамілом і спів. (Сакманн и др., 1987). Для виготовлення мікропіпеток використовували капіляри одного діаметру, що зменшувало розбіжність в їхньому опорі та дифузійному потенціалі. Піпетки витягували в одну стадію на вертикальній витяжці МЭ-4. Для того, щоб при отримані контакту не пошкоджувалась плазматична мембрана і збільшення площі кінчика скляної мікропіпетки проводили теплову поліровку останнього. Опір піпеток заповнених електролітом був 1-3МОм.
Дослідження інтегральних іонних струмів. Для дослідження інтегральних іонних струмів використали конфігурацію “петч-клемп” методу відведення від цілої клітини, який дає можливість контролювати мембранний потенціал, іонний склад внутрішньоклітинного розчину і концентрацію кальцію в ньому. Суть методу - утворення гігаомного контакту між стінкою кінчика мікропіпетки і плазмалемою.
Після отримання високоомного контакту піпетки з клітиною, мембрану під піпеткою проривали поштовхом від'ємного тиску, це давало змогу
здійснити діаліз клітини внутрішньопіпетковим розчином. Послідовний опір, оцінений по амплітуді ємністного струму, складав від 7МОм до 15МОм. Компенсації цього опору не проводилось. Низький опір мікропіпеток разом з високим вхідним опором ГМК забезпечували однорідну фіксацію потенціалу на всій поверхні мембрани. Командна різниця потенціалів подавалася на два хлорсрібні електроди, один з яких контактував з внутрішньоклітинним розчином, а інший через сольовий місток, заповнений 140мМ КCl, з зовнішньоклітинним розчином.
Дослідження струмів поодиноких іонних каналів. Для дослідженя струмів через поодинокі іонні канали використали конфігурацію петч-клемп методу – “прикріплена клітина”.
В цій конфігурації потенціал на мембрані під піпеткою ми точно фіксувати не можемо, оскільки він дорівнює сумі командного і потенціалу спокою клітини. Останній в експерименті не контролюється, що може призвести до значних похибок у визначенні його дійсної величини. Використання ізотонічного стосовно К+ зовнішньоклітинного розчину є одним з шляхів вирішення цієї проблеми. За таких умов зникає калієвий градієнт на мембрані досліджуваної клітини, а відповідно до закону Нернста і різниця потенціалів на мембрані. Струми, що виникали мали напрямок, протилежний струмам в реальних умовах. Відповідно, потенціал фіксації ділянки мембрани є протилежним тому, що фіксується на мембрані. В роботі подані значення струмів і потенціалів отримані в експериментах, але домножені на –1.
Амплітуду струмів поодиноких каналів визначали з амплітудних гістограм. Для цього гістограми описували кривою Гауса, максимум якої і відповідав нашому значенню. Для аналізу активності поодиноких каналів використовували параметр: “ймовірність відкритого стану каналу” (Р0), яка визначалася за формулою:
Р0=t0/T, де
t0 – загальний час знаходження каналу в відкритому стані; Т – час реєстрації.
Статистична обробка результатів представлена як М±m.
Розчини.
Для дослідження інтегральних струмів використовували розчини такого складу:
а) зовнішній модифікований розчин Кребса (мМ): NaCl 120.4, KCl 5.9, MgCl2 1.2, глюкоза 11.5, CaCl2 2.5, HEPES 5, pH 7.4 (NaOH);
б) внутрішньопіпетковий розчин (мМ): КСl 131, MgSO4 1, EGTA 0.5, Na2ATP 3, НЕPES 10, pH=7.4 (KOH).
Для дослідження іонних струмів поодиноких іонних каналів використовували розчини:
а) зовнішній розчини (мМ): KCl 140, MgCl2 1.2, C6H12O6 11.5, HEPES 5 pH (NaOH);
б) внутрішньопіпетковий розчини (мМ): KCl 140, CaCl2 2.5, MgCl2 1.2, HEPES 5 pH (NaOH)
Результати досліджень.
Трансмембранні іонні струми викликали деполяризуючим зміщенням підтримуваного мембранного потенціалу (МП) –70мВ до рівня +30мВ з інкрементом на 10мВ і тривалістю 150-300мс. На деяких міоцитах ємнісний струм на початку деполяризуючого імпульса переходив тимчасово у вхідний струм невеликої амплітуди. В 73% досліджених клітин вихідний струм мав на початку деполяризуючого зміщення МП до –30мВ і більше фазний компонент (рис. 1). При збільшенні деполяризації швидкість і амплітуда фазного компоненту зростали і збільшувались спонтанні коливання струму які, мабуть, пов'язані з активацією кальційзалежних калієвих каналів великої провідності ( ВК каналів, К(Са) каналів) (рис. 1). Максимальна
Рис.1. Трансмембранні іонні струми хвостової артерії щура.
А, трансмембранні іонні струми, викликали деполяризуючим зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня –70 мВ, до рівнів, зображених справа біля кожної осцилограми струму і їх ВАХ (Б), напочатку (¦) та в кінці (0) деполяризуючого зміщення МП, а також ВАХ максимума вхідного струму (^). Протокол експерименту зображений під малюнком А.
амплітуда фазного компонента, виміряна при деполяризації до +10мВ, знаходилася в діапазоні від 53пА до 2047пА, середнє значення якої становило 619±122пА (n=21). Час зростання вихідного струму у всіх експериментах вимірювали як час від базального рівня струму при підтримуваному потенціалі –70мВ до моменту, коли вихідний струм досягав максимального значення при деполяризації до +10мВ. Цей час для фазного компонента коливався в різних міоцитах від 18 до 51мс і в середньому становив 31±2мс (n=21). Тривалість фазного компонента варіювала від 41 до 178мс і середнє його значення складало 100±7мс. Після того, як амплітуда фазного компонента досягала максимального значення, вона частково спадала і переходила у стаціонарний компонент. Спад фазного компоненту не описувався експоненціальним законом. Амплітуда стаціонарного компонента струму, виміряна усередненням амплітуди вихідного струму від 140-200мс до кінця стимулу при потенціалі +10мВ, становила 341±58пА (n=18). На цьому компоненті були помітні спонтанні коливання вихідного струму.
В присутності блокаторів калієвих каналів (4мМ 4-АМП плюс 10мМ ТЕА) калієвий струм повністю пригнічувався. За цих умов у відповідь на ступінчату деполяризацію МП спокою виникав помітний вхідний Ва2+ струм (рис. 2.).
Рис.2. Дія блокаторів калієвих каналів на трансмембранний іонний струм.
Осцилограми струму отримані деполяризуючим зміщенням мембранного потенціалу від –70мВ до +10мВ. Верхня осцилограма в нормальному фізіологічному розчині (1), нижня - при дії 4мМ 4-АМП, 10мМ ТЕА , як носій вхідного струму використали 5мМ Ва2+ (2).
В подальших експериментах для отримання ІСа у чистому вигляді замінювали в зовнішньому та піпетковому розчинах іони К+ іонами Сs+ та додавали до зовнішнього розчину 4мМ 4-АМП та ТЕА 10мМ. Струми, отримані за цих умов, зображені на рис. 3. Відразу ж після прориву мембрани ГМК, вхідний струм збільшувався, але потім зменшувався і стабілізувався на постійному рівні. За цих умов, у відповідь на деполяризуюче зміщення мембранного потенціалу від підтримуваного рівня –70мВ тривалістю 300мс, ми спостерігали вхідні струми з порогом активації -40мВ, максимумом – 0 ? +10мВ, амплітудою струму на максимумі –74,7±18рА (n=5), швидкістю зростання до максимуму від початку депoляризаційного зміщення 6,84±0,64мс
Рис.3. Характеристика потенціалзалежного вхідного Ca2+ струму.
а - осцилограми вхідного струму, отримані при ступінчатих деполяризаціях (б) від несучого потенціалу –70мВ до +60мВ (б). в - ВАХ, побудована для максимума ІСа (¦) та мінімума в кінці ступінчатої деполяризації (0).
(n=8); спад струму описувався двома постійними часу 11,89±1,87мс і 45±4,9мс (n=4). ВАХ мала U-подібну форму. Спираючись на ці характеристики, можна сказати, що це потенціалзалежний кальцієвий струм L-типу Са2+ каналів.
Отже, в інтегральному трансмембранному іонному струмі, активованому ступінчатою деполяризацією, присутній потенціалзалежний кальцієвий струм L-типу.
Дія іонів Са2+ на вихідний ІК.
Як показано вище, вихідний компонент трансмембранного іонного струму має складну кінетику і амплітуду, що допускає можливість участі в його генерації більше, ніж одного типу калієвої провідності. Цьому питанню були присвячені наступні наші дослідження.
Виявилось, що заміна в розчині Кребса іонів Са2+ іонами Со2+ призводить до остаточного пригнічення фазного компонента вихідного К+ струму (рис. 4) і до зменшення амплітуди стаціонарного компонента цього струму від 327±69пА до 277±60пА (n=3) (виміряного усередненням стаціонарного компонента від 200мс до кінця деполяризуючого стимулу). В розглядуваних умовах зменшувалася частота спонтанних коливань вихідного струму, а час його зростання до максимуму на початку дії деполяризуючого імпульса збільшувався від 27±5 мс до 56±17мс.
Рис. 4. Дія безкальцієвого розчину Кребса на вихідний калієвий струм.
а - осцилограми струму, в контролі (1) і в безкальцієвому розчині (2). б – зміна амплітуди в часі фазного (¦) і стаціонарного(0) компонентів вихідного струму в Кребсі і безкальцієвому розчині (темна лінія). Результати для рис. а і б отримані з різних клітин.
Фазний та стаціонарний компоненти вихідного калієвого струму пригнічувалися також ніфедипіном 10мкМ, блокатором потенціалкерованих кальцієвих каналів L-типу.
Подальші дослідження показали, що фазний компонент і спонтанні коливання струму стаціонарного компонента пригнічувалися 1мМ ТЕА (рис. 5.) (в цій концентрації він селективно блокує К(Са) канали). Стаціонарна активація комопоненту струму, що залишався за цих умов, задовільно описувалася больцманівською кривою з коефіцієнтом нахилу k=10.5 та половинною інактивацією (V0.5) –45мВ.
З наведених результатів можна зробити висновок про те, що в генерації фазного компонента та спонтанних коливань стаціонарного компонента вихідного К+ струму беруть участь К(Са) канали великої провідності, які активуються іонами Са2+, що входять до ГМК через L-тип Са2+ каналів при ступінчатій деполяризації.
Рис. 5. Дія ТЕА на вихідний калієвий струм.
Цифри на рис. а і б відповідають цифрам на рис. в. а – осцилограми струму в Кребсі (1), в безкальцієвому розчині Кребса (2) і з доданим до нього 1мМ ТЕА (3), отримані у відповідь на деполяризацію мембрани до +10мВ від підтримуваного потенціалу –60мВ. б – осцилограми струму при відмиві від ТЕА (4) і безкальцієвого розчину (5). в – зміна в часі амплітуди калієвого струму, виміряної на 15мс від початку ступінчатої деполяризації мембрани в Кребсі (1), в безкальцієвому розчині Кребса (2), після додавання до безкальцієвого розчину Кребса 1мМ ТЕА (3), після видалення ТЕА з безкальцієвого розчину Кребса (4), наступна дія розчину Кребса (5).
Залежність фазного компоненту від внутрішньоклітинних депо.
В наступних експериментах ми досліджували вплив на К(Са) компонент вихідного К+ струму іонів Са2+ внутрішньоклітинних депо. Кофеїн є ефективним блокатором вивільнення іонів Са2+ з ріанодинчутливого
компонента саркоплазматичного ретикулума. Ця властивість і була використана в даних експериментах. В присутності 4мМ кофеїну фазний компонент вихідного К+ струму та спонтанні коливання стаціонарного компонента цього струму зникали (рис. 6. а). Обидва компоненти в присутності кофеїну при повторних деполяризаціях не з'являлися на відіміну від дії безкальцієвого розчину Кребса.
ЕГТА – сполуку, що зв'язує іони Са2+, використовують, щоб пригнітити вплив коливань концентрації цього двухвалентного іону на іонні провідності плазматичної мембрани біля її внутрішньоклітинної поверхні. При додаванні 10мМ ЕГТА у внутрішньопіпетковий розчин повністю пригнічувалися фазний та спонтанні коливання стаціонарного компонентів вихідного К+ струму (рис. 6. б)
Рис 6. Вплив внутрішньоклітинних іонів Са2+ на вихідний К+ струм.
а - дія 4мМ кофеїну на вихідний струм, зареєстрований у відповідь на деполяризацію мембрани до +10мВ від підтримуваного МП –60мВ. б – вихідний іонний струм, викликаний ступінчатою деполяризацією мембрани від підтримуваного МП –70мВ до +40мВ з кроком 10мВ, в присутності 10мМ ЕГТА у внутрішньопіпетковому розчині. в - ВАХ для калієвого струму побудована на максимумі (¦) і в кінці стимулу (0) (див. рис. 6. б).
Характеристика поодиноких Са2+-активованих К+-каналів ГМК хвостової артерії щура.
Для визначення характеристик поодиноких К(Са) каналів ми провели їх дослідження в конфігурації “прикріплена клітина”. На рис. 7. зображено ВАХ поодинокого К(Са) каналу та залежність ймовірності відкритого стану каналу від
Рис. 7. Характеристика поодиноких К(Са) каналів великої провідності.
А, ВАХ К(Са) каналів побудована з амплітудних гістограм, отриманих для кожного потенціалу. Б, залежність ймовірності, що канал буде відкритим від підтримуваного потенціалу на клаптику мембрани.
підтримуваного потенціалу на мембрані. Провідність К(Са) каналів, визначена з нахилу прямолінійної ділянки їх ВАХ, становила 162pS. Зменшення амплітуди поодинокого каналу при позитивних потенціалах можна пояснити блокуючою дією іонів Na+.
Спонтанні вихідні К+ струми ГМК хвостової артерії щура.
Відомо, що спонтанні вихідні струми виникають в результаті активації К(Са) каналів локальним підвищенням концентрації іонів Са2+ біля внутрішньої поверхні плазматичної мембрани. Одночасне спонтанне відкривання групи цих каналів виявляється у вигляді спонтанних вихідних струмів (СВС). Амплітуда СВС, виміряна при підтримуваному потенціалі на мембрані –30мВ коливалася від 50пА до 1000пА, частота - від 0.5 до 9.9 Hz (на різних клітинах). Вони блокувались 1мМ ТЕА. Зміна підтримуваного рівня мембранного потенціалу (рис. 8.) збільшувала амплітуду СВС. В літературі не існує єдиної думки щодо
Рис.8. Cпонтанні вихідні струми при різних рівнях фіксованої деполяризації мембранни ГМК.
Рис. 9. Вплив зовнішньоклітинного і внутрішньоклітинного кальцію на частоту і Q спонтанних вихідних струмів.
Зміна відносної частоти (А) i Q (Б) спонтанних вихідних струмів при дії ніфедипину (Ніф), кофеїну (кофеїн), безкальцієвого розчину (Со). Реєстрації отримані зміщенням підтримуваного мембранного потенціалу до рівня –30 ? -10мВ.
залежності СВС від зовнішньо- та внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+. Ми досліджували зміну кількості перенесеного заряду (Q) СВС та їх частот за умов заміни в розчині Кребса іонів Са2+ еквімолярною кількістю іонів Со2+, дією блокатора Са2+ каналів та при збільшенні внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ кофеїном в концентрації 1мМ. На рис. 9. зображено узагальнені дані цих експериментів.
Отже, можна сказати, що активація спонтанних вихідних струмів ГМК хвостової артерії щура відбувається як іонами Са2+, що входять до ГМК через потенціалкеровані Са2+ канали, так і іонами Са2+, що вивільнюються з внутрішньоклітинного кальцієвого депо.
Дія агоніста a-адренорецепторів на трансмембранні іонні струми хвостової артерії щура.
Адренорецептори ГМК кровоносних судин відіграють одну з важливіших ролей в активації і регуляції вазоконстрикції-вазодиляції судин. Звідси й те велике значення, яке надається вивченю цих рецепторів. Дане наше дослідження спрямоване на з'ясування збуджуючої дії агоніста ?-адренорецепторів фенілефрина на ГМК хвостової артерії щура. На рис. 10. зображено пригнічуючу дію фенілефрину на інтегральний трансмембранний іонний струм та на СВС і на вхідний потенціалкерований ІСа L-типу Са2+ каналів.
Зменшення ІК(Са) струму як на початку, так і в кінці деполяризуючого імпульсу, можна пов'язати з пригніченням входу іонів Са2+ до ГМК. На клітинах з вираженим кальцієвим вхідним компонентом трансмембраного іонного струму ми спостерігали пригнічення останнього в присутності фенілефрину. Щоб перевірити, чи пригнічується кальцієвий струм за цих умов, ми ізолювали останій і реєстрували зміну його амплітуди при дії фенілефрину (рис10. В). Помітно, що фенілефрин в концентрації 1мМ зменшує максимальну амплітуду кальцієвого струму на 27±10% (n=2), і в концентрації 0,1?М - на 14±5% (n=3). Дія фенілефрину на ІСа не завжди була зворотньою, блокувалася фентоламіном, селективним блокатором ?-адренорецепторів (n=3).
Рис. 10. Дія фенілефрину на трансмембранні іонні струми.
Цифрою 1 зображено контроль, 2 – дію агоніста. А, дія фенілефрину на фазний і стаціонарний компоненти вихідного струму, отримані у відповідь на деполяризацію мембрани від підтримуваного потенціалу –70мВ до +10мВ. Б, спонтанні вихідні струми, отримані деполяризуючим зміщенням мембраного потенціалу до –30мВ в контролі і при дії агоніста (чорна лінія). В, кальцієвий струм, отриманий зміщенням мембранного потенціалу від –70мВ до +10мВ в контролі і при дії фенілефрину. Г, залежність пригнічення стаціонарного компоненту фенілефрином від потенціалу на мембрані (побудована від 200мс деполяризуючого стимулу до його кінця)..
Рис. 11. Дія фенілефрину на поодинокі КСа канали.
Реєстрація активності поодиноких КСа каналів проводилася при потенціалі шматочка мембрани +60мВ. А – поодинокі канали в контролі та при дії фенілефрину (темна лінія). Б – зміна ймовірності знаходження КСа каналу в відкритому стані при дії фенілефрину.
можливе в результаті зменшення амплітуди поодинокого відкривання іонного каналу або ймовірності знаходження останнього в відкритому стані. Для визначення, який з механізмів має місце в даному випадку, ми провели експерименти на поодиноких іонних каналах. Реєстрацію активності каналів проводили в конфігурації “cell-attached”. Як видно з рис. 11. Б., за цих умов, спостерігалось зменшення Р0 поодиноких К(Са) каналів на 92±19% (n=5).
Одержані дані дають можливість припустити, що фенілефрин блокує карібдотоксинчутливий калієвий струм в результаті зменшення ймовірності знаходження К(Са) каналів у відкритому стані.
Аналіз та узагальнення результатів.
Нами було показано, що вихідний трансмембранний іонний струм ГМК хвостової артерії щура, викликаний деполяризуючим зміщенням від підтримуваного потенціалу –70мВ, мав поріг активації біля –40мВ . Пригнічувався блокаторами калієвих каналів. Він складався з фазного та стаціонарного компонентів. Фазний компонент був присутній в 73 % клітин. При серії деполяризацій МП до одного і того ж рівня (рис. 4. б) останній мав ймовірний характер. Фазний компонент не інактивувався при підтримуваному мембранному потенціалі –40мВ. Амплітуда й швидкість зростання її до максимуму могли змінюватися при повторних деполяризуючих стимулах. Окрім того, було помічено, що ГМК з великим вхідним компонентом трансмембранного іонного струму, мають, як правило, великої амплітуди фазний компонент вихідного струму. Всі ці характеристики наштовхнули нас на думку, що це кальційзалежний калієвий струм великої провідності. Він активується підвищенням примембранної концентрації кальцію в міоцитах в результаті його вивільнення з внутрішньоклітинних депо і входу зовні через потенціалкеровані кальцієві канали L-типу. Дійсно, в наших експериментах фазний компонент пригнічувався: 1) в безкальцієвим розчином Кребса; 2) блокуванням потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу; 3) малою концентрацією (1мМ) ТЕА; 4) 4мМ кофеїну; 5) додаванням 10мМ ЕГТА до внутрішньопіпеткового розчину.
Експерименти, проведені на поодиноких калієвих каналах, підтверджують існування К(Са) каналів в плазматичній мембрані ГМК хвостової артерії щура. Проаналізувавши залежність ймовірності відкритого стану каналу від потенціалу на мембрані, можна сказати, що головним чинником відкривання каналу є потенціал, а не концентрація примембранного Са2+ в ГМК. В наших експериментах спостерігались спонтанні вихідні струми на стаціонарному компоненті калієвого струму при потенціалах на мембрані, більших за +20мВ.
Стаціонарна інактивація компоненту струму, що залишався після пригнічення кальційзалежного калієвого струму великої провідності, задовільно описувалася больцманівською кривою з такими параметрами: коефіцієнт нахилу k=10.5 та половинна інактивація (V0.5) –45мВ. Схожі величини мали криві стаціонарних інактивацій потенціалзалежних калієвих струмів на інших об'єктах.
Тривала фіксація МП спокою на деполяризуючому рівні супроводжується активацією СВС. Проте літературні дані щодо внеска в активацію цих струмів зовнішньоклітинним та внутрішньоклітинним кальцієм протирічиві. Ми продемонстрували, що в безкальцієвому розчині Кребса та в присутності ніфедипину частота СВС зменшується відповідно на 46±7% (n=5) і 50±12% (n=5) та Q на 45±11% і 54±16% (n=3). Підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ кофеїном 1мМ викликало збільшення частоти СВС на 76±14% і Q на 26±9% (n=3).
Зміна підтримуваного потенціалу мембрани від –30мВ до –10мВ збільшувала амплітуду СВС. Частково це можна пояснити віддаленням МП від рівноважного потенціалу для іонів К+. Чи змінювалася частота СВС за цих умов, ми не можемо сказати, тому що через великий шум мембрани не можливо визначити частоту стоксів при підтримуваному потенціалі – 30мВ. Візуальне збільшення частоти СВС (рис. 8.) може бути обумовлене збільшенням амплітуди стоксів, не помітних при більш негативному потенціалі. В деяких наших експериментах деполяризація мембрани до +20мВ викликала різке зростання частоти СВС, це узгоджується з різким зростанням P0 кальційзалежних калієвих каналів великої провідності при цих потенціалах.
Механізми, якими агоністи a-адренорецепторів викликають скорочення ГМК, до кінця не вияснені. В наших експериментах досліджувалась дія фенілефрину на іонні канали плазматичної мембрани ГМК хвостової артерії щура. Ми показали, що в присутності фенілефрину пригнічується кальційзалежний калієвий струм. Дослідження, проведені нами на поодиноких кальційзалежних калієвих каналах великої провідності демонструють, що в присутності фенілефрину зменшується ймовірність відкритого стану цих каналів. Допускається, що ПКС, через яку діє фенілефрин, пригнічує ІК(Са) струм, шляхом зменшення часу перебування калієвого каналу у відкритому стані. Також в наших експериментах було показано, що фенілефрин зменшує амплітуду потенціалкерованого кальцієвого струму. Цей ефект фенілефрину блокував фентоламін, блокатор a-адренорецепторів.
Отже, фенілефрин пригнічує К(Са) струм, а це сприятиме скороченню ГМК. Проте також зменшує Са2+ струм, що, навпаки, зменшуватиме останнє.
| 
