Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ДРЕСВЯННІКОВ АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 577.352.5:577.353

Фармако-біофізична характеристика катіонних каналів плазматичної мембрани міоцитів тонкого кишечнику, активованих мускариновими холінорецепторами

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Захист відбудеться “  5 ” квітня 2005 р. о “14” годині на засіданні  спеціалізованої вченої ради

Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “ 3  ” березня 2005 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук                                Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Дослідження механізмів впливу ацетилхоліну – головного  збуджувального нейротрансмітера парасимпатичної нервової системи, що викликає скорочення гладенько-м’язових клітин (ГМК) шлунковокишкового тракту, є однією з найактуальніших проблем фізіології та фармакології гладеньких м’язів. Ефекти скорочення гладенької мускулатури, що обумовлені підвищенням внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію тісно пов’язані з деполяризацією гладеньком’язових клітин. Деполяризація плазматичної мембрани міоцитів при дії ацетилхоліну, яка є необхідною передумовою активації кальцієвих каналів L-типу, є наслідком активації неселективної катіонної провідності. Активація неселективної катіонної провідності при дії ацетилхоліну відбувається з участю низки внутрішньоклітинних посередників, головну роль серед яких відіграють гетеротримірні G-білки. Активація катіонних каналів мускаринових холінорецепторів відіграє ключову роль в процесі спряження збудження плазматичної мембрани та скорочення міоцитів. Важливу роль цього типу провідності визнано в формуванні повільних хвиль деполяризації, наявність яких є обов’язковою передумовою перистальтичних рухів шлунково-кишкового тракту. Важливим є з’ясування механізмів активації поодиноких катіонних каналів, які і формують неселективну катіонну провідність.

В ході роботи було з’ясовано, що популяція неселективних катіонних каналів, активованих мускариновими холінорецепторами, є гетерогенною та складається що найменш з трьох підтипів катіонних каналів, кожен з яких має відмінні кінетичні та амплітудні характеристики.

Актуальним було дослідження  властивостей кожного з підтипів неселективних катіонних каналів, з’ясування відносної ролі кожного з них у формуванні інтегрального трансмембранного струму, а отже і в деполяризації цілої клітини. Особлива увага в даній роботі була присвячена дослідженню кінетико-амплітудних та фармако-кінетичних властивостей катіонних каналів середньої провідності, популяція яких грає головну роль в формуванні карбахолвикликаної деполяризації ГМК. Запропонована, виходячи з аналізу експериментальних даних, кінетична модель роботи поодинокого катіонного каналу  адекватно описує  його поведінку в межах фізіологічних змін мембранного потенціалу в симетричних цезійвмісних розчинах та пояснює особливості інтегрального трансмембранного струму цілої клітини. Проведена робота по встановленню селективності, потенціалзалежності, фармакологічного впливу блокаторів на рівні поодиноких катіонних каналів (КК) мускаринових холінорецепторів значно поглиблює сучасні уявлення щодо молекулярних механізмів передачі внутрішньоклітинних сигналів  та процесів, що лежать в основі активації рецепторкерованих катіонних каналів плазматичної мембрани збудливих клітин.

Мета і завдання дослідження.

Метою роботи було з’ясувати загальні механізми холінергічного збудження  ГМК тонкого кишечнику, а також  дослідити властивості поодиноких катіонних неселективних каналів, що лежать в основі цього процесу.  Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Дослідити на рівні поодиноких каналів механізми та особливості генерації карбахолін опосередкованого збудження ГМК.
2. Визначити кількість підтипів катіонних каналів, що активуються мускариновими рецепторами в міоцитах кишечнику, та їх відносний внесок у генерацію інтегрального струму.
3. Побудувати адекватну кінетичну модель роботи поодинокого КК.
4. Дослідити фармакологічні властивості КК.
5. Дослідити амплітудно-кінетичні характеристики КК середньої провідності за умов, максимально наближених до фізіологічних.
6. Визначити  фізіологічну роль спонтанної активації КК середньої провідності.

Новизна отриманих результатів.

Всі експериментальні дані, представлені в роботі, отримані вперше. Вперше було ідентифіковано підтипи катіонних каналів плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику, що формують карбахолінактивований струм. Вперше з’ясовано, який з підтипів катіонних каналів приймає основну роль в формуванні інтегрального карбахолактивованого струму цілої клітини. Виявлено потенціалзалежність вірогідності відкритого стану катіонного каналу середньої провідності, що обумовлює спотворення форми вольт-амперної залежності інтегрального струму в діапазоні негативних значень мембранного потенціалу. Вперше на рівні поодинокого катіонного каналу показано механізм десенситизації карбахолактивованого струму. Вперше на рівні поодиноких каналів  досліджений механізм блокуючої дії двовалентних катіонів. Вперше виявлений ефект спонтанної активації катіонних каналів. Вперше на рівні поодиноких  катіонних каналів досліджений фармако-кінетичний вплив квініну, лантану та SKF96365. Вперше проведено кінетичний аналіз роботи катіонних каналів, активованих мускариновими холінорецепторами. 

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів.

Робота має в основному експериментальний характер, а отримані дані мають як теоретичне, так і практичне значення, оскільки сприяють більш глибокому розумінню процесів активації, функціонування і фізіологічної ролі катіонних каналів, активованих мускариновими холінорецепторами, а також практичне значення, оскільки в роботі досліджено функціональні зв’язки мускаринових холінорецепторів з підтипами катіонних каналів, що може мати терапевтичне значення для нормалізації функції шлунково-кишкового тракту. Очевидно, справді дієвим може виявитись досліджений в роботі фармакологічний вплив блокаторів карбахолінактивованих катіонних каналів. Виявлення ж явища спонтанної активації каналів за умов відсутності агоністів мускаринових рецепторів дозволяє більш глибоко зрозуміти причини, що лежать в основі тонічного скорочення гладеньких м’язів.

Особистий внесок.

Всі експерименти описані в дисертаційній роботі, розробка методики та виділення функціонально повноцінних міоцитів, обробка та узагальнення експериментального матеріалу були виконані особисто автором. Аналіз кінетики роботи карбахолін активованих катіонних каналів проводився спільно з співавтором публікацій д.б.н Жолосом О.В.

       В розробці концепції роботи та написанні висновків активну участь приймали інші співавтори публікацій.

Апробація роботи.

Основні положення роботи доповідались та обговорювались на Міжнародних конференціях:

British Pharmacological and Physiological Society Meeting (Manchester, UK, 2003 )

48thAnnual Biophysical Society Meeting (Baltimore,Maryland, USA, 2004)

Pavlov Centenary Symposium Integrative Physiology & Behavior(Сн.Петербург,Росія, 2004)

IBRO ADVANCED   SCHOOL OF NEUROSCIENCE "RECEPTORS, CHANNELS, MESSENGERS" (Ялта, Україна, 2004)

Публікації. Матеріали роботи опубліковані в чотирьох наукових статтях та двох тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків, списку використаних джерел із 148 найменувань та додатку. Робота викладена на 127 сторінках (без списку літератури та додатку), ілюстрована 45 рисунками та 1 таблицею.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

       Об’єкт досліджень. В дослідах використовувались морські свинки (guinea-pig) обох статей вагою 350-450 грамів. Поодинокі міоцити повздовжнього шару середньої частини ileum отримували шляхом ферментативно-механічної обробки невеличких шматочків тканини. Отримані гладеньком’язові смужки поміщалися у модифікований розчин Кребса такого складу (у ммоль/л): NaCl-120, KCl-6, CaCl2-2.5, MgCl2-1.2, D-глюкоза-12, HEPES-10 рН-7.4, після чого вони розрізалися на фрагменти довжиною 2-3 мм і переносилися в номінально безкальцієвий розчин наступного складу (у ммоль/л): NaCl-120, KCl-6, D-глюкоза-12, HEPES-10, рН-7,4. Ферментативна обробка здійснювалася при 36оС в безкальцієвому розчині з концентрацією ферментів колагенази col(1A)-1mg\ml , BSA -1mg\ml , інгібітор трипсину-1mg\ml на протязі 22-26 хвилин. Після ферментативної обробки  ГМК виділялися шляхом піпетування фрагментів тканини в  безкальцієвому розчині. Ізольовані ГМК зберігалися при температурі +4о С протягом усього експерименту.

Електрофізіологічні реєстрації. Для дослідження активності поодиноких катіонних каналів був використаний метод фіксації потенціалу в конфігурації outside-out та cell-attached. Експерименти по дослідженню інтегрального струму проводились в конфігурації whole-cell. Іонні струми реєструвалися за допомогою підсилювача фіксації потенціалу List EPC-5 (List Electronics, Germany), або Axopatch 200A (Axon Instruments, США). Для генерації імпульсів напруги, а також для реєстрації іонних струмів поодиноких катіонних каналів використовувалися АЦП-ЦАП DigiData1200 та програма pClamp 6 (Axon Instruments, Inc., США). Отримані дані фільтрувались за допомогою фільтра низьких частот з частотою зріза 1 кГц  та відцифровувались з частотою 5 кГц. Амплітуда струмів через катіонні канали розраховувалася з точкових гістограм як відстань між піками гаусіан. Аналіз кінетичних властивостей поодиноких катіонних каналів проводився  за допомогою програм pClamp  і MicroCal Origin 5.0 (MicroCal Software, США).

Розчини. Досліди проводилися переважно у симетричних цезієвих розчинах такого складу. Зовнішній розчин містив (А) CsCl – 124, D-глюкоза-12, HEPES-10, рН-7.4 (доводився за допомогою CsOH). Піпеточний розчин містив (Б) CsCl –124, MgATФ-1, D-глюкоза-12, креатин-5, HEPES-10, BAPTA-10, CaCl2-4.6, ±ГТФ-1,  pH-7.4 (доводився з використанням CsOH). Концентрація вільних іонів Са2+ складала 100 нМ. Активація катіонного струму здійснювалася  додаванням у зовнішній розчин карбахоліну 1-50(мкМ), або шляхом додавання до піпеточного розчину ГТФγS у концентрації 200μМ.

В деяких експериментах, при вивченні ефектів різних моновалентних катіонів та квазіфіологічних умов на поодинокі КК, проводилась еквімолярна заміна зовнішнього катіону, та /або додавались двовалентні катіони   Ca2+ та Mg2+.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Підтипи карбахолінактивованих катіонних каналів (КК). При дослідженні ізольованих фрагментів плазматичної мембрани ГМК тонкого кишечнику в конфігурації outside-out нами було виявлено три типи катіонних каналів з малою (10±2пСм; n=20), середньою (56±8пСм; n=27) та великою (135±14пСм; n=3) провідностями (рис.1,а) .На рис.1в представлений фрагмент реєстрації, на якому одночасно присутні всі три підтипи катіонних каналів. Відсутність кратності рівнів провідності та суттєві розбіжності в динаміко-кінетичних характеристиках струмів кожного з типів каналів (рис.1а) виключають можливість наявності одного типу каналів з різними підрівнями провідності. Вірогідність наявності активних катіонних каналів в дослідженому фрагменті мембрани при активації mIcat  карбахоліном та утворення конфігурації outside-out була 51%.  Канал з провідністю 135 пСм спостерігався лише в 6% випадків і був вкрай нестабільним. Кінетика його роботи характеризується коротким відкриванням та закриванням з високою частотою із наступним раптовим зниканням активності в перші ж хвилини після утворення конфігурації outside-out. Така нестабільна поведінка  активності каналу може бути наслідком участі в процесах його активації/деактивації  внутрішньоклітинних компонент, які швидко вимиваються після утворення  конфігурації outside-out.

    Активні канали малої провідності (10 пСм) були присутні в 40% досліджених фрагментах плазматичної мембрани, які мали канальну активність.  Але беручи до уваги їх низьку провідність та малі значення Ро =0.01-0.12 цих каналів інтегральний трансмембранний

струм, що переноситься через цей тип каналу складає лише 5%  загального трансмембранного струму. Виходячи з частоти детектування, щільності та потенціалзалежних властивостей нами було запропоновано, що основну роль у процесі формування мIcat при використанні симетричних цезієвих розчинів та фіксованої на рівні 100 нМ концентрації внутрішньоклітинного Са2+ відіграє канал із провідністю 50 пСм. Саме зміна кінетичних  та амплітудних характеристик даного типу каналу лежить в основі зміни амплітуди інтегрального трансмембранного струму активованого мускариновими агоністами . 

Властивості КК середньої провідності. Нами було досліджено  основні параметри роботи поодинокого КК, а саме амплітудні характеристики та час і потенціалзалежність вірогідності знаходження у відкритому стані (Ро). Характерною рисою КК є  значне потенціалзалежне збільшення часу відкритого стану каналу (Ро) при гіперполяризації.  Залежність Ро КК від мембранного потенціалу описується рівнянням Больцмана з V1/2=-71.17±3.2мВ та фактором крутизни k=8.1±2.3 мВ.

   Потенціалзалежність струму поодинокого КК (рис.2б)  також не є лінійною, однак ця нелінійність не здатна пояснити U-подібну форму вольт-амперної залежності  інтегрального струму, хоча потенціал реверсії як для інтегрального струму, так і для поодинокого КК, є однаковим (близько 0 мВ).

    Розрахований нами інтегральний струм через поодинокий КК, який є добутком  вірогідності відкритого стану (Ро) на амплітуду струму (рис.2в) пояснює природу U-подібної форми вольт-амперної залежності для трансмембранного струму цілої клітини з її характерною інактивацією в області від’ємних потенціалів та обумовлює зменшення провідності для струму в ділянці, близькій до 0мВ (рис.2 г,в).

Дослідження динаміки ефекту часозалежної деактивації карбахолін активованного струму в фрагментах плазматичної мембрани з 2-6 однотипними катіонними каналами середньої провідності дозволило встановити, що з часом спостерігалась тенденція до зменшення вірогідності відкритого стану n активних каналів (nРо), що є наслідком зменшення числа активних каналів та відносної стабільності Ро для поодинокого каналу (рис.3). Цей процес вочевидь обумовлює десенситизацію карбахолінактивованого струму цілої клітини.

Наступним  етапом наших досліджень був аналіз кінетики роботи поодиноких КК середньої провідності. На рис.4 представлено оригінальний фрагмент запису активності КК та гістограми розподілу відкритих та закритих станів, що описувались сумою чотирьох моноекспоненційних функцій. Побудова гістограм розподілу відкритих та закритих інтервалів з подальшим їх описанням сумою експоненціальних функцій дає можливість отримати відомості про воротні механізми роботи катіонного каналу (рис.5). Кількість експоненціальних функцій, що здатні задовільно описати амплітудну гістограму розподілу закритих (відкритих) інтервалів, відповідає кількості відкритих та закритих станів катіонного каналу. Постійні часу  експоненціальних функцій (τ) відповідають середньому часу перебування каналу в кожному з станів. Побудова кінетичних моделей роботи катіонного каналу дає уяву про кількість структурних конформацій каналформуючого протеіна, і про відносну стабільність кожної з конформацій в часі та в залежності від потенціалу на мембрані.

Так для КК середньої провідності, активованого мускариновим холінорецептором усереднені постійні часу для закритих станів складають τО1,О2,О3,О4 = 0.66мс, 4.7мс, 58.7мс, 471мс та постійними часу відкритих станів τС1,С2,С3,С4 = 0.54мс, 5.4мс, 46.6мс, 190мс з відносним відсотковим вкладом 1%, 3%, 24%, 73% -відповідно.

Вихід із довготривалого відкривання (середній час життя в якому становить >150мсек) відбувається через короткотривалу подію закривання (тривалістю < 1мсек) (рис.5А). Те ж саме спостерігається і по відношенню до довготривалих закривань, вихід з яких пов’язаний з обов’язковою реалізацією короткотривалого відкривання. Нами було з’ясовано, що додавання агоністів мускаринових рецепторів призводить до зсуву рівноваги від пар до О4-С4, а ймовірність переходів в середині пар є потенціал залежним процесом. Виходячи із запропонованої моделі, існує можливість переходу між С1-О1 парами станів без участі агоністів мускаринових рецепторів.

Спонтанна активність KK середньої провідності.  В конфігурації “ціла клітина” за відсутності агоністів мускаринових рецепторів у ГМК при підтриманому потенціалі –40мВ спостерігається вхідний струм з максимальною амплітудою до 40рА та характерною U-подібною формою вольт-амперної залежності. В дослідах коли конфігурація outside-out отримувалась за умов повної відсутності як позаклітинних (КХ), так і внутрішньоклітинних (ГТФγS) активаторів мІкат, в 10% досліджених фрагментів мембрани (n=30) можна було спостерігати спонтанноактивні КК з  низькими значеннями Ро(0.004-0.06)  та провідністю 61 пСм.

Проведений аналіз потенціалзалежності спонтанно активованих КК виявив характерну тенденцію до збільшення  Ро з деполяризацією мембрани,  значення ж активаційної кривої Ро були сильно зміщені в область позитивних потенціалів ( V1/2 =-1.8мВ ) у порівнянні з КХ-активованими КК (V1/2 =-60±8мВ). Аналіз кінетики роботи  спонтанно активованого поодинокого KK не проводився у зв’язку з вкрай малою кількістю подій. Середній час відкритого стану складав 0.47±0.01мс  при підтриманому потенціалі –40мВ. З деполяризацією плазматичної мембрани до +40мВ, Ро значно зростало. Однак, такі показники  спонтанної активності KK щонайменше в 300 разів менші за аналогічні із застосуванням субмаксимальних концентрацій агоніста.

Виходячи з раніше запропонованої схеми (рис.5), така спонтанна активність KK за відсутності агоніста пов’язана з можливістю реалізації О1-С1 пари станів, очікуваний час перебування в стані О1 дорівнює 0.5 мс, що добре корелює з отриманими експериментальними даними (0.47мс). 

Вплив двовалентних катіонів Са2+ та Mg2+ на катіонний струм  в конфігурації “whole-cell” досліджувався раніше i було встановлено, що mIcat, активований як карбахоліном так і ГТФγS в значній мірі блокувався при додаванні 2.5 мМ двовалентних катіонів розчину. Інгібуюча дія двовалентних катіонів, може бути пов’язана як з блокуванням каналу у відкритому стані, так і з екрануванням поверхневих зарядів поблизу функціонально важливих ділянок КК.

В останньому випадку можна очікувати, що ефекти Ca2+ та Mg2+ мають бути подібними. В наших дослідах було встановлено, що додавання 2,5 мМ Са2+ до зовнішнього розчину викликало зменшення амплітуди струмів з 2.90±0.23 пА до 1.75±0.14 пА при –40 мВ, або 40% блокуючої дії (n=4) (рис. 7). Додавання 2 мМ магнію також призводило до достовірного зменшення  амплітуди струмів з 2.80±0.28 пА до 1.57±0.16 пА при –40мВ (Р<0,05), але не впливало на  вірогідність відкритого стану катіонного каналу (n=3). Зменшення амплітуди струмів спостерігалось як в області негативних, так і в області позитивних потенціалів (рис.7 Б). Додавання 2,5 мМ Са2+ призводло до незначного зменшення Ро  катіонного каналу з 0.67 до 0.6, (n=3), що може бути наслідком десенситизації. Вплив двовалентних катіонів Ca2+ та Mg2+, доданих до зовнішнього розчину, на властивості КК є подібним між собою.

Властивості КК середньої провідності в умовах наближених до фізіологічних. При заміні зовнішнього цезійвмісного розчину на розчин Кребса відбувається значне зменшення як амплітуди струмів через поодинокі катіонні канали (рис.8А) - від 2±0.25 пА при –40 мВ (провідність 50±6 пСм) до 1,35±0.14 пА (провідність 34±4 пСм),

що складало 32±10 % (n=4), так і значне зменшення вірогідності перебування каналу у відкритому стані (Ро) - з 0.66 в цезієвому розчині до 0.07 (9.4 рази) (n=3) у модифікованому розчині Кребса (рис.8В).

Дослідження потенціалзалежності Ро в зовнішньому розчині Кребса (рис.8Г) виявило типове збільшення Ро з деполяризацією, значення V1/2 та k при цьому залишаються відносно стабільними V1/2 =-84±3мВ k=4.6±2мВ в цезійвмісному розчині та  V1/2 =-74±3мВ k=4.2±2мВ в розчині Кребса. Узагальнюючи отримані дані, можна зробити висновок про те, що за фізіологічних  умов вхідний натрієвий струм, що активується мускариновими рецепторами в ileum морської свинки, протікає переважно через катіонний канал  середньої провідності з Ро 0.05-0.1 та амплітудою струму 1,35±0.14 пА. Зменшення амплітуди є наслідком впливу двовалентних катіонів (рис.7), однак виходячи з оцінки вагомості впливу зменшення амплітуди та Ро КК  зрозуміло, що основну роль в цьому процесі відіграє 9 кратне зменшення Ро, яке обумовлює майже 85% зменшення інтегрального струму КК.

Селективність KK по відношенню до різних моновалентних катіонів. Проникність КК по відношенню до різних моновалентних катіонів не є однаковою, про що свідчить  зменшення КХ, та ГТФγS-активованого мІсат при заміні зовнішнього цезієвого розчину на розчин Кребса. Саме тому ми вирішили додатково дослідити властивості як інтегрального мІкат, так і поодиноких KK за умов використання різних зовнішніх  розчинів моновалентних катіонів Cs, Rb, K, Li, Na.  Для виключення ефектів різних типів калієвих каналів використовувався цезійвмісний внутрішньопіпетковий розчин, а зовнішні моновалентні  розчини містили 4мМ Cs. З’ясовано, що ряд проникності для КК є таким Rb>Cs>K>Li>Na.(рис.9А). Умовно моновалентні катіони можна розділити на дві групи перша Rb+,Cs+,K+,  для яких характерний високий рівень інтегральної провідності та друга група Li+,Na+ з низькими значеннями інтегральної провідності. Модуляція інтегрального струму цілої клітини  при заміні зовнішнього моновалентного катіона відбувається за рахунок змін Ро КК при стабільності струму поодинокого КК.

Так при заміні на натрійвмісний розчин Ро зменшилось з 0.77 до 0.06 в (12разів n=3), а амплітуда струму через КК зменшилась з 2.2пА до 1.9пА. Виявлено явище потенціаліндукованої активації вхідного струму при заміні Cs-вмісного розчину на  Rb-вмісні розчини (рис.9Б) коли значення Ро зростало з 0.002-0.05 до 0.8-0.95 при зміні мембранного потенціалу в діапазоні від -40 до 120мВ. Така потенціалзалежна активація в зовнішніх рубідійвмісних розчинах може спостерігатись навіть за умов відсутності агоністів мускаринових рецепторів.

Фармакологічні властивості мІкат на рівні поодиноких катіонних каналів.

Фармакологічні дослідження таких речовин як квінін  та SKF96365, які нині є одними з найефективніших блокаторів мІкат, досі проводилися в конфігурації “ціла клітина”, що не дає змоги встановити механізм їх блокуючої дії на поодинокий KK. Нами була проведена серія дослідів з метою виявлення впливу раніше відомих блокаторів мІкат квініну  та SKF96365  на рівні поодиноких KK. Також нами було виявлено що раніше не відомий в якості блокатора KK La3+, проявляє чітко виражений блокуючий ефект у мілімолярній концентрації.

SKF96365 не спричиняє суттєвих змін в провідності поодинокого KK, 61пСм без та 59пСм у присутності 30мкМ SKF96365, але зменшує Ро з 0.65 до 0.21. Блокуючий ефект квініну в концентрації 20мкМ та La3+ 2мМ на рівні поодиноких KK викликаний значним зменшенням  Ро каналів середньої провідності .

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Підтипи карбахолінактивованих КК у ГМК ileum морської свинки. Детальні дослідження властивостей поодиноких катіонних каналів плазматичної мембрани тонкого кишечнику, що лежать в основі карбахолінактивованої деполяризації міоцитів та їх порівняння з властивостями інтегральних струмів цілої клітини, активованих як КХ, так і ГТФγS дозволили встановити гетерогенність популяції KK. В конфігурації outside-out в ізольованому мембранному фрагменті, під впливом КХ можна було виявити три типи катіонних каналів з малою 10±2пСм, середньою 56±8пСм та великою 135±14пСм провідностями.

Всі три вище зазначенні типи KK суттєво відрізнялись як за амплітудою струму, так і за своїми кінетичними властивостями. Так канали великої провідності мали тенденцію до швидкої деактивації в перші 90 секунд після утворення конфігурації outside-out. Ефект швидкої деактивації не усувався в випадку активації цього типу KK за допомогою ГТФγS, який при додаванні у внутрішньопіпетковий розчин здатен незворотньо активувати G-білки, що приймають важливу роль в передачі сигналу від М2 підтипу мускаринового рецептора до KK. Таким чином, можна припустити, що в активації цього типу KK важливу роль відіграє певний водорозчинний вторинний месенджер, який активно вимивається при утворенні конфігурації outside-out. Беручи до уваги  малу ймовірність детектування KK великої провідності, нашу подальшу увагу ми сконцентрували на дослідженні двох інших підтипів KK в конфігурації outside-out .

Канали малої та середньої провідності стабільно реєструвались в конфігурації outside-out протягом більш ніж 20 хвилин. Це суттєво відрізняє їх від каналів великої провідності та дозволяє більш детально дослідити їх кінетико-амплітудні властивості. Іншим цікавим фактом є те, що після утворення конфігурації outside-out  в дослідженому фрагменті мембрани реєструвалось наявність декількох (2-6) каналів середньої провідності, та(або) (1-3) каналів малої провідності, або повна відсутність будь якої канальної активності (55%) досліджених фрагментів мембрани . Невисока щільність у поєднанні з явищем переважної реєстрації декількох (або жодного) KK в досліджених фрагментах мембрани свідчить про можливу кластерність розташування KK середньої провідності, або як альтернатива нерівномірність  розташування KK в плазматичній мембрані.

Визначення внеску KK різних типів у формування  інтегрального mIcat. Встановлена нами гетерогенність популяції неселективних катіонних каналів ставить питання про участь кожного з підтипів KK у формуванні КХ активованого струму цілої клітини. Нажаль, досі не виявлено  селективних блокаторів різних типів KK, тому для визначення внеску кожного з підтипів KK, нами були розраховані інтегральні струми через поодинокі KK з малою, середньою та великою провідністю. Можлива  роль каналів великої провідності 130 пСм, які до того ж мають і високі значення Ро навіть при сильній гіперполяризації, не підтвердилась аналізом інтегрального струму KK великої провідності та його порівнянням з  інтегральним струмом цілої клітини, форма інтегрального струму через поодинокий KK великої провідності майже лінійна, що погано корелює з U-подібною формою інтегрального струму цілої клітини. Однак дослідження мІсак при високому рівні цитозольного кальцію виявило значне випрямлення форми інтегрального трансмембранного струму при від’ємних потенціалах. Можливо це пов’язано з підвищенням рівня активності цього типу каналів при зростанні [Ca2+]i.

Попередньо проведена оцінка участі каналів малої провідності свідчить про незначний внесок останніх у формування інтегрального мІкат, що є наслідком як малої амплітуди поодиноких KK, малої провідності 10пСм, так і відносно малими значеннями Ро. Розрахунок інтегрального струму поодинокого KK малої провідності свідчить про те, що відносна участь його в формуванні  макроструму, активованого при активації мускаринових рецепторів, не перевищує 5% інтегрального  ефекту.

Проведений аналіз інтегрального струму поодиноких KK середньої провідності, що виявив майже повне співпадіння потенціалзалежності інтегрального струму поодинокого KK з формою вольт-амперної залежності  мІкат цілої клітини, свідчить про домінуючу роль саме  цих каналів у формуванні КХ відповіді ГМК тонкого кишечнику.

Побудова адекватної кінетичної моделі роботи поодинокого KK. Проведений аналіз  фрагментів активності КК виявив наявність що найменше чотирьох пар відкритих та закритих станів О1,О2, О3, О4, та С1, С2, С3, С4. Розрахунок кількості кінетичних станів поодинокого KK проводився шляхом виявлення кількості моноекспоненційних функцій, що задовільно описували розподіл тривалості відкритих та закритих інтервалів поодинокого катіонного каналу. Нами була виявлена висока кореляція між довготривалими відкритими і короткотривалими закритими станами, та навпаки, що дало змогу побудувати адекватну кінетичну модель взаємозв’язку між ними. Також нами було з’ясовано, що при активації субмаксимальних концентрацій КХ або у випадку активації струму ГТФγS більше 70% інтегрального струму через KK протікає за рахунок  частої реалізації довготривалих О4 станів. Час деяких поодиноких  безперервних відкривань  KK може сягати тривалості > 1 секунди, що відповідає формуванню вкрай стабільного активного комплексу (відкритий катіонний канал). Подібне явище спостерігається і коли проникним катіоном є Rb+, але ймовірно шляхи досягнення такої конформаційної перебудови канал-формуючого протеїну є різними відколи у випадку активації рубідієм стан з аномально високими значеннями Ро спостерігається нетривалий час лише при певних значеннях мембранного потенціалу. Таким чином, виникнення інтегрального мІкат внаслідок активації мускаринових рецепторів є наслідком, по-перше, зсуву рівноваги від  пар станів С1-О1 до С4-О4, що призводить до суттєвого подовження тривалості відкривань та, по-друге, загального збільшення частоти реалізації відкритих станів.  Потенціалзалежність мІкат яка відповідає за формування специфічної U-подібної форми інтегрального струму цілої клітини при негативних потенціалах, є наслідком зменшення Ро KK середньої провідності з гіперполяризацією мембрани. Залежність Ро від мембранного потенціалу добре описувалась сігмоідальною функцією, V1/2 суттєво варіювало в діапазоні від –63 до –105 мВ, середнє значення складало –83.1±1.4мВ (n=48). Провідність поодинокого KK зазнає лише незначне 20-25% збільшення при деперполяризації плазматичної мембрани з –40мВ до +40мВ.

Запропонована нами кінетична модель роботи KK є подібною до кінетичної моделі, запропонованоі раніше Кохом для описання властивостей поодиноких ВКСа каналів. Виходячи з аналізу кінетики роботи KK середньої провідності,  та порівнюючи отримані раніше дані, з добре вивченою кінетичною моделлю ВКСа  каналів, нами було запропоновано, що “горизонтальний” зсув рівноваги від короткотривалого відкритого стану О1 до довготривалих станів О3 та О4 відбувається внаслідок взаємодії з активуючим KK лігандом (в нашому випадку це ГТФα-субодиничний комплекс гетеротримерного G-білка), в  той час як “вертикальні” переходи між парами закритих–відкритих станів С1-О1, С2-О2, С3-О3, С4-О4, є потенціалзалежним стохастичним процесом. Така інтерпретація потенціалзалежних та лігандзалежних властивостей активації поодиноких KK добре корелює з даними отриманими при активації інтегрального трансмембранного струму мІкат (особливо у випадку поступової активації КК за допомогою ГТФγS), коли часозалежне збільшення провідності (збільшення кількості активованих KK) відбувається одночасно з часозалежним зсувом значень V1/2 у напрямку негативних потенціалів. Цей процесс є наслідком накопичення активних ГТФα-комплексів та підвищєння ймовірність реалізації довготривалих О4 станів КК. Зворотній ефект спостерігається в разі повільної десенситизації струму, що підтверджує раніше запропоновану гіпотезу про ГТФ залежний механізм десенситизації мІкат.

Встановлено, що кількість кінетичних компонент KK при різних рівнях мембранного потенціалу в  діапазоні від –120мВ до 0мВ є однаковою, а  також виявлена  стабільність розподілу між кінетичними станами (співвідношення площ моноекспоненційних функцій, що описують розподіл). Основні потенціалзалежні зміни відбуваються  за рахунок зменшення тривалостей  τ С1 і С2 станів при деполяризації та з відповідним збільшенням частоти та тривалості  О3 і О4 станів. Виходячи з аналізу  потенціалзалежності середнього часу “життя” катіонного каналу у відкритому та закритому станах стає зрозумілим, що в основному ефект зростання провідності інтегрального струму при деполяризації є наслідком 40-кратного зменшення  середнього часу закритого стану KK.

Запропонована нами кінетична модель адекватно описує властивості поодинокого KK середньої провідності в області від’ємних потенціалів, та дозволяє добре передбачити властивості інтегрального мІкат цілої клітини при активації мускаринових рецепторів.

Базальна активність KK середньої провідності.

Дослідження властивостей KK середньої провідності в симетричних цезійвмісних розчинах виявили можливість спонтанної  активації катіонних каналів при повній відсутності як агоністів мускаринових рецепторів, так і активаторів гетеротримерних G-білків. Властивості спонтанно активованих КК : амплітуда струму при –40 мВ становить 52пСм потенціал реверсії струму через поодинокий KK знаходиться близько до 0мВ, Ро має виражену потенціалзалежність. Залежність Ро від мембранного потенціалу має форму сигмоїдальної функції, загальне значення при 40 мВ становить  NPO=0.003, а при +40мВ NPO=0.067. Значення  V1/2, що характеризує функцію Больцмана у випадку спонтанно активованих KK дорівнює 1.8± 7.2мВ (n=3), що на 80мВ більше від значень V1/2 у випадку КХ або ГТФγS активованих KK.

Середня тривалість відкривань катіонного каналу також збільшується з деполяризаціею мембрани при –40мВ 0.97±0.01 мс (n=202) та 1.98±0.17 мс (n=1382) при +40 мВ. Частота роботи KK при цьому зростає більше ніж в 6 разів. Наявність такої спонтанної активності KK є передбаченою і відповідає наявності потенціал- або кальційзалежних короткотривалих відкритих станів О1. Зростання Ро та середнього часу відкритого стану  спонтанноактивованих KK з деполяризацією мембрани може бути наслідком потенціаліндукованого зростання афільності канал-формуючого протеїну по відношенню до ГТФα-комплексів, які, вочевидь, здатні формувати певний базальний рівень  навіть за відсутності активаторів мускаринових рецепторів. На рівні поодинокого KK це відповідає збільшенню ймовірності реалізації більш довготривалих О2 станів, що є наслідком часткової активації KK   ГТФα-комплексом. Підтвердженням такої гіпотези є досліди КХ-активованих інтегральних струмів, під час яких було виявлено, що ІС50  для карбахоліна при позитивних значеннях мембранного потенціалу у 20 разів менша, ніж при негативних потенціалах.

Іншим цікавим явищем, пов’язаним зі спонтанною активацією KK, є формування потенціаліндукованного вхідного струму, без участі активаторів мускаринових рецепторів або G-білків, за умов зовнішнього рубідійвмісного розчину. Нами було встановлено, що такий вхідний рубідієвий струм  через КК блокувався 2мМ La3+. Дослідження властивостей поодиноких KK у випадку, коли проникаючим катіоном був рубідій, виявило типову провідність (60пСм). Залежність Ро від мембранного потенціалу, яка на ділянці від -120 до -60мВ може бути описана сігмоідальною функцією, також відповідає властивостям цього типу KK. Виникнення аномально високої провідності на ділянці –60 до –100 мВ та її подальше різке зменшення при більш від’ємних потенціалах пов’язано із властивістю KK різко підвищувати Ро у вказаному вище проміжку значень мембранного потенціалу. Таке різке збільшення Ро з 0.01 при –120мВ до 0.9-0.99 при –80мВ є досить дивним та можливо пов’язане з нетиповими перебудовами конформації канал-формуючого протеїну, що імовірно є наслідком особливого впливу іонів Rb+.

Вплив двовалентних катіонів Са2+ та Mg2+ на катіонний струм у конфігурації “whole-cell” досліджувався раніше, було встановлено, що мIкат активований як карбахоліном, так і ГТФγS, у значній мірі блокувався при додаванні двовалентних катіонів до зовнішнього розчину. Інгібуюча дія двовалентних катіонів може бути пов’язана як з можливим блокуванням каналу у відкритому стані, так і з екрануванням поверхневих зарядів поблизу функціональноважливих ділянок катіонного каналу. В останньому випадку можна очікувати, що ефекти Ca2+ та Mg2+ мають бути подібні один до одного. Вплив двовалентних катіонів викликав подібне зменшення провідності поодиноких KK. У наших дослідах було встановлено, що додавання 2 мМ магнію у зовнішній розчин  призводило до ймовірного зменшення середньої амплітуди струмів з 2.80±0.28 до 1.57±0.16 пА при –40мВ (Р<0,05), але не впливало на  ймовірність відкритого стану катіонного каналу (n=3). Додавання 2.5 мМ Са2+ до зовнішнього розчину також викликало зменшення амплітуди струмів з 2.90±0.23 до 1.75±0.14 пА при –40 мВ, що забезпечувало 40% блокуючої дії (n=4). Зменшення амплітуди струмів спостерігалося  в області як негативних, так і позитивних потенціалів. Варто також зазначити, що в присутності 2.5 мМ Са2+ форма вольт-амперної характеристики струму через поодинокий катіонний канал значно відрізнялася від лінійної . Додавання 2.5 мМ Са2+ призводило лише до незначного зменшення середнього значення Ро  катіонного каналу - з 0.67 до 0.60, (n=3). Цей ефект може бути наслідком десенситизації. 

Властивості KK середньої провідності за квазіфізіологічних умов.

У фізіологічних  умовах вхідний натрієвий струм, активований через мускаринові рецептори в ileum морської свинки, передається переважно КК  середньої провідності з Ро порядку 0.05-0.1 та середньою амплітудою струму через поодинокий канал 1,35±0.14 пА при значенні мембранного потенціалу –40 мВ. Кінетичні властивості каналів дослідженого типу залежать в основному від  проникаючого катіону. Проникність KK по відношенню до різних моновалентних катіонів є різною, а модуляції інтегрального струму відбуваються за рахунок зміни Ро катіонного каналу в залежності від типу проникаючого катіону. Двовалентні катіони Ca2+ та Mg2+ у зовнішньому розчині впливають головним чином на амплітудні характеристики струмів через поодинокі катіонні канали. Йони Na+, які в фізіологічних умовах є основним проникним катіоном для KK суттєво зменшують Ро катіонного каналу у порівнянні з цезійвмісними розчинами, що і є основною причиною зменшення інтегрального струму цілої клітини в квазіфізіологічному (натрійвмісному) розчині Кребса.

ВИСНОВКИ

1. Із використанням методу фіксації потенціалу (patch-clamp) у конфігурації outside-out та cell-attached були досліджені властивості поодиноких катіонних неселективних каналів, що активуються мускариновими рецепторами в ГМК тонкого кишечнику морської свинки.
2. Встановлено, що інтегральний карбахолінактивований струм мІкат у ГМК тонкого кишечнику є сумою струмів через три типи катіонних каналів з малою (10пСм), середньою (56пСм)  та великою (135пСм)  провідностями.
3. З’ясовано, що основну роль у формуванні мІкат приймає катіонний неселективний канал середньої провідності.
4. Детально досліджено амплітудно-кінетичні властивості поодиноких КК середньої провідності, встановлено, що ключову роль у формуванні потенціалзалежних властивостей інтегрального струму цілої клітини відіграє потенціалзалежність ймовірності відкритого стану (Ро).
5. Виходячи з проведеного аналізу кінетики роботи поодинокого катіонного каналу, побудовано адекватну кінетичну модель, яка передбачає наявність чотирьох пар відкритих та закритих кінетичних станів.
6. Знайдено явище спонтанної активації KK та досліджено властивості  катіонних каналів в умовах, максимально наближених до фізіологічних.
7. На рівні поодиноких катіонних каналів досліджено блокуючий вплив раніше відомих блокаторів інтегрального мІкат (квініну, SKF96365). Знайдено, що La3+ спричиняє сильний блокуючий ефект на KK середньої провідності у ГМК тонкого кишечнику морської свинки.

Список опублікованих робіт здобувача за матеріалами дисертації.

1. А.В Дресвянніков , А.В Жолос , М.Ф Шуба . Поодинокі неселективні катіонні канали, активовані мускариновими агоністами  ГМК ileum морської свинки.Фізіологічний журнал V50 #4 ст.85-91 // 2004
2. А.В. Дресвянніков, М.Ф. Шуба, О.В. Жолос.  Методи реєстрації та аналізу активності поодиноких катіонних  каналів та  застосування їх при дослідженні неселективних катіонних  каналів, що активовуються агоністами мускаринових рецепторів. Фізика живого.V.12 #2 2004. ст.66-76
3. А.В. Дресвянніков , А.В. Жолос , М.Ф. Шуба. Властивості катіонних каналів середньої провідності котрі опосередковують  процеси холінергічного збудження міоцитів  ileum морської свинки в умовах наближених до фізіологічних. Нейрофізіологія V38 №4 ст.271-278. 2004.
4. A.V. Zholos, T.B. Bolton, A.V. Dresvyannikov, M.V. Kustov, V.V. Tsvilovskyy, M.F. Shuba. Cholinergic excitation of smooth muscle: multiple signalling pathways linking M2 and M3 muscarinic receptors to cation channels Neurophysiology V38 №5.pp.129-137 2004.

Тези доповідей.

1. Dresvyannikov A.V., Zholos A.V., Bolton T.B., Shuba M.F. (2003). Carbachol-activated monovalent cation-selective channels in the murine small intestine. Proceedings of the 2nd Kiev Symposium “Smooth Muscle Physiology and Biophysics”, 28-31 October 2003. Neurophysiology 35, p. 344.
2. Dresvyannikov A.V., Zholos A.V., Shuba M.F. (2004). Muscarinic receptor activated single cationic channel behaviour in murine ileum smooth muscle cells. Abstracts of the 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, Maryland. Biophysical Journal 86(1), Part 2, 443a.
3. Dresvyannikov A.V., Zholos A.V., Shuba M.F., Bolton T.B. (2004). The effect of Ca2+ on the behavior of single carbachol carbachol-activated cationic channels in murine gastric myocytes. Abstracts of IBRO advanced School of Neuroscience “Receptors, Channels, Messengers”, Yalta, Crimea, September 16-28, 2004.

Дресвянніков А.В. Фармако-біофізична характеристика катіонних каналів плазматичної мембрани міоцитів тонкого кишечнику, активованих мускариновими холінорецепторами.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 –біофізика. –Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2005.

За допомогою метода фіксації потенціалу в конфігурації out-sideout та cell-attached було встановлено, що карбахолактивований трансмембранний катіонний струм являє собою суму струмів через три типа катіонних каналів з малою (10пСм), середньою (56пСм) та великою (135пСм) провідностями. Встановлено, що основну роль в формуванні карбахолактивованого струму приймають канали середньої провідності. Досліджені потенціалзалежні властивості каналу середньої провідності активованого як зовнішньою аплікацією карбахоліну, так і внутрішньоклітиною аплікацією GTPγS. Встановлено, що потенціал залежна зміна імовірності відкритого стану (Ро) і амплітуди поодинокого катіонного каналу середньої провідності зумовлюють U-подібну форму вольт-амперної залежності катіонного току цілої клітини. Була проведена оцінка кінетики роботи катіонних каналів середньої провідності й розроблена адекватна модель, яка передбачає наявність не менше восьми кінетичних станів, чотирьох закритих і чотирьох відкритих, з яскраво вираженою взаємодією між ними. Сформовано чотири пари кінетичних станів і показана можливість потенціалзалежної модуляції співвідношення ймовірностей для кожної з них.

В роботі були проведені дослідження впливу двовалентних катіонів Са2+  і Mg2+, які здатні зменшувати провідність катіонного каналу. Також було досліджено проникності катіонного каналу середньої провідності по відношенню до моновалентних катіонів Li+ Rb+ K+ та Na+. З'ясовано, що моновалентні катіони здатні модулювати Ро катіонного каналу. 

Виявлено і досліджено явище агоністнезалежної, спонтанної активації даного підтипу катіонних каналів. Також вивчені їх властивості в умовах, максимально наближених до фізіологічних. Детально вивчено механізм дії блокаторів інтегрального мІкат квініна,  La3+ та SKF96365 на рівні поодиноких катіонних каналів.

Ключові слова: гладеньком‘язові клітини, катіонні канали, мускаринові холінорецептори, кінетична модель , карбахолін.