|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ПАЛІЙ Анфіса Євгеніївна
УДК 582.736.3:547.596/597:582
ТРИТЕРПЕНОВІ І ФЕНОЛЬНІ СПОЛУКИ
MELILOTOIDES CRETACEA (M. BIEB.) SOJAK
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата
біологічних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського ботанічного саду – Національного наукового центру УААН
Науковий керівник: доктор технічних наук, професор, академік УААН
Єжов Валерій Микитович,
директор Нікітського ботанічного саду –
Національного наукового центру УААН
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Паршикова Тетяна Вікторівна,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач кафедри фізіології та екології рослин
доктор біологічних наук
Курчій Богдан Олексійович,
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
старший науковий співробітник відділу росту і
розвитку рослин
Провідна установа: Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного
НАН України, м. Київ
Захист відбудеться “ 15 ” травня 2006 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “ 10 ” квітня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук
1
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Стероїди відіграють значну роль в гормональній регуляції росту і розвитку як тварин, так і рослин. Фізіологічна дія цих речовин в регуляції фізіолого-біохімічних процесів у тварин добре відома. Серед стероїдів рослинного походження найвищу біологічну активність мають брасиностероїди, які приймають активну участь у рості і розвитку рослин. Хоча вивченню брасиностероїдів в останні роки приділяється значна увага, інформація в літературі щодо їхнього синтезу і вмісту в рослинах, а також практичного застосування є фрагментарною. Речовини тритерпенової і фенольної природи здавна привертали увагу дослідників, перш за все, як ефективні фармакологічні препарати (Машковский, 1999; Hostettmann, Marston, 1995). Так, для тритерпеноїдів характерні протизапальна, алелопатична (Waller et al., 1993), антимікробна (Osbourn, 2003), інсектицидна (Tava, Odoradi, 1996), заспокійлива, імуностимулююча і антиоксидантна (Деканосидзе и др., 1984; Малыгина и др., 2003), а також протиракова (Behboudi et al., 1999) і гемолітична (Oh et al., 2000) дії.
Інший важливий клас біологічно активних речовин – флавоноїди, які проявляють Р-вітамінну, судинорозширювальну, спазмолітичну, гіпотензивну, антиоксидантну та антимікробну дії (Хаджай, 1970). Зокрема встановлений негативний вплив флавонолів на грампозитивні бактерії, флавонів і халконів – на стафілокок. Антимікробна дія відзначалася у антоцианів, ізофлавонів і катехинів (Бандюкова и др., 1987).
Терпенові й фенольні сполуки приймають активну участь в регуляції росту і розвитку рослин. Зокрема фенольні сполуки відіграють важливу роль в зміцненні клітинних оболонок, а терпенові як в стабілізації мембран рослин (Goad, 1991; Rohmer, 1988), так і руйнуванні мембран фітопатогенів (Osbourne et al., 1998).
Незважаючи на велику кількість фармацевтичних препаратів, пошуки нових речовин є актуальним завданням в зв’язку із явищем привикання. Одним із шляхів вирішення цієї проблеми є пошук необхідних речовин у рослинах. Раніше показана біологічна активність екстрактів Melіlotoіdes cretacea (M. Bіeb.) Sojak (Щербановский, Нилов, 1967; Фадеев, Голубев, 1984). Проте, хімічна природа біологічно активних речовин із цієї рослини не була встановлена. Враховуючи важливу роль цитованих вище класів сполук, нами досліджено кількісний і якісний вміст потенційно біологічно активних речовин із рослин M. cretacea.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського ботанічного саду – Національного наукового центру з 2000 по 2003 р. у рамках науково-дослідної теми "Збереження різноманіття, пошук і ефективне використання біологічних ресурсів у природних і антропогенних ландшафтах на півдні
2
України", № держреєстрації 0101U007189 (здобувачем досліджувались якісний, кількісний вміст тритерпенових і фенольних сполук, їх біологічна активність).
Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було виділити та ідентифікувати потенційні біологічно активні речовини (тритерпеноїди і флавоноїди) із різних органів рослини Melіlotoіdes cretacea (M. Bіeb.) Sojak.
Для досягнення цієї мети були поставлені таки головні задачі:
- виділити та провести скринінг на біологічну активність речовин сумарних екстрактів із коренів, листків, стебел і квіток M. cretacea протягом вегетації;
- ідентифікувати та встановити хімічну структуру тритерпеноїдів і флавоноїдів в сумарних екстрактах;
- дослідити біологічну активність речовин, отриманих хроматографічними методами.
Об'єкт дослідження. Біологічно активні речовини M. cretacea.
Предмет дослідження. Тритерпеноїди і флавоноїди M. сretacea та їх антибіотична і рістрегулююча активність.
Методи досліджень. Екстракція речовин різними розчинниками, паперова, тонкошарова і колоночна хроматографії, рідинна хроматографія високого тиску, якісний хімічний аналіз речовин, спектроскопія, метод біотестів, метод дифузії бактеріальних культур в агар з використанням стандартних дисків.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено кількісний і якісний вміст тритерпеноїдів і флавоноїдів різних органів M. cretacea. Встановлено, що корені містять найбільшу кількість тритерпеноїдів, а квітки флавоноїдів. Серед тритерпеноїдних сполук ідентифіковано олеанолову кислоту. Виявлено антимікробну активність (відносно грампозитивних і грамнегативних бактерій) тритерпенових глікозидів із коренів і флавоноїдів із квіток. Вперше із квіток M. cretacea виділено сім сполук флавоноїдної природи, серед яких ідентифіковано п’ять. Показана інгібіторна дія тритерпенів та водних екстрактів із коренів на тест-об’єкти (салат, крес-салат та редька).
Практичне значення одержаних результатів Досліджено нове джерело отримання природних сполук антимікробної і регулюючої ріст рослин дії.
Особистий внесок здобувача Особистий внесок здобувача полягає в аналізі наукової літератури, в розробці методологічних підходів щодо вирішення поставлених завдань, виконанні експериментальної роботи, встановленні якісного і кількісного вмісту тритерпенових і фенольних сполук. Дисертантом узагальнено експериментальні дані з використанням методів статистики. Разом з науковим керівником сформульовано основні положення і висновки дисертації, проведено вибір об'єктів досліджень і визначено структуру дисертаційної роботи.
3
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися й обговорювалися на I Міжнародному семінарі "Лесные биологически активне ресурсы" (Хабаровск, 2001), Міжнародній науковій конференції "Сучасні проблеми інтродукції рослин та збереження біорізноманіття екосистем" (Чернівці, 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Фізіологія рослин та екологія" (Дніпропетровськ, 2003), Міжнародній молодіжній конференції "Проблемы интродукции растений, сохранение биоразнообразия и рациональное использование растений в сельском хозяйстве" (Ялта, 2004), Всеукраїнській науково-технічній конференції студентів, аспірантів і молодих учених "Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики" (Севастополь, 2005)
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей у фахових наукових виданнях, 5 тез у матеріалах конференцій.
Структура і зміст дисертації. Дисертація містить 124 сторінки друкованого тексту і складається із вступу, 3 розділів, заключної частини, висновків, списку літератури (194 найменування).
ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили на листках, стеблах, коренях й квітках рослини Melіlotoіdes cretacea (M. Bіeb.) Sojak. Рослинну сировину відбирали на околицях с. Малого Садового Бахчисарайського району і с. Морське Судакського району Криму. Узагальнена схема досліджень приведена на рис. 1.
Тритерпенові глікозиди після випаровування спирту із сумарного екстракту обробляли бензолом, хлороформом і н-бутанолом. З н-бутанольної фракції розчинник відганяли під вакуумом і залишок очищували на колонці із силікагелем (Деканосидзе и др., 1982). Аналіз глікозидів виконували методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинках "Sіlufol". Детектування агліконів і тритерпенових глікозидів здійснювали 25%-ним спиртовим розчином фосфорновольфрамової кислоти. Олеанолову кислоту ідентифікували хроматографічно шляхом порівнювання з чистими речовинами відомої структури.
Флавоноїди екстрагували з попередньо знежиреної (петролейним ефіром і хлороформом) рослинної сировини 70% етанолом. Етанольний екстракт випаровували до водного залишку, з останнього флавоноїди екстрагували н-бутанолом (Гринкевич, 1983). Кількісний вміст фенольних сполук визначали за допомогою реакції Фоліна-Чіокальтео (Гержикова, 2002), ідентифікацію фенольних сполук проводили методами високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) (Стыскин и др., 1986), двомірної паперової хроматографії (Теслов, 2000), диференційної УФ-спектроскопії (Литвиненко и др., 1972) та якісними хімічними реакціями.
4
Рістрегулюючу дію сумарної фракції тритерпеноїдів, а також водного екстракту коренів визначали методом біотестів (Гродзинський, 1991). Тест-об’єктами слугували редька (Paphanus sativus var. radiculatus L.) сорт “Рубін”, крес-салат (Lepіdіum satіvum L.) і салат (Lactuca sativa L.) сорт “Кучерявець”.
Антибактеріальну активність водних і етанольних екстрактів, сумарних фракцій тритерпеноїдів, флавоноїдів, а також індивідуальних флавоноїдів оцінювали за діаметром зон пригнічення росту таких тест-об'єктів: Staphylococcus albus, Staphylococcus cіtreus, Streptococcus anhaemolіtіcus, Nesseria meningitides, Nesseria flava, Salmonella kauffmani, Shіgella flexnerі (Лабинская, 1978). Бактеріальні культури вирощували на агаризованих живильних середовищах у чашках Петрі за загальноприйнятими у мікробіологічних дослідженнях методами.
Статистичну обробку одержаних результатів проводили з використанням критерію Стьюдента, ймовірними вважали зміни, де Р<0,05 (Менчер, Земшман, 1986). Основні статистичні розрахунки проводили з використанням програм Mіcrosoft Excel і Statіstіca.
Рис. 1. Загальна схема проведення досліджень
5
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Динаміка кількісного і якісного вмісту тритерпеноїдів на протязі вегетації M. cretacea
Аналіз вмісту речовин в водному і етанольному екстрактах коренів, листків, стебел, і квіток M. cretacea показав, що в екстрактах з коренів присутні речовини тритерпенової природи, а в етанольному екстракті надземних органів і квіток – тритерпенові глікозиди, фенольні кислоти, флавоноїди. Сумарний вміст тритерпенових глікозидів становив у коренях M. cretacea 25 мг/г сухої речовини, у надземних органах – 5 мг/г у фазі цвітіння.
Дослідження вмісту тритерпеноїдів в етанольних екстрактах з листків, стебел і коренів M. cretacea показало, що в період активного вегетативного росту спостерігався низький вміст агліконів і глікозидів; в подальшому їх концентрація зростала, досягаючи максимуму під час цвітіння (липень), і на етапі закінчення вегетації знову знижувалась. За вмістом речовин тритерпенової природи корені й наземна частина рослини значно відрізнялись, при цьому в листках і стеблах переважали полярні сполуки. Тритерпеноїди коренів M. cretacea представлені 16 сполуками, листків – 10, стебел – 12 і квіток – 7. Загалом протягом вегетації в надземній частині рослини відзначається високий вміст тритерпенових глікозидів (69,76% від сумарного вмісту тритерпеноїдів), а в коренях – агліконів (36,24%).
Хроматографічно виявлені речовини тритерпенової природи позначено буквами латинського алфавіту в міру збільшення їх полярності (рис. 2).
а в
Рис. 2. Хроматографічний розподіл тритерпеноїдів M. cretacea в фазі цвітіння: 1) корені; 2) листки; 3) стебла; 4) квітки; 5) олеанолова кислота. Системи розчинників: а – бензол-ацетон (4:1); в – хлороформ-метанол-вода (70:30:6). Умовні позначки кольорів плям:
6
Сполуки тритерпенової природи, що мають низьку полярність, було віднесено до групи агліконів (мелілотоїдогеніни А ... F); ті що мають більшу полярність і характерні реакції, віднесено до групи тритерпенових глікозидів (мелілотоїдозиди G ... S). Протягом усієї вегетації в коренях і надземній частині були присутні мелілотоїдогеніни B і D, мелілотоїдозіди H, M, N. Для надземної маси і коренів M. cretacea характерна максимальна кількість мелілотоїдогеніну D і мелілотоїдозиду М (період цвітіння).
Тритерпенові глікозиди коренів M. cretacea
Методами ТШХ і ВЕРХ визначено шістнадцять речовин тритерпенової природи в екстрактах коренів M. cretacea. Сумарну фракцію тритерпеноїдів розділили екстракцією розчинниками різної полярності і колоночною хроматографією на фракції А ... F, G ... L, M ... P. За даними ТШХ-аналізу, фракції А...F – суміш неполярних агліконів близьких за хроматографічною рухливістю, фракція G...L містить монозиди і біозиди, що мають середню полярність; фракція M...P – полярніші тріозиди і тетразиди.
У повному кислотному гідролізаті сумарної фракції тритерпеноїдів присутні мелілотоїдогеніни A ... F і моносахариди – арабіноза, ксилоза, глюкоза, галактоза і рамноза. При хроматографічному порівнянні вільних агліконів і агліконів, одержаних у результаті гідролізу з чистими речовинами відомої структури, встановлено, що мелілотоїдогенін В є олеаноловою кислотою.
Встановлено, що в рослинах M. cretacea, зібраних одночасно у західному і східному Криму якісний, кількісний вміст тритерпеноїдів збігається. Оскільки в західному і східному районах Криму M. cretacea і види роду Melіlotus albus і Melіlotus offіcіnalіs входять до складу одних і тих рослинних угруповань, склад тритерпенових глікозидів цих видів відомий (Ходаков, Акимов, 1996), з метою уточнення можливих філогенетичних відносин між ними на наступному етапі проведено оцінку вмісту тритерпенів M. cretacea, M. albus і M. offіcіnalіs. Виявлено, що корені M. cretacea відрізняються великим розмаїттям речовин тритерпенової природи і до їх складу входять полярніші сполуки (мелілотоїдозиди N...P). Олеанолова кислота в M. albus і M. offіcіnalіs відсутня. Соясапогенолу В, присутнього у коренях представників роду Melіlotus, у M. cretacea не знайдено. Таким чином у складі тритерпенових глікозидів M. cretacea і видів роду Melіlotus подібності не виявлено, що свідчить про віддаленість цих таксонів.
Фенольні сполуки M. cretacea
В період вегетативного росту в цілій рослині містилось 5 мг/г сухої речовини фенольних сполук, у період цвітіння – 22 мг/г, у період плодоносіння – 3 мг/г. В коренях були слідові кількості фенольних сполук. Максимальну кількість цих речовин виявлено в квітках (84 мг/г). Корені,
7
стебла, листки і квітки M. cretacea істотно відрізняються за кількісним і якісним вмістом фенольних сполук (таблиця 1). Максимальний вміст цих сполук відмічено в квітках. Фенольні сполуки стебел і листків в основному представлені фенольними кислотами і незначною кількістю флавонолів. Серед фенольних сполук листків і стебел M. cretacea хроматографічним аналізом і кольоровими реакціями ідентифіковано хлорогенову кислоту і флавоноїд рутин. В той же час у етанольному екстракті переважали флавоноїди.
Таблиця 1
Сумарний вміст фенольних сполук в органах M. cretacea на різних стадіях вегетації
Флавоноїди квіток M. cretacea
Хроматографічним розподілом сумарної фракції флавоноїдів квіток M. cretacea виявлено сім сполук, які дали позитивну цианідінову реакцію. Виявлені речовини позначено буквами латинського алфавіту (в міру збільшення їх полярності) як речовини А ... G (таблиця 2). Дані аналізу ВЕРХ показали, що у спиртовому екстракті переважали С і Е речовини, при цьому А речовина представлена найменшою концентрацією.
Детальніший розподіл сумарної фракції флавоноїдів із квіток зроблено методом двовимірної хроматографії. При цьому виявлено сім речовин флавоноїдного характеру, шість з них за хроматографічною поведінкою були віднесені до глікозидів.
В повному кислотному гідролізаті сумарної фракції флавоноїдів квіток M. cretacea ідентифіковано один аглікон і два вуглеводи: глюкозу і рамнозу. Аглікон попередньо за хроматографічною поведінкою і якісними реакціями охарактеризовано як кверцетин.
За допомогою реакцій з діазотованою сульфаніловою кислотою, хлорокисом цирконію, а також диференційної УФ-спектроскопії визначено місця приєднання вуглеводних радикалів і положення фенольних оксигруп. Шляхом поетапного гідролізу з’ясовано послідовність приєднання моносахаридів.
8
За змінами у спектрах глікозидів і агліконів, зумовленими іонізуючими і комплексоутворювальними реактивами, встановлено, що в речовинах В, D, E, містяться оксигрупи у положеннях 5, 7, 3′, 4′, а вуглеводний компонент знаходиться у С3 положенні; у речовині С містяться оксигрупи в положеннях 5, 3, 3′, 4′, а вуглеводний компонент знаходиться у С7.
Таблиця 2
Деякі фізико-хімічні властивості флавоноїдів квіток M. cretacea
Примітка.
Система І: н-бутанол : оцтова кислота : вода (4:1:5); система ІІ: 15% оцтова кислота
9
Отже, у складі флавоноїдів квіток M. cretacea ідентифіковано п’ять сполук (рис. 3).
Рис. 3. Структури флавоноїдів квіток M. cretacea
1) речовина А; 2) речовина В ; 3) речовина С; 4) речовина D; 5) речовина E.
Речовина A: λmax (етанол) 368, 257 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 109 хв. За результатами УФ-спектроскопії з комплексоутворювальними й іонізуючими добавками та порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як 3,5,7,3´4´-пентагідроксифлавон (кверцетин). Це узгоджується з даними, одержаними М.Т. Ікрамовим і ін. для Lathyrus pratensis (Икрамов и др.., 1990). Дані кислотного гідролізу й УФ-спектроскопії речовин В – G дали змогу зробити висновок, що всі вони є глікозидами, похідними кверцетину.
Речовина В: λmax (етанол) 360, 256 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 74 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин і глюкоза. За результатами порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як кверцетин-3-O-глюкозид (ізокверцитрин), що узгоджується з даними, одержаними А.Л. Казаковим та співр. для Onobrychis tanaitica і O. аrenaria (Казаков и др., 1981).
Речовина С: λmax (етанол) 360, 258 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 81 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин і рамноза. За результатами порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як кверцетин-7-O-глюкозид (кверцеміритрин). Це узгоджується з даними, одержаними Н.Н. Гужевою та ін. для Astragalus lagurus (Гужева и др., 1983).
Речовина D: λmax (етанол) 360, 256 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 58 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин, глюкоза і рамноза. За результатами порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як кверцетин-3-Oглюкозил-рамнозид (рутин). Це узгоджується з даними Половинки А.Е і Шостаковської Н.Г. одержаними для Caragana aurantica (Половинка, Шостаковская, 1987).
Речовина E: λmax (етанол) 358, 256 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 62 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин і глюкоза. За результатами порівняння з чистою речовиною ві-
10
домої структури ідентифікували кверцетин 3-O-глюкозил-глюкозид, що узгоджується з даними В.Н. Ковальова, Л.М. Сірої одержаними для Glycine hispida (Ковалев, Серая, 1985).
За результатами фізико-хімічних досліджень ми припускаємо, що речовини F і G глікозидовані по 3- і 7-атому вуглецю кверцетину.
Біологічна активність сумарних препаратів тритерпенових глікозидів і флавоноїдів M. cretacea
Наступна частина наших досліджень була присвячена вивченню потенційної біологічної активності препаратів тритерпенових глікозидів і флавоноїдів із M. cretacea. Нами встановлено, що малополярна фракція тритерпенових агліконів мала невисоку антимікробну активність, у зв'язку з її слабкою розчинністю у воді, дослідження проводили з сумарною фракцією глікозидів, що мають середню і високу полярність.
Дослідження рістрегулюючої активності сумарної фракції тритерпеноїдів і водного екстракту з коренів M. cretacea показало, що тритерпенові глікозиди негативно впливають на проростання насінь і зріст коренів проростків редьки, крес-салату і салату (таблиця 3).
Таблиця 3
Вплив сумарної фракції тритерпенових глікозидів і водного екстракту з коренів M. cretacea на проростання насіння редьки, крес-салату і салату
Відсоток пророслого насіння був незмінним протягом всього експерименту в дослідах з редькою і крес-салатом. Інша картина спостерігалася при вивченні впливу сумарної фракції тритерпенових глікозидів на проростання насінь салату. У всіх варіантах досліду проростання насіння починалося через 48 годин. При цьому в контролі відсоток пророслих насінь перевищував 70%, а в
11
варіантах, оброблених речовинами із сумарної фракції тритерпеноїдів був майже в два рази менше. Через 72 години у обробленого насіння кількість пророслих насінин збільшилася.
Відсоток пригнічення росту коренів проростків залежить як від концентрації тритерпенів, так і від тривалості їхньої дії. Наприклад, для крес-салату рістінгібуючий ефект тритерпеноїдів до закінчення досліду зменшувався, тоді як для редьки і салату – збільшувався.
При обробці насіння тест-об'єктів водним екстрактом коренів M. cretacea виявлено його негативний вплив на проростання насіння редьки, салату і крес-салату, але в меншій мірі порівняно з розчинами сумарної фракції тритерпеноїдів (таблиця 4) Для редьки і крес-салату чіткої залежності проростання насіння від концентрації водного екстракту із коренів не виявлено: протягом усього періоду дослідження відсоток пророслих насінин не змінювався. У дослідах із салатом відсоток проростання насіння змінювався протягом трьох діб. Не виявлено чіткої залежності проростання насіння і росту коренів проростків від концентрації препарату.
| 
