|
Національна академія наук України
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного
МАЦЕЛЮХ АНДРІЙ БОГДАНОВИЧ
УДК 576.8.095.385
ТРАНСФОРМАЦІЯ ПРОТОПЛАСТІВ
sTREPTOMYCES GLOBISPORUS 1912 ЗА ДОПОМОГОЮ ВЕКТОРІВ, сКОНСТРУЙОВАНИХ НА ОСНОВІ ЕНДОГЕННОЇ ПЛАЗМІДИ
03.00.07 - мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2003
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі генетики мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, академік НАН України Смірнов Валерій Веніамінович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу антибіотиків
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Товкач Федір Іванович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Козировська Наталія Олексіївна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, відділ регуляторних механізмів клітини
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка Міністерства освіти України.
Захист відбудеться "17" грудня 2003 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154).
Автореферат дисертації розіслано "12" листопада 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Грампозитивні ґрунтові бактерії стрептоміцети є продуцентами більшості відомих антибіотиків, серед яких чільне місце по праву займають полікетидні сполуки з широким спектром біологічної активності. До полікетидних антибіотиків відносяться антибактеріальні (тетрацикліни, макроліди), протиракові (адріаміцин, мітраміцин), антигельмінтні (авермектин, монензин А) та імуносупресорні (рапаміцин, FK506) препарати (Hopwood, 1981). Широке застосування в клініці полікетидних антибіотиків, з одного боку, і невпинне зростання частоти мікроорганізмів і ракових клітин, резистентних до відомих лікувальних препаратів, з другого боку, стимулюють вчених на дослідження генетичного контролю біосинтезу цих сполук і конструювання рекомбінантних штамів, які синтезують модифіковані і нові полікетидні антибіотики, активні проти стійких форм бактерій і злоякісних пухлин (Hutchinson, 1995).
Штам Streptomyces globisporus 1912 синтезує новий протираковий антибіотик ландоміцин Е, який відноситься до родини ангуциклінів (Мацелюх Б.П. та ін., 1998). У даного штама виявлено плазмідну ДНК (Поліщук Л.В. та ін., 1985) і одержано ряд мутантних похідних, які відрізняються між собою споруляцією і синтезом ландоміцину Е (Мацелюх Б.П., Лаврінчук В.Я., 1999). Ці результати попередніх досліджень послужили вихідними даними для проведення наступного більш поглибленого вивчення позахромосомної ДНК у S. globisporus 1912 та його похідних штамів з метою її використання для конструювання векторних молекул і розробки системи генетичної трансформації протопластів. Створення ефективної системи клонування генів у продуцента ландоміцину Е відкриє можливість генно-інженерного конструювання високоактивних штамів-продуцентів даного і нових полікетидних антибіотиків, що є актуальною проблемою сучасної мікробіології, теоретичне і практичне значення якої не підлягає сумніву.
Зв'язок роботи з науковими програмами організації, де виконувалась дисертація. Дана робота виконувалася як окремий розділ бюджетних наукових тем відділу генетики мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України "Позахромосомна спадковість стрептоміцетів" (1996-2000, № державної реєстрації 0196V0010283) і "Генетичні і біотехнологічні аспекти синтезу біологічно активних речовин стрептоміцетами" (2001-2005, № державної реєстрації 0101V003061), а також була підтримана грантами фонду міжнародного співробітництва INTAS-Україна 95-20 "Біотехнологічне вдосконалення продуцента нового потенційного протипухлинного антибіотика" (1997-2000) і фонду фундаментальних досліджень Міністерства освіти і науки України (5.4/139).
Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи була розробка ефективної трансформаційної системи для клонування генів S. globisporus 1912 - продуцента нового протиракового полікетидного антибіотика ландоміцина Е.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:
1) виділити із міцелію вихідного штаму 1912 та його похідних мутантів сумарну плазмідну ДНК та ідентифікувати кількість і розміри індивідуальних плазмід;
2) показати можливість генетичної трансформації протопластів різних штамів S. globisporus 1912 за допомогою відомих плазмідних векторів;
3) сконструювати векторні молекули на основі резидентної і чужорідної плазмід і показати можливість їх використання для клонування фрагментів хромосоми;
4) виявити візуально ДНК в електрофоретичному гелі за допомогою флуоресцентних ціанінових фарб і показати спроможність останніх конкурувати із стандартною фарбою бромистим етидієм.
Об'єкт дослідження: штам S. globisporus 1912 - продуцент нового протиракового антибіотика ландоміцина Е та його ендогенні плазміди.
Предмет дослідження: система генетичної трансформації і клонування генів у похідних мутантів даного штаму.
Методи дослідження: мікробіологічні (вирощування культур стрептоміцетів на твердих і рідких середовищах в колбах на качалках), генетичні ( генетична трансформація протопластів), молекулярно-біологічні (виділення плазмідної ДНК, ультрацентрифугування ДНК в градієнті щільності хлористого цезію - бромистого етидію, електрофорез ДНК в агарозному гелі, рестрикційний аналіз плазмідної ДНК), генно-інженерні (конструювання рекомбінантних плазмід-векторів) і біоінформаційні (комп'ютерні програми).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблена ефективна система генетичної трансформації S. globisporus 1912 - продуцента нового протиракового антибіотика ландоміцина Е із родини ангуциклінів, яка включає злиття протопластів і плазмідну ДНК різного походження. На основі резидентної pSG1912-2 (10,3 т.п.н.) і чужорідної pDZ8 (15 т.п.н.) плазмід сконструйовано векторні молекули і показано можливість їх використання для клонування фрагмента хромосомної ДНК стрептоміцета. Показано наявність у штама 1912 та його похідних явища рестрикції-модифікації чужорідної ДНК і запропоновано спосіб його подолання при трансформації. Одержано дані про сумісність плазмідних векторів стрептоміцетів, які необхідно враховувати при клонуванні генів. Вперше показано високу ефективність флуоресцентних ціанінових фарб наглядно виявляти ДНК в електрофоретичному гелі і конкурувати з широко вживаним і мутагенним бромистим етидієм.
Практичне значення одержаних результатів. Система трансформації протопластів S. globisporus 1912 за допомогою плазмідних векторів відкриває можливість клонування генів біосинтезу антибіотика ландоміцину Е і конструювання рекомбінантних штамів - високоактивних продуцентів даного і нових модифікованих або гібридних полікетидних антибіотиків. Результати роботи можуть використовуватися на кафедрі генетики і біотехнології Львівського національного університету ім. І. Франка для науково-дослідних і навчальних цілей. Висока здатність флуоресцентних ціанінових фарб виявляти в електрофоретичному гелі ДНК запропонована для широкого використання в лабораторних дослідженнях замість традиційного бромистого етидію, який характеризується високою мутагенною і канцерогенною активністю і є небезпечним для здоров'я дослідників.
Особистий внесок здобувача. Пошук та аналіз літературних даних і весь об'єм досліджень виконані автором особисто: виділення та очистка плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі, переварювання ДНК рестриктазами, конструювання рекомбінантних плазмід і трансформація протопластів. Мутантні штами - похідні S. globisporus 1912, отримані з музею відділу генетики мікроорганізмів. Флуоресцентні ціанінові фарби надані С.М. Ярмолюком (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України). Напрям наукової роботи, аналіз та обговорення одержаних результатів проведені за участю наукового керівника.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на ІІ з'їзді Товариства мікробіологів України (Чернігів, 2001), 10-му Європейському конгресі з біотехнології (Мадрід, 2001), конференціях молодих вчених Інституту мікробіології і вірусології НАН України (2000, 2001).
Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в 5-ти наукових статтях у профільних наукових журналах.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, аналізу і узагальнення результатів, висновків і списку використаних джерел, що охоплює 219 найменувань. Дисертацію викладено на 127 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 36 рисунками та 14 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження.
Штами бактерій та плазміди. У роботі використано штами S. globisporus 1912 та його похідні мутанти 3-1, 3-2, А1, А2, Б1, Б2, RS1, Streptomyces levoris 165, Streptomyces sp. 8, Streptomyces lividans TK24, а також векторні плазміди pWHM4, pGM160, pIJ487, pCNB4001. Плазміди pSG1912-1, pSG1912-2, pSG1912-3, pSG1912-4, pSG1912-5, pDZ8 і pDZ9 виділені і сконструйовані в даній роботі.
Середовища. Для зберігання культур стрептоміцетів і синтезу антибіотиків використовувалося соєве середовище (г/л): соєве борошно - 20, NaCl - 5, глюкоза - 10, агар - 15, рН до стерилізації - 7,2. Модифіковане середовище S (г/л: K2HPO4 - 2, MgSO4.7H2O - 0,5, дріжджовий екстракт і пептон Difco - по 4, глюкоза - 10, рН до стерилізації - 7,2) використовували для вирощування міцелію в колбах на качалках при одержанні протопластів і виділенні ДНК плазмід. Буфер Р і середовище R2YE (Kieser et al., 2000) застосовували для одержання і регенерації протопластів.
Виділення та очистка плазмідної ДНК. Плазмідну ДНК виділяли за лужним методом (Kieser et al., 2000) і зберігали в стерильному ТЕ-буфері. Ультрацентрифугування ДНК в східчастому градієнті хлористого цезію в присутності бромистого етидію проводили за Dorin a. Bornecque (1995).
Електрофорез ДНК в агарозному гелі виконували згідно стандартної методики (Sambrook et al., 1989). Виділння плазмідної ДНК із вирізаних блоків агарозного гелю здійснювали за допомогою електрофорезу в діалізному мішочку (електроелюція) за загальновживаним методом (Маниатис и др., 1984).
Переварювання ДНК рестриктазами і конструювання рекомбінантних плазмід. Переварювання ДНК ендонуклеазами рестрикції, очищення одержаних фрагментів та їх лігування за допомогою лігази фага Т4 проводили згідно керівництву (Маниатис и др., 1984). В роботі використовували лігазу фага Т4 та рестриктази фірми МВІ Fermentas, Литва.
Трансформація протопластів. Протопласти із дводобового міцелію, вирощеного в середовищі S в колбах на качалках, одержували за загальноприйнятою методикою (Kieser et al., 2000) і зберігали в буфері Р по 150 мкл в Еппендорфових пробірках при - 200С. Трансформацію протопластів за допомогою ДНК різних плазмідних векторів здійснювали за вищенаведеною методикою. Селекцію трансформантів проводили після 24 г інкубації протопластів на твердому регенераційному середовищі за допомогою тіострептону в напіврідкому соєвому агарі, концентрація якого становила 10 мкг/мл в загальному об'ємі середовища.
Флуоресцентні ціанінові фарби, синтезовані в Інституті молекулярної біології і генетики та в Інституті органічної хімії НАН України, одержані від С.М. Ярмолюка. Сухі фарби розчиняли в диметилсульфоксиді ("Serva") в концентрації 2-4 мг/мл і зберігали в холодильнику при 4оС. Робочі розчини фарб виготовляли в дистильованій воді в концентрації 1 мкг/мл безпосередньо перед використанням.
Комп'ютерні програми. Фотографії гелів, що містили смуги пофарбованої ДНК, сканували за допомогою HP ScanJet 4200C та інтенсивність флуоресценції смуг ДНК оцінювали за комп'ютерною програмою Total Lab 1-D version 1.11 from Phoretix of © 1996-2000 Nonlinear Dynamics LTD. Рестрикційні карти плазмід на основі одиноких і подвійних переварів ДНК ендонуклеазами рестрикції конструювали за допомогою комп'ютерної програми "Double Digester".
Результати досліджень та їх обговорення.
1. Використання поліметинових ціанінових фарб для візуального спостереження ДНК в агарозному гелі. Найбільш вживаною флуоресцентною фарбою для виявлення ДНК в агарозному гелі є бромистий етидій, який має мутагенну і канцерогенну активність (McCann et al., 1975) , підвищує генотоксичність УФ-опромінення і хімічних мутагенів у E. coli (Ohta et al., 2001). Тому сьогодні вчені стараються замінити небезпечний для здоров'я бромистий етидій іншими флуоресцентними фарбами із групи ціанінових сполук. Метою даного етапу роботи був пошук найбільш ефективних ціанінових фарб для детекції ДНК в електрофоретичному гелі. Хімічна структура 4-х найбільш ефективних із 15-ти досліджених фарб приведена в таблиці 1.
Для фарбування використовували ковалентно замкнену кільцеву (КЗК) і лінійну двоспіральну ДНК стрептоміцетної плазміди pDZ9 (5 т.п.н.), а також HindIII-фрагменти ДНК фага λ. Як видно на рисунку 1, ціанінова фарба CPent V майже з однаковою інтенсивністю викликає флуоресценцію суперспіралізованої і лінійної плазмідної ДНК, а також добре виявляє всі шість HindIII-фрагментів ДНК фага λ розмірами від 23170 до 2027 пар основ, що відповідає від 76 до 6 нг ДНК. Бромистий етидій був 1,2 - 1,4 і 1,0 - 1,6 раз більш ефективним у фарбуванні ДНК в порівнянні з ціаніновими фарбами CPent V і CCyan 2-O відповідно (табл. 2).
Перевага бромистого етидію над ціаніновими фарбами спостерігалася при менших концентраціях ДНК, тобто при виявленні малих фрагментів розмірами 2020 - 4361 п.о., що відповідає 6 - 21 нг ДНК. Концентрація ДНК вище 30 нг у смузі гелю краще флуоресціює в комплексі з CCyan 2-O, ніж з бромистим етидієм.
Таблиця 1
Хімічна структура використаних ціанінових фарб
Рис. 1. Електрофореграма pDZ9 і λ ДНК, пофарбованих ціаніновими фарбами і бромистим етидієм: 1, 4, 7, 10 - pDZ9 (КЗК); 2, 5, 8, 11 - pDZ9+KpnI (лінійна форма); 3, 6, 9, 12 - λ+HindIII. Зелений (1-9) та оранжевий (10-12) фільтри. 1-3 - D-9; 4-6 - D-6; 7-9 - CPent V; 10-12 - EtBr
Таблиця 2
Значення флуоресценції λ-HindIII-фрагментів ДНК,
пофарбованої CPentV, CCyan2-O і EtBr
Таким чином, ціанінові фарби CPent V і CCyan 2-O проявляють високу ефективність у фарбуванні ДНК різних конформаційних станів і розмірів, конкуруючи із стандартним і небезпечним бромистим етидієм. Дані фарби проявляють слабу мутагенну активність і тому їх можна рекомендувати для використання в лабораторних дослідженнях при виявленні ДНК в агарозних гелях.
2. Виділення і рестрикційний аналіз двох плазмід S. globisporus 1912. Виходячи із важливої біологічної активності ландоміцину Е як перспективного протиракового препарату, великий науковий і практичний інтерес представляла розробка генно-інженерних підходів для дослідження генетичного контролю біосинтезу даного антибіотика і створення ефективної біотехнології одержання останнього, а також нових полікетидних препаратів. Одним із методів, який лежить в основі генетичної інженерії, є введення рекомбінантної ДНК в клітини реципієнта шляхом генетичної трансформації. Оскільки генетична трансформація протопластів за допомогою плазмідної ДНК на моделі S. globisporus 1912 до сих пір не вивчалася, то одним із найперших і важливих завдань дисертаційної роботи було більш досконале дослідження кількості і розмірів ендогенних плазмід, що успадковуються вихідним штамом 1912 та його похідними мутантами 3-1, 3-2, А1, А2, Б1, Б2 і RS1, які відрізняються між собою морфологією колоній, рівнями споруляції і утворення антибіотика (рис. 2).
Рис. 2. Колонії штамів (7 діб): а - 1912; б - 3-2; в - 3-1; г - А1; д - А2; е - RS1
Штам 1912 добре спорулює на твердому соєвому середовищі, утворює ландоміцин Е в незначній кількості і спонтанно дисоціює на 3 типи колоній: спорулюючі, слабоспорулюючі і аспорогенні. Штам 3-1 не утворює спор і синтезує ландоміцин Е у великій кількості (300 мг/л), стабільно успадковуючи обидві ознаки. Штам 3-2 є стабільним слабоспорулюючим і слабоактивним спонтанним мутантом. Штами А1, А2 і Б1 не спорулюють і не синтезують ландоміцину Е, вони одержані при обробці протопластів штама 3-1 нітрозогуанідином і стабільно зберігають свої властивості. Штам Б1 має протяжну делецію в межах пучка генів біосинтезу ландоміцину Е (Федоренко В.О. та ін., 2000). Колонії штаму RS1 добре спорулюють і не утворюють ландоміцину Е, вони виділені на фоні суцільного лізису газону при індукції дефектного профага.
Сумарна плазмідна ДНК, виділена за лужним методом Кайзера і очищена центрифугуванням в градієнті щільності хлористого цезію, утворює в електрофоретичному гелі чотири (штами 1912 і 3-2) або дві (штам 3-1) смуги. Смуги штаму 3-1 утворені суперспіралізованими (КЗК, нижня) та відкритими кільцевими (ВК, верхня) молекулами меншої за розмірами плазміди pSG1912-1 (рис. 3). Вихідний штам 1912 містить дві плазміди - pSG1912-1 (а, в) та pSG1912-2 (смуги б, г), які представлені двома конформаційними станами - КЗК та ВК. Висновок про наявність двох плазмід у вихідному 1912 та 3-2 штамах був підтверджений даними електрофорезу сумарної плазмідної ДНК без попереднього очищення ультрацентрифугуванням в градієнті щільності. Після електрофорезу така ДНК в агарозному гелі утворює дві смуги, які були виділені із вирізаних блоків електроелюцією і повторно досліджені за допомогою електрофорезу в гелі (рис. 4).
Рис. 3. Електрофореграма плазмід, виділених із штамів 1912 (1), 3-2 (2) і 3-1 (3): а - pSG1912-1 (КЗК); б - pSG1912-2 (КЗК); в - pSG1912-1 (BK); г - pSG1912-2 (BK)
Рис. 4. Електрофореграма плазмідної ДНК, виділеної із штаму 1912 (пояснення в тексті)
ДНК pSG1912-1, виділена із нижньої зони агарозного гелю (доріжки 1-4, н), при повторному електрофорезі утворює дві смуги (доріжки 5, 6) - КЗК і ВК. ДНК плазміди pSG1912-2 із верхньої зони гелю (доріжки 1-4, в) при повторному електрофорезі утворює також дві смуги, розташовані вище смуг попередньої плазміди (доріжки 7, 8) і представлені двома конформаційними станами більшої плазміди. Припущення про наявність двох плазмід в різних конформаційних станах були остаточно підтверджені даними наступного рестрикційного аналізу. Як видно на рис. 5, препарати ДНК нижньої зони дають аналогічні за розмірами і кількістю фрагменти ДНК після рестрикції, що свідчить про їх належність до меншої плазміди pSG1912-1. Ця плазміда має один сайт рестрикції для SacI, перетворюючись після переварювання в лінійну молекулу розміром 10,3 т.п.н. (доріжки 3, 14). Препарати ДНК із верхньої зони агарозного гелю дають ідентичну картину рестрикції в повторних дослідах, яка чітко відрізняється від результатів переварювання плазміди pSG1912-1 (доріжки 7-10). Рестриктаза BglII викликає появу одного фрагмента ДНК розміром 19,5 т.п.н. (доріжка 7). Рестриктаза SacI розщеплює молекулу плазміди у трьох сайтах (доріжка 9 ), які відсутні у меншої плазміди. Отже, немає сумніву, що ДНК із верхньої зони агарозного гелю належить іншій і більшій плазміді pSG1912-2.
Рис. 5. Електрофореграма плазмід, оброблених рестриктазами: 1-5 - суміш ДНК з нижньої смуги штамів 3-2 і 3-1; 6 - λ + НіndIII; 7- 11 - ДНК з верхньої смуги штаму 1912; 12-15 - ДНК з нижньої смуги штаму 1912. Рестриктази: BglII - 1, 7, 12; PvuII - 2, 8, 13; SacI - 3, 9, 14; KpnI - 15; SacI + KpnI - 4, 10; контроль - 5, 11
Розміри фрагментів рестрикції обох плазмід приведені в табл. 3. Плазміди pSG1912-1 i pSG1912-2 представлені 10 і 5 копіями на хромосому відповідно.
Таблиця 3
Розміри фрагментів рестрикції ДНК плазмід (т.п.н.)
3. Трансформація штамів S. globisporus 1912 за допомогою плазмідних векторів. Хоча явище генетичної трансформації досить поширене серед стрептоміцетів, ряд штамів різних видів мають ефективну систему рестрикції-модифікації для захисту від проникнення в клітини чужорідної ДНК. Тому важливим етапом роботи була перевірка здатності протопластів різних штамів - похідних S. globisporus 1912 трансформуватися чотирма відомими плазмідними векторами - pIJ487 (6,2 т.п.н.), pGM160 (7,7 т.п.н.), pWHM4 (6,6 т.п.н.) і pCNB4001 (17 т.п.н.). Всі чотири вектори підтримувалися і накопичувалися перед виділенням в S. lividans TK24, позбавленому рестрикційного самозахисту. Цей штам без наявності плазмід служив у наших дослідах надійним контролем. Всі використані вектори несуть ген резистентності до тіострептону, який використовувався в ролі селективного маркера. В табл. 4 приведена частота трансформації протопластів різних штамів за допомогою ДНК векторів. Частота трансформації протопластів усіх штамів препаратами ДНК трьох векторів pIJ487, pGM160 і pWHM4 була низькою і становила від 6 до 64 колоній на чашку з тіострептоном (10 мкг/мл) в регенераційному середовищі. Концентрація ДНК векторів, внесеної до 200 мкл суспензії протопластів (109/мл) коливалася в межах 1-2 мкг.
Таблиця 4
Частота трансформації штамів S. globisporus 1912
(число тіострептонрезистентних колоній на чашку)
Примітка: НВ – не визначалася; в знаменнику – частота повторної трансформації після використання ДНК вектора, виділеної із первинних трансформантів (чисельник); середні дані із 3-х дослідів
Розсівали п'яту частину суміші протопластів на чашки. Ефективність трансформації протопластів S. lividans TK24 за допомогою векторів pIJ487 (внутрішній методичний контроль) і pWHM4 була на 2-3 порядки вищою в порівнянні з частотою трансформації похідних штама 1912, що вказує на наявність в останніх рестрикційного бар'єру на шляху проникнення чужорідної ДНК в клітини. Вектор pCNB4001, який має реплікон резидентної плазміди pSG1912-1, трансформував протопласти різних штамів S. globisporus 1912 з високою частотою, оскільки він уникав рестрикції в клітинах господаря. Препарати ДНК плазміди pWHM4, виділені із міцелію трансформантів штаму А2, викликали високу частоту повторної трансформації протопластів цього самого штаму і штаму Б1. Таке підвищення частоти трансформації на 2-3 порядки препаратами ДНК того самого вектора, тільки виділеного із клітин первинних трансформантів, де він зазнав змін, може вказувати на наявність системи рестрикції-модифікації у всіх досліджених штамів S. globisporus 1912. Для підтвердження трансформаційної природи резистентності до тіострептону із міцелію трансформантів виділена плазмідна ДНК, яка в одному випадку була подібна за розмірами до вектора pWHM4 (рис. 6, доріжки 1-8), а в іншому - відрізнялася від вихідного вектора pGM160 меншими розмірами (доріжки 9-14). Молекули останнього вектора найбільш імовірно зазнали в клітинах реципієнта перебудови за рахунок рекомбінаційних процесів. Виділені плазміди стабільно зберігаються в клітинах трансформантів після багаторазових пересівів у відсутності селективного тиску.
Рис. 6. Електрофореграма плазмідної ДНК із Tsr-трансформантів. Доріжки 8 і 14 -
ДНК векторів pWHM4 i pGM160 відповідно
Таким чином, у похідних штама S. globisporus 1912 виявлено явище рестрикції-модифікації чужорідної ДНК, яке є перепоною на шляху проникнення трансформаційної ДНК в протопласти. Показана можливість подолання цього бар'єру двома способами: 1) використанням вектора, сконструйованого на основі реплікону ендогенної плазміди; 2) використанням чужорідних векторів, виділених із первинних трансформантів, в яких вони зазнали модифікації.
Важливими ознаками плазмід, які необхідно враховувати при трансформації протопластів стрептоміцетів, є їхня сумісність в клітині господаря. В ролі реципієнтів ми використовували штами 3-1 і 3-2, які успадковують одну і обидві ендогенні плазміди відповідно. Трансформанти штама 3-2, одержані за допомогою вектора pIJ487 (реплікон плазміди pIJ101), стабільно успадковують останній і меншу резидентну плазміду pSG1912-1, що вказує на сумісність цих плазмід і несумісність pSG1912-2 і pIJ487 (рис. 7). Плазміда pCNB4001 також не може співіснувати із pSG1912-1, оскільки обидві плазміди мають спільний реплікон. Плазміда pWHM4 не сумісна з pSG1912-1, витісняючи останню із міцелію трансформантів штама 3-1.
Отже, в даному розділі вперше показана можливість ефективної генетичної трансформації протопластів різних похідних S. globisporus 1912 плазмідними векторами, наявність системи рестрикції-модифікації чужорідної ДНК у даного штаму та способи її подолання, а також одержані дані про сумісність резидентних плазмід з деякими відомими плазмідами стрептоміцетів. Результати цих досліджень відкривають можливість для проведення наступного етапу роботи -
Рис. 7. Сумісність плазмід: 1 - pSG1912-1 і pSG1912-2 (штам 3-2); 2 - pIJ487 і
pSG1912-1 (трансформант штама 3-2); 3-7 - pCNB4001 (трансформанти
штаму 3-1); 8 - pCNB4001 (контроль); 10-14 - pWHM4 (трансформанти
штаму 3-1)
конструювання ефективної системи вектор-господар на основі ендогенної плазміди і протопластів продуцента ландоміцину, необхідної для клонування генів біосинтезу даного антибіотика і створення високоактивних продуцентів останнього.
4. Клонування гена резистентності до тіострептону на плазмідах стрептоміцетів. Система рестрикції-модифікації чужорідної ДНК при генетичній трансформації штамів S. globisporus 1912 є бар'єром на шляху перенесення генів, якого можна уникнути за допомогою використання векторів, сконструйованих на основі резидентної плазміди. На даному етапі роботи була вибрана менша плазміда pSG1912-1 як можливий кандидат на роль векторної молекули. Чужорідна плазміда pDZ8 також була використана для конструювання вектора. З цією метою ген резистентності до тіострептону, який кодує метилазу 23S рибосомальної РНК у стрептоміцетів і служить надійним селективним маркером, необхідно було перенести із плазміди pIJ487 в молекули двох названих вище плазмід. ДНК плазміди pIJ487 переварювали рестриктазою BclI, яка розрізає її молекулу в 5-ти сайтах, утворюючи стільки ж фрагментів ДНК розмірами більше 1 т.п.н., в тому числі фрагмент з геном резистентності до тіострептону (tsr). Плазміди pSG1912-1 і pDZ8 також переварювали даною рестриктазою і, крім цього, ще рестриктазами BglII і BamHI. Всі три рестриктази утворюють липкі кінці на фрагментах ДНК, придатні для лігування. Як видно на рис. 8, після обробки pIJ487 рестриктазою BclI виникає багато смуг в гелі (доріжка 1), із якого за допомогою електроелюції виділяли фрагменти розміром 1-2 т.п.н. Рестриктаза BglII утворює великий фрагмент плазміди pSG1912-1 (доріжка 6) і лінійну молекулу плазміди pDZ8 (доріжка 9), як і рестриктаза BamHI (доріжка 11).
Рис. 8. Електрофореграма фрагментів рестрикції ДНК вихідних плазмід:
1 - pIJ487 + BclI; 2 - pIJ487 (контроль); 3 - pSG1912-1 + BamHI;
4 - pSG1912-1 + BclI; 5 - pSG1912-1 (контроль); 6 - pSG1912-1 +
BglII; 7 - л + HindIII; 8 - pSG1912-1 + KpnI; 9 - pDZ8 + BglII;
10 - pDZ8 (контроль); 11 - pDZ8 + BamHI; 12 - pDZ8 + BclI
Після лігування BclI-фрагментів плазміди pIJ487 із BglII- і BamHI-фрагментами pSG1912-I і pZD8 одержані препарати ДНК використовували для трансформації протопластів безплазмідного і антибіотиконеактивного штаму А2. Як видно з даних, приведених в таблиці 5, найбільше Tsr-трансформантів виникло під впливом рекомбінантних ДНК, що містили BglII-фрагменти обох плазмід. Вісім із 13-ти виділених трансформантів повторно перевіряли на наявність плазмідної ДНК після кількаразових пересівів на агаризоване соєве і S середовища без селективного фактору. В усіх трансформантів виявлена плазмідна ДНК, яка ними стабільно успадковується. Розміри рекомбінантних плазмід pSG1912-3 і pDZ9, визначені за допомогою одинарних (рис. 9) і подвійних переварювань рестриктазами, становлять 8,9 і 5,3 т.п.н. відповідно. Побудовані попередні рестрикційні карти даних плазмід. Плазміда pSG1912-3 має одинарні сайти впізнавання для рестриктаз BclI, EcoRI i PstI, які можуть бути використані для клонування генів. Плазміда pDZ9 (5,3 т.п.н.) має значно менші розміри в порівнянні з вихідною плазмідою (14,6 т.п.н.), що може вказувати на її рекомбінаційну перебудову в клітинах трансформантів.
Таблиця 5
Кількість Tsr-трансформантів S. globisporus A2
* Примітка. В усіх варіантах дослідів вказані фрагменти ДНК
лігувалися з BclI-фрагментами pIJ487.
Рис. 9. Електрофореграма рекомбінантних плазмід pSG1912-3
(1-5) і pDZ9 (7-11). Рестриктази: 2, 7 - BclI; 3, 8 - BglII;
4, 9 - KpnI; 5, 10 - SacI; 1, 11 - контроль; 6 - λ + HindIII
Така редукована рекомбінантна плазміда стабільно зберігається в клітинах нового господаря. Вона має одинарні сайти впізнавання для рестриктаз KpnI i BclI, які можна використовувати для клонування генів. Обидві рекомбінантні плазміди з високою частотою (біля 104 на 1 мкг ДНК) трансформували протопласти штама А2. Із міцелію Tsr-трансформантів виділена плазмідна ДНК, ідентична вихідним рекомбінантним плазмідам pSG1912-3 i pDZ9.
Із іншого тіострептонрезистентного трансформанта при клонуванні гена tsr на плазміді pSG1912-1 виділена рекомбінантна плазміда pSG1912-4 (8 т.п.н.), яка також стабільно успадковується в клітинах трансформантів у відсутності селективного тиску, втратила сайт рестрикції до BglII після забудови в нього лінійного фрагменту гена tsr з липкими BclII-кінцями, зберігши унікальний сайт впізнавання для SacI. Цей сайт був використаний для клонування фрагмента хромосоми S. globisporus 3-1 після її обробки рестриктазою SacI. Для клонування були відібрані із гелю фрагменти хромосоми розмірами 6-8 т.п.н. Після лігування SacI-фрагментів вектора і хромосоми суміш ДНК використовували для трансформації протопластів штама А2. На регенераційному селективному середовищі виросло біля тисячі колоній, із яких відібрано 30 клонів для перевірки на наявність вставок хромосомної ДНК у векторній молекулі. У двох трансформантів виявлено рекомбінантну плазмідну ДНК більших розмірів у порівнянні із вектором pSG1912-4 (рис. 10), рестрикційний аналіз якої показав наявність в її складі клонованого фрагменту хромосоми розміром 7 т.п.н. (рис. 11).
Рис. 10. Електрофореграма рекомбінантних (1, 2) і векторної pSG1912-4 (3)
плазмід
Рис. 11. Електрофореграма фрагментів рестрикції рекомбінантної плазміди:
1 - PvuII; 2 - л + HindIII; 3 - SacI; 4 - KpnI; 5 - pSG1912-5 (контроль)
Таким чином, в даній роботі показана принципова можливість використання плазміди pSG1912-4 в ролі вектора для клонування генів S. globisporus 1912. Розмір фрагмента хромосомної ДНК, який може бути забудований в молекулу вектора і стабільно підтримуватися в міцелії господаря, становить принаймні 7 т.п.н.
| 
