|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
ОНИЩЕНКО ОЛЬГА МИХАЙЛІВНА
УДК 579.68+579.264
ТАКСОНОМІЯ І АНТИБІОТИЧНА АКТИВНІСТЬ ALTEROMONAS-ПОДІБНИХ БАКТЕРІЙ ЧОРНОГО МОРЯ
03.00.07 – мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.
Науковий керівник: академік НАН України, професор Смірнов Валерій Веніамінович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу антибіотиків, директор Інституту
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Романовська Вікторія Олександрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів кандидат біологічних наук, доцент Сергійчук Михайло Гордійович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра мікробіології та загальної імунології
Провідна установа: Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова
Захист відбудеться “22” січня 2003 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Заболотного, 154.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Заболотного, 154.
Автореферат дисертації розіслано “____” грудня 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник Пуріш Л.М.
Актуальність проблеми. Мікроорганізми є важливою складовою частиною морських екосистем. Серед метаболітів морських бактерій знайдено унікальні ферменти, цитотоксини, антибіотики. За останнє десятиліття досягнуті значні успіхи у вивченні мікроорганізмів світового океану, але систематичне положення та біологічні властивості мікрофлори Чорного моря досліджені недостатньо. Мікробіологічні дослідження Чорного моря мають більше як сторічну історію, але накопичений в цій галузі матеріал потребує ревізії з позицій сучасної систематики.
Останнім часом процес антропогенного впливу на екосистеми Чорного моря досягнув критичного рівня і став реальною загрозою для біорізноманіття цього басейну. Як один з екологічно “гарячих пунктів” на карті світового океану, Чорне море звернуло на себе увагу ООН. Зусиллями 42 учених з причорноморських країн створена Червона книга Чорного моря. Однак це лише початковий етап дослідження та захисту його біорізноманіття. Особливої уваги заслуговують практично не вивчені галофільні мікроорганізми цього регіону, серед яких особливе місце займають Alteromonas-подібні бактерії. До їх складу входять фенотипово і філогенетично близькі мікроорганізми родів Alteromonas, Pseudoalteromonas, Marinomonas та Shewanella. Alteromonas-подібні бактерії – грамнегативні аеробні галофільні неферментуючі, рухливі за допомогою одного полярного джгутика паличковидні форми – відзначаються високою ферментативною активністю (Alteromonas), продукцією різних антибіотичних речовин (Pseudoalteromonas), а також участю в кругообігу речовин та самоочищенні моря (Shewanella). Крім того, ці мікроорганізми є індикаторами чистоти акваторії, важливими компонентами біорізноманіття та перспективними продуцентами біологічно активних сполук.
Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконана згідно планів науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України та була включена в програму “Підтримка та розвиток Української Колекції Мікроорганізмів”. Частина роботи виконувалась за підтримки INTAS в рамках міжнародного проекту № YSF 01/1-0001.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – ізоляція та дослідження Alteromonas-подібних бактерій Чорного моря, вивчення їх таксономічної структури і антибіотичної активності.
Згідно наявної мети необхідним було вирішення наступних завдань:
- виділити грамнегативні еубактерії з води, безхребетних і водоростей Чорного моря;
- розробити схему селективного відбору для створення колекції Alteromonas-подібних бактерій;
- вивчити широкий спектр фенотипових властивостей ізолятів і створити базу для нумеричного аналізу;
- здійснити їх попередню ідентифікацію на основі нумеричноі класифікації;
- провести молекулярно-генетичний аналіз штамів морських бактерій (ПЛР-ампліфікація та сіквенс 16S рРНК);
- встановити їх родову (а при можливості видову) належність;
- вивчити антагоністичні властивості Alteromonas-подібних бактерій, дослідити антибіотичну активність культуральних рідин та клітинних екстрактів щодо спектру грамнегативних і грампозитивних патогенних та умовно патогенних бактерій, дріжджів, фітопатогенних грибів, а також ціанобактерій.
Обўєктом дослідження були бактерії, виділені з води, безхребетних та водоростей Чорного моря.
Предметом дослідження був видовий склад Alteromonas-подібних бактерій та їх антибіотична активність по відношенню до тест-культур бактерій, дріжджів, фітопатогенних грибів та ціанобактерій.
Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували методи поліфазного таксономічного аналізу, які включали мікробіологічні, біохімічні, нумеричні, молекулярно-генетичні методи, а також методи вивчення антибіотичної активності бактерій.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено біорізноманіття Alteromonas-подібних бактерій Чорного моря. На основі сіквенсу 16S рРНК та характеристики за 112 фенотиповими ознаками, які включали вивчення чутливості до 14 антибіотиків різної хімічної будови, здійснено їх поліфазний таксономічний аналіз. Вперше встановлено присутність морських бактерій родів Pseudoalteromonas, Alteromonas, Marinomonas, Shewanella, Halomonas, Psychrobacter серед мікробного населення Чорного моря. Поряд з видами Alteromonas macleodii, Pseudoalteromonas citrea, P. haloplanktis, Marinomonas protea, Shewanella colwelliana, S. baltica, Halomonas variabilis, Psychrobacter glacincola серед чорноморських ізолятів виявлено штами бактерій, які за результатами сіквенсу 16S рРНК є представниками нового виду Pseudoalteromonas. З Чорного моря виділено і охарактеризовано мікроорганізм, який за результатами молекулярно-генетичних досліджень є представником нового роду. Встановлено високу антибіотичну активність Alteromonas-подібних бактерій Чорного моря, зокрема штамів родів Pseudoalteromonas і Shewanella, більшість з яких - асоціанти морських безхребетних. Серед п'яти штамів Alteromonas macleodii виявлено активний штам-продуцент антибактеріальних та фунгіцидних речовин.
Практичне значення отриманих результатів. На основі отриманих результатів розроблено схему селективного відбору морських Alteromonas-подібних бактерій, а саме представників родів Pseudoalteromonas, Alteromonas, Marinomonas і Shewanella, які є важливою складовою морського біорізноманіття та індикаторами чистоти акваторії моря, а також перспективними продуцентами антибіотичних речовин. Розроблена схема дає можливість попередньої ідентифікації Alteromonas-подібних бактерій і може бути використана в галузі морської мікробіології та біотехнології. Створено колекцію галофільних бактерій Чорного моря, серед яких знайдені продуценти антибактеріальних, антифунгальних та альгоцидних речовин. Ідентифіковані сучасними методами штами багатьох таксонів морських бактерій поповнили фонд Української Колекції Мікроорганізмів.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконані представлені в дисертації експериментальні дослідження, проаналізовані їх результати і обґрунтовані висновки. Молекулярно-генетичні дослідження морських бактерій проведено автором самостійно під керівництвом проф. Ф. Родрігес-Валера (Університет Мігеля Ернандеса, Іспанія), вивчення впливу Alteromonas-подібних бактерій на ціанобактерії виконано спільно з к.б.н. Т.Г. Лисенко (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ), за що автор роботи висловлює свою глибоку вдячність. Особлива подяка науковому керівнику д.м.н., проф., акад. НАНУ В.В. Смірнову та д.б.н. О.А. Кіпріановій (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ) за всебічну допомогу при обговоренні одержаних результатів.
Апробація результатів досліджень. Результати роботи доповідались на Європейському симпозіумі з морської мікробіології “7th European Marine Microbiology Symposium” (Голландія, 2000), на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2000), міжнародній науковій конференції “Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 2001), конференції молодих учених з проблем екології Азово-Чорноморського басейну (Севастополь, 2001), на науково-практичній школі для молодих спеціалістів “Екологія Карпат” (Ужгород, 2001), на Міжнародному симпозіумі з водної мікробної екології “8th Symposium on Aquatic Microbial Ecology” (Італія, 2002).
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 8 робіт (з них 5 статей в профільних журналах і 3 – в тезах доповідей).
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень”, “Обговорення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 171 посилання (з яких 136 - іноземних авторів). Робота містить 17 таблиць та 26 рисунків.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єктом дослідження були 384 штами бактерій, виділених з морської води, водоростей (Cladophora albida, Ectocarpus confervoides, Cystoceira crinita, Ulva rigida, Codium vermilara, Dasia baillonviana, Enteromorpha intestinalis, Polysiphonia cepaca, Dilophus fasciola, Scytosiphon lomentaria) та безхребетних (Aurelia aurita, Actinia equina, Mytilus galloprovincialis, Mytilus acrocyrta, Rapana thomasiana, Mytilaster lineatus), відібраних з Чорного моря в акваторії Карадазького природного заповіднику. Для порівняльних досліджень були використані типові штами морських бактерій, підтримувані в Українській Колекції Мікроорганізмів: Pseudoalteromonas nigrifaciens УКМ В-11035т (АТСС 19375), P. haloplanktis УКМ В-11034т (АТСС 14393), P. elyakovii УКМ В-11039т (КММ 162), P. tetraodonis УКМ В-11039т (ІАМ 14160), P. carrageenovora УКМ В-11039т (АТСС 43555), P. atlantica УКМ В-11037т (АТСС 19262), P. undina УКМ В-11070т (АТСС 29660) , P. citrea УКМ В-11071 (АТСС 15251), Alteromonas maсleodii УКМ В-11033т (АТСС 27126), Marinomonas communis УКМ В-11074т, Shewanella putrеfaciens УКМ В-4173т (АТСС 8071).
Для виділення штамів використовували метод прямого висіву із зразків морської води, гомогенатів водоростей та безхребетних на агаризоване середовище “В” для морських мікроорганізмів (Baumann, 1986). Фенотипову характеристику досліджуваних штамів проводили загальноприйнятими методами (Bergey?s Manual of Systematic Bacteriology, 1984; 1997). Були досліджені морфологія клітин, культуральні властивості, рухливість, забарвлення за Грамом, потреба в іонах натрію для росту, тип метаболізму, здатність продукувати оксидазу, ферментативну активність, здатність до денітрифікації та відновлення нітратів до нітритів. Для вивчення здатності бактерій до анаеробної утилізації аргініну, лізину та орнітину використовували метод Меллера (Moeller, 1955). Для вивчення засвоєння бактеріями органічних сполук як єдиного джерела вуглецю було використано 79 сполук, в тому числі вуглеводні, жирні кислоти, дикарбонові кислоти, поліспирти та гліколі, ароматичні та інші циклічні сполуки, аліфатичні та кільцеві амінокислоти. Чутливість до антибіотиків визначали методом дисків, що містили антибіотики: бензилпеніцилін, лінкоміцин, олеандоміцин, поліміксин, стрептоміцин, еритроміцин, тетрациклін, цефалотин, фурадонін, азтреонам, рифампіцин, левоміцетин, налідиксова кислота та ципрофлоксацин. Електронно-мікроскопічне дослідження проводили на електронному мікроскопі ЕМВ – 100 БР при інструментальному збільшенні х12000-15000. Нумеричний аналіз проводили за результатами вивчення 97 фенотипових ознак, групування штамів за ступенем подібності проводили методом однозв'язкового аналізу за Сокалом та Снітом (Sneath, 1980).
Дослідження бактеріальних геномів виконувалось із застосуванням техніки ампліфікування ДНК – полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для виділення ДНК клітини ресуспендували в 200 мкл лізис-буферу (10 мM тріс (рН 8,0), 1 мM EDTA, 1% трітон Х-100) та кип'ятили протягом 5 хв. Після екстракції хлороформом використовували 5 мкл супернатанту для приготування ПЛР-розчину, що містив (мкл): буфер – 5, MgCl2 - 3, dNTPs - 1, Taq - 0,2, ДНК (супернатант) – 3, праймери по 0,5, вода – 36,8. Для ПЛР були використані універсальні бактеріальні праймери: Ant 1 та 16S5R. Реакцію ампліфікації проводили із застосуванням PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research INC) за таких умов: 1-й початковий цикл при 95 є? протягом 4 хв., 35 циклів для денатурації ДНК при 95 ?С – 1 хв., віджиг при 55 є? – 1 хв., стaдія при 72 ?С – 2 хв., останній цикл при 72?С – 10 хв. Продукти ампліфікації були розділені горизонтальним електрофорезом в гелі з 1% агарози, забарвлені розчином бромистого етідію та візуалізовані скануванням при 500 нм в Fluorimager scanner (Molecular Dynamics, USA). Сіквенування здійснювали на АВІ PRISM 377 (Perkin-Elmer). Філогенетичне дерево побудовано з використанням алгоритму однозвўязкового аналізу за ступенем подібності (450 нуклеотидних позицій) за допомогою програм Clustal W (Genetics Computer Group package) та MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) версія 1.01.
Антагонізм бактерій вивчали методом перехресних штрихів на агаризованому середовищі “В” та “ВМ” з додаванням 0,1% фумарату, б-аланіну, ацетату, L-глютамату, гліколату, гіпурату та L-аргініну. Для дослідження антибіотичних речовин ізоляти вирощували на рідкому середовищі “В” в умовах глибинного культивування на качалці протягом 72 год. при 25 oC. Ціанобактерії вирощували у стерильних умовах з аерацією повітрям при 25 oC та освітленні 1500 лк на середовищі BG11. Активність культуральних рідин досліджували методом лунок, активність ацетонових екстрактів мікробної біомаси – методом паперових дисків (Егоров, 1994). Як тест-мікроорганізми були використані референтні штами: Staphylococcus aureus УКМ В-4001 (АТСС 6538Р), Bacillus subtilis УКМ В-902 (ГІСК 010010), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-907 (АТСС 27853), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Proteus vulgaris УКМ В-905 (АТСС 6896), Micrococcus luteus УКМ Ас-469, Mycobacterium phlei УКМ Ас-402т (АТСС 11758), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudoalteromonas undina УКМ В-11070т (АТСС 29660), штами фітопатогенних грибів Penicillium chrysogenum 001125.Z, Fusarium oxysporum 50575, Cochliobolus sativus 000748.Z та Mucor circinelloides 001959.Z, а також ціанобактерій Synechococcus cedrorum CALU 705 та Synechocystis minuscula CALU 701.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Виділення мікроорганізмів з води, молюсків та водоростей Чорного моря
З води, молюсків та безхребетних Чорного моря було виділено 384 штами бактерій та дріжджів. Серед ізолятів домінували грамнегативні палички (67%), їм поступалися коки (17%), дріжджі (9%) та грампозитивні палички (7%). Максимальна кількість і різноманітність колоній різних мікроорганізмів (незабарвлених та пігментованих в червоний, білий, жовтий, жовтогарячий кольори, слизуватих чи пастоподібних) спостерігалась у висівах з тканин молюсків, їм поступалися водорості. Мінімальною кількістю та різноманітністю мікрофлори характеризувались висіви з морської води. Так, середня кількість мікроорганізмів в 1 мл води становила 1,13 •103, в 1 мг гомогенатів водоростей – 1,03•104 і безхребетних – 1,38•104.
Відбір Alteromonas-подібних бактерій серед ізольованих штамів
та їх фенотипове дослідження
Мікроорганізми На основі розробленої нами схеми поетапного селективного відбору Alteromonas-подібних бактерій (рис. 1) серед загальної кількості ізолятів було відібрано 51 штам грамнегативних, оксидазопозитивних, галофільних, неферментуючих, позбавлених аргініндигідролази паличок, рухливих за допомогою одного полярного джгутика. Всі вони були охарактеризовані за 97 фенотиповими ознаками (морфологічні та культуральні властивості, чутливість до антибіотиків, характер спектрів вуглецевого живлення). Нумеричний аналіз Alteromonas-подібних бактерій За результатами фенотипових досліджень проведено нумеричну класифікацію ізолятів, попередньо віднесених до Alteromonas-подібних бактерій.
Грамнегативні оксидазопозитивні
Галофільні
Не ферментують вуглеводи
Негативна аргініндигідролаза
Один полярний джгутик Alteromonas-подібні бактерії Рис. 1. Схема фенотипового дослідження мікроорганізмів, виділених з Чорного моря.
Таблиця 1 Результати сіквенування фрагментів 16S рРНК чорноморських бактерій Крім того, до нумеричного аналізу були включені типові штами родів Pseudoalteromonas, Alteromonas, Shewanella та Marinomonas з Української Колекції Мікроорганізмів. Згідно отриманої дендрограми досліджувані бактерії було розподілено на 8 кластерів, до складу яких увійшли також типові штами. Це дало нам підставу попередньо віднести штами того чи іншого кластеру до видів, до яких належали типові культури. На основі кластерного аналізу досліджені штами було орієнтовно віднесено до видів Pseudoalteromonas nigrifaciens, P. citrea, P. haloplanktis та Alteromonas macleodii. Молекулярно-генетичні дослідження Після вивчення комплексу фенотипових характеристик та здійснення нумеричного аналізу досліджуваних штамів для подальшої ідентифікації були відібрані 34 репрезентативні штами Alteromonas-подібних бактерій, які входили до основних кластерів дендрограми. Крім того, до генетичних досліджень були залучені 2 штами, здатних до анаеробної ферментації глюкози, та 4 штами, що відрізнялись відсутністю джгутиків. Нуклеотидні послідовності більшості фрагментів мали досить високий рівень подібності з 16S рРНК генами описаних в літературі видів (табл. 1). Значна кількість штамів виявилась генетично близькою до представників роду Pseudoalteromonas. Чорноморські псевдоальтеромонади були представлені видами P. haloplanktis (4 штами) і P. citrea (7 штамів). Штами 12 і 42 показали лише 96 % генетичної подібності до фрагменту 16S рРНК референтного штаму P. aurantia.
Назва виду та номер в GenBank Номер штаму Подібність 16S р РНК референт- них штамів, % Кількість нуклеотидів ідентичного фрагменту 16S рРНК
Alteromonas macleodii AF 052600 10 9 8 100 - // - - // - 453 450 458
Pseudoalteromonas haloplanktis AF 261041 23 38 6 37 100 - // - - // - - // - 484 475 482 470
P. citrea X 82137 20 16 17 13 14 34 39 100 98 97 97 97 97 97 452 452 445 440 443 456 442
P. aurantia X 82135 12 42 96 96 418 432
Shewanella baltica AJ 000215 1 5 4 26 99 - // - - // - 97 412 426 430 437
S. colwelliana AF 170794 18 19 22 24 32 36 47 49 51 97 - // - - // - - // - - // - - // - - // - - // - - // - 465 408 448 454 456 458 412 459 476
Marinomonas protea AJ 238597 46 31 99 - // - 450 448
Halomonas variabilis AJ 306893 28 99 450
Oceanospirillum linum AF 260752 25 93 442
Brevundimonas vesicularis AJ 007801 35 100 415
Psychrobacter glacincola U 85876 44 45 29 27 98 - // - - // - 97 452 456 448 450
Aeromonas popoffii AJ 223180 33 41 98 - // - 441 448
Рис. 2. Дендрограма, отримана за результатами філогенетичного аналізу чорноморських Alteromonas-подібних бактерій. Масштаб: 0,01 замін нуклеотидів на одну позицію.
Такий рівень подібності може свідчити як про генетичну мінливість даних штамів, так і про належність названих ізолятів до нових, ще не описаних видів. Численною була також група шеванел.Чотири з них віднесені до Shewanella baltica, дев'ять – до S. colwelliana. Причому лише деякі з них показали високий рівень подібності структури геному до названих видів – 99%, більшість же виявила лише 97% подібності, що лише з певною мірою вірогідності може свідчити про їх належність саме до цих видів шеванел. Два штами виявились подібними до виду “Marinomonas protea”. В генетичній базі даних є відомості про послідовності 16S рРНК цього виду, але до цього часу опис виду не опублікований. Ген 16S рРНК штаму 25 відзначився досить низьким ступенем подібності до відомих видів і родів морських бактерій. За даними сіквенсу цей штам ближче всього був до виду Oceanospirillum linum (93%), що може свідчити про належність штаму до нового роду. Чотири безджгутикових штами, які також були відібрані для ідентифікації, віднесені нами до антарктичного морського виду Psychrobacter glacincola. Два штами, що поряд з іншими ферментуючими штамами, були виключені з числа Alteromonas-подібних бактерій, виявили свою генетичну близькість до виду Aeromonas popoffii. Заключним етапом генетичних досліджень було проведення філогенетичного аналізу відібраних штамів і одержання “філогенетичного дерева” - дендрограми, на якій представлені рівні еволюційної спорідненості досліджених груп мікроорганізмів та їх місце серед інших протеобактерій (рис. 2).
| 
