|
НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ
IНСТИТУТ БIОХIМIЇ iм. О.В.ПАЛЛАДIНА
КАПЛЯ
ОЛЕКСАНДР АНДРIЙОВИЧ
УДК 577.152.361
CТРУКТУРНО-ФУНКЦIОНАЛЬНI ВЛАСТИВОСТI
IЗОФОРМ КАТАЛIТИЧНОЇ СУБОДИНИЦI Nа+,К+-АТР-ази
ПРИ МЕМБРАНОТРОПНИХ ВПЛИВАХ
03.00.04 - бiохiмiя
АВТОРЕФЕРАТ
дисертацiї на здобуття наукового ступеня
доктора бiологiчних наук
КИЇВ - 1999
Дисертацiєю є рукопис.
Робота виконана в лабораторiї транспортних АТФаз Iнституту бiохiмiї iм.О.В.Палладiна Нацiональної академiї наук України
Захист вiдбудеться "27 "вересня 1999 року о 14 годинi на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д 26.240.01 в Iнститутi бiохiмiї iм. О.В.Палладiна НАН України за адресою: 252601, м.Київ-30, вул. Леонтовича,9.
З дисертацiєю можна ознайомитися в бiблiотецi Iнституту бiохiмiї ім. О.В. Палладiна Нацiональної академiї наук України.
Автореферат розiсланий "26"серпня 1999 року.
Вчений секретар
спецiалiзованої вченої ради О.В.Кiрсенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальнiсть теми. Фермент Nа+,К+-АТР-аза (АТР-фосфогiдролаза, КФ 3.6.1.37), інтегральний білок плазматичних мембран клітин еукаріот, здійснює спряжений з гідролізом АТР протинаправлений трансмембранний перенос Nа+ та К+ і тим самим забезпечує підтримання електрохімічного і осмотичного градієнтів одновалентних іонів, необхідних для нормального функціонування клітин.Фермент відіграє головну роль в реалізації багаточисельних клітинних функцій та процесів, які залежать від існування іонних градієнтів [Болдырев А.А.,Мельгунов В.И.,1985].
На відміну від інших АТР-аз Р-типу Nа+,К+-АТР-аза поєднує в єдиній молекулі поряд з транспортно-гідролітичною і рецепторну функцію [Anner B.M.,1985], специфічно взаємодіючи з екзогенними інгібіторами рослинного походження — серцевими глікозидами, або їх ендогенними аналогами [Doris P.A.,1994; Martinka E.,1995; McDonough A.A.et al.,1995].
На цей час широкий розвиток набули дослідження по з'ясуванню структурно-функціональних особливостей ізоформ Nа+,К+-АТР-ази, якi,очевидно, забезпечують специфічні потреби клітин в регуляції іонного транспорту [Sweadner K.J.,1989; Vasilets L.A.,Schwarz W.,1993;Pressley T.A.,1996].Незважаючи на встановлену бiохiмiчну i в рядi випадкiв функцiональну специфiчнiсть iзоформ, на цей час залишається вiдкритим питання про те, якi особливостi структурної органiзацiї в мембранi або во взаємодiї з лiпiдним оточенням обумовлюють їх тканиноспецифiчну функцiональну спецiалiзацiю.
В зв'язку з інтегральною структурою і фундаментальною функцією ферменту Nа+,К+-АТР-аза залучена до розвитку багатьох, в тому числi i нейрональних, клітинних патологій, які супроводжуються cтруктурною перебудовою мембран [Дворецкий А.И. и др.,1990;Болдырев А.,1992; Болдырев А.А.,Куклей М.Л.,1996; Волков Г.Л.,1996].
Один з універсальних шляхiв біопошкодження мембран реалізується через модифiкацiю їх лiпiдного компонента. Фермент Nа+,К+-АТР-аза як конформацiйно-лабiльний iнтегральний бiлок характеризується високою регуляторною залежнiстю вiд стану лiпiдної фази мембрани [Дергунов А.Д. и др.,1984;Robinson J.D.,Pratap P.R., 1993]. Окремi данi свiдчать про залежнiсть функцiональних властивостей iзоформ Nа+,К+-АТР-ази вiд фiзико-хiмiчних особливостей їх лiпiдного оточення в мембранi [Matsuda T.,Iwata H.,1986;1988; Iwata H.et al.,1988;Sweadner K.J.,1989].
В зв'язку з цим набуває актуальностi вивчення iндивiдуальної чутливостi iзоформ Nа+,К+-АТР-ази до порушень структурного стану мембрани. Такi дослiдження важливi для з'ясування закономiрностей,якi обумовлюють залежнiсть функцiональних властивостей iзоформ вiд регуляторного i деструктивного впливiв на мембрану ендогенних ефекторiв та екстремальних факторiв. Бiльш того,вони є основоположними при вивченнi механiзмiв, якi забезпечують адаптивну стiйкiсть iзоформ Nа+,К+-АТР-ази до змiн фiзико-хiмiчних властивостей плазматичної (зокрема нейрональної) мембрани при фiзiологiчних та патологiчних станах органiзму.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в лабораторiї транспортних АТФаз у вiдповiдностi з планами науково-дослiдних робiт Iнституту бiохiмiї iм.О.В.Палладiна НАН України.
Мета i задачi дослiдження. Мета роботи полягала в дослiдженнi чутливостi рiзних рецепторних типiв iзоформ каталiтичної субодиницi Nа+,К+-АТР-ази мозку до мембранотропних впливiв in vitro для з'ясування закономiрностей їх функцiональних порушень в мембранi.
Для досягнення мети були поставленi такi задачi:
1. Iдентифiкувати iзоформи α-субодиницi Nа+,К+-АТР-ази в мембранних препаратах ферменту мозку на пiдставi детекцiї каталiтичних фосфоiнтермедiатiв ферменту. За допомогою iнгiбiторного аналiзу диференцiювати ферментативну активнiсть iзоформ в препаратах, дослiдити видову специфiчнiсть рецепторних типiв ферменту, охарактеризувати їх деякi структурно-функцiональнi властивостi та активнiсть в постнатальному онтогенезi щурiв.
2. Вивчити електрофоретичнi властивостi гiдрофобних бiлкiв iзоформ каталiтичних полiпептидiв Nа+,К+-АТР-ази, якi виявляються термообробкою препаратiв в присутностi DS-Na.
3. Вивчити закономiрностi термоiнактивацii iзоформ каталiтичної субодиницi Nа+,К+-АТР-ази мозку та нирок.
4. Вивчити чутливiсть iзоформ каталiтичной субодиницi Nа+,К+-АТР-ази мозку до мембранотропної дiї фосфолiпази А2 з отрути середньоазiатської кобри.
5. Вивчити чутливiсть iзоформ каталiтичної субодиницi Nа+,К+-АТР-ази до мембранотропної дiї анiонного детергенту DS-Na в умовах змiни фiзико-хiмiчних властивостей плазматичних мембран клiтин головного мозку in vitro та в постнатальний перiод у щурiв.
6. Вивчити чутливiсть iзоформ каталiтичної субодиницi Nа+,К+-АТР-ази з рiзною SH-залежнiстю до неферментативної окисної модифiкацiї мембран.
7. Виявити закономiрностi, якi визначають специфiку чутливостi iзоформ каталитичної субодиницi мембранозв'язаної Nа+,К+-АТР-ази мозку до мембранотропних впливiв.
Наукова новизна одержаних результатiв. В результатi проведених дослiджень встановлено, що iзоформи каталiтичної субодиницi мембранозв'язаної Nа+,К+-АТР-ази мозку виявляють рiзну стiйкiсть до дестабiлiзуючих мембрану впливiв in vitro.
Особливостi електрофоретичних властивостей в полiакриламiдному гелi в присутностi DS-Na гiдрофобних бiлкiв iзоформ α-субодиницi Nа+,К+-АТР-ази мозку пiсля солюбiлiзацiї препаратiв при термообробцi (1000C) пiдтверджують iснування вiдмiнностей бiлково-детергентних взаємодiй для iзоформ.
Встановлено, що α1-iзоформа Nа+,К+-АТР-ази мозку має бiльш високу термостабiльнiсть (при 50-550С) у порiвняннi з α+. Специфiка термочутливостi iзоформ не визначається конформацiйним станом ферменту (Na+-та К+-конформацiї). Данi свiдчать про вiдмiнностi структурної стiйкостi в мембранi iзоформ Nа+,К+-АТР-ази мозку та нирок.
Виявлено однонаправленiсть специфiки мембранотропних впливiв фосфолiпази А2 з отрути середньоазiатської кобри та DS-Na на активнiсть iзоформ в мембранних препаратах Nа+,К+-АТР-ази кори головного мозку щура. В умовах помiрної iнактивацiї Nа+,К+-АТР-ази фосфолiпазою А2 ефект зниження чутливостi ферменту до уабаїну усувається обробкою препаратiв сироватковим альбумiном для вилучення вiльних жирних кислот та в умовах iнгiбування, оптимальних для зв'язування глiкозида. При подальшiй iнактивацiї Nа+,К+-АТР-ази в мембранi α1-iзоформа iнактивується швидше, нiж α+. Вперше встановлено, що необоротна iнактивацiя Nа+,К+-АТР-ази DS-Na, що превалює для α1-iзоформи, супроводжується бiльш ефективним її вилученням з мембран в препаратах мiкросом сiрої речовини мозку щура та бика. Аналогiчна специфiка iнактивацiї iзоформ детергентом характерна також для Nа+,К+-АТР-ази мозочка, но не виявляється у препаратах з довгастого мозку. Вiдмiнностi в чутливостi iзоформ до DS-Na усуваються в умовах температурної модифiкацiї мембранного матрiксу (200C→370C) та при закисленнi середовища (pH 7,5→6,2).
Вперше встановлено, що окисне iнгiбування iзоформ Nа+,К+-АТРази сiрої речовини мозку щура в системi "Fe2++аскорбат" вище для α+ у порiвняннi з α1, що вiдповiдає SH-залежностi ферментативної активностi iзоформ. Специфiка iнактивацiї iзоформ не залежить вiд пероксидної деструкцiї лiпiдного компонента мембрани. Данi свiдчать на користь того, що бiлкова молекула нейрональної Nа+,К+-АТР-ази є безпосередньою мiшенню iзоформо-специфiчної дiї оксидантiв.
Сформульована гiпотеза про iснування структурних вiдмiнностей бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ каталiтичної субодиницi Nа+,К+-АТР-ази нейрональних мембран, обумовлених особливостями структурної органiзацiї їх лiпiдного оточення.
Практичне значення одержаних результатiв. Результати дослiджень мають загальнотеоретичне для бiохiмiї значення,створюють новi методичнi пiдходи для адекватної оцiнки патофiзiологiчних та фармакологiчних мембранотропних ефектiв i можуть бути основою для фундаментальних та прикладних дослiджень в галузi бiохiмiчної мембранологiї та фармакологiї при вивченнi та корекцiї нейронального метаболiзму при мембранотропних впливах. Положення дисертацiї можуть бути використанi в учбовому процесi при вивченнi мембранологiї, бiохiмiї та фiзiологiї.
Особистий внесок дисертанта. Дисертантом особисто обгрунтована iдея та методологiя роботи, пiдiбранi i обробленi данi лiтератури, виконанi експериментальнi дослiдження, проведений науковий аналiз отриманого матерiалу, сформульованi основнi положення i висновки, пiдготовленi основнi друкованi працi. Високоочищенi мембраннi препарати Na+,K+-АТР-ази нирок свинi люб'язно наданi канд.бiол.наук Кравцовою В.В. (лабораторiя транспортних АТФаз Iнституту бiохiмiї iм.О.В.Палладiна НАН України).
Апробацiя результатiв дисертацiї. Матерiали дисертацiї доповiдались на Мiжнародному симпозiумi по транспорту iонiв (Тбiлiсi,1989), VI и VII Українських бiохiмiчних з'їздах (Київ,1992,1997), 3-iй конференцiї бiохiмiкiв Узбекистану (Ташкент,1996), 4th European conference on engineering and medicine (Warsaw,1997), II з'їздi Українського бiофiзичного товариства (Харькiв,1998), на засiданнях Вченої ради Iнституту бiохiмiї iм.О.В.Палладiна НАН України (1996-1999р.).
Публiкацiї. Основний змiст роботи викладено у 24 наукових працях,з них:1 монографiї (одноосiбна), 17 статтях у вiтчизняних i зарубiжних профiльних журналах (3 одноосiбнi), матерiалах та тезах 6 республiканських та мiжнародних наукових з'їздiв та конференцiй.
Структура та обсяг роботи. Дисертацiя складається з таких роздiлiв: "Вступ", "Огляд лiтератури" (3 пiдроздiли), "Матерiали та методи дослiджень", "Результати дослiджень та їх обговорення" (6 пiдроздiлiв), "Заключення", "Висновки", "Список лiтератури (378 джерел). Дисертацiю викладено на 265 сторiнках машинопису, вона мiстить 49 малюнкiв та 10 таблиць.
ОГЛЯД ЛIТЕРАТУРИ
В оглядi лiтератури докладно розглянутi питання структурно-функцiональної єдностi молекули Na+,K+-АТР-ази i лiпiдного оточення в плазматичнiй мембранi. Проведено детальний аналiз сучасних уявлень про функцiональну роль iзоформ i рецепторних типiв Na+,K+-АТР-ази, зокрема в тканинах мозку, їх генетичну детермiнованiсть. Безпосередню увагу придiлено обгрунтуванню передумов iснування взаємозв'язку функцiональних властивостей iзоформ Na+,K+-АТР-ази з лiпiдним оточенням в мембранi.
МАТЕРIАЛИ I МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ
Об'єктом основних дослiджень був головний мозок щурiв (сiра речовина). В порiвняльних дослiдах використовували також мозочок i довгастий мозок щура, мозок бика i кроля (сiра речовина) та нирки (зовнiшня мозкова речовина) щурiв,кроля,бика,свинi.
Препарати Na+,K+-АТР-ази в мембранозв'язанiй формi отримували із фракцii мiкросом (50000g) за допомогою "м'якої" екстракції DS-Na за методом Йоргенсена-Свiднер [Jorgensen P.L.,1974;Sweadner K.J.,1978] з наступним ультрацентрифугуванням(105000g, 4 години) в ступеневому градiєнтi щільності сахарози (15,25 i 30%,вага/об'єм) за модифікованим методом [Matsuda T.et al.,1984]. Середовище обробки мiкросом детергентом містило: 50 мМ імідазол (рН 7,5), 1 мМ ЕДТА, 3 мМ трiс-АТР, 0,16 М сахарозу, 5 мг/мл білка мiкросом і 1,2 чи 1,4 мг/мл DS-Na (для тканин мозку та нирок вiдповiдно). Час обробки — 30 хв при 200С. Бiлковi фракцiї в межах 15/25% (зона 1,мозок) i 25/30% (нирки) сахарози (в рядi експерементiв у 15% сахарозi,зона 2,мозок) осаджували центрифугуванням (105000g,1 година). Препарати ферменту суспензували в середовищі, що містить 10 мМ iмiдазол (рН 7,5), 0,16М сахарозу, 0,1-0,5мМ ЕДТА, зберігали в рідкому азоті, розморожували одноразово,використовували як нативний мембранозв'язаний препарат ферменту. Концентрацiю бiлка визначали за модифiкованим методом Лоурi i спiвавт. [Cadman E.et al.,1979].
Електрофорез препаратiв [Weber K., Osborn M.,1969; Laemmli U.K.,1970] проводили у 5-6%-ному ПААГ. Положення каталiтичних субодиниць iзоформ Na+,K+-АТР-ази контролювали ауторадiографiчно за Na+-залежним, K+- та уабаїнчутливим фосфорилюванням [γ-32P]АТР [Sweadner K.J.,1979]. Вивчення термоiндукованих електрофоретичних властивостей α-субодиниць iзоформ Na+,K+-АТР-ази проводили у вiдповiдностi з роботою [Ohta T. et al.,1982].
Загальну АТР-азну активність визначали в середовищі: 30 мМ трiс-HCl (рН 7,4 при 370С), 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ тріс-АТР, 0,2 мМ ЕДТА, 1,25 мМ дитіотреїтол. Mg2+-АТР-азну активність визначали в присутності додатково 3•10-3уабаіна. Na+,K+АТР-азну активність розраховували за різницею між загальною АТР-азною та Mg2+-АТР-азною активностями. У везикульованiй фракцiї мiкросом Na+,K+-АТР-азну активнiсть визначали пiсля демаскування латентної активностi в препаратах (2мг бiлка/мл) [DS-Na]opt (0,2-0,3 мг/мг бiлка) в середовищi згiдно Йоргенсену-Свiднер. Питома активнiсть Na+,K+-АТP-ази (мкмолей Pi/мг бiлка за 1 годину) становила для мiкросом: 130-200 (довгастий мозок, нирки щура), 90-120 (кора головного мозку, мозочок щура), 50-60 (кора головного мозку бика);для мембранозв'язаного ферменту: 380-540 (довгастий мозок), 320-520 та 210-260 (кора головного мозку, зона 1 та зона 2 вiдповiдно), 350-720 (нирки щура); 210-350 (тканини бика); 160-290 (тканини кроля); 720-1200 (нирки свинi).
Iнгiбування Na+,K+-АТP-ази уабаїном вивчали в процессi розвитку АТР-азної реакцiї [Matsuda T.et al.,1984] чи пiсля попередньої iнкубацiї препаратiв з iнгiбiтором 10-15 хв при 370С у вiдсутностi КСl. АТР-азну реакцiю запускали додаванням 20 мМ КСl [Urayama O.,Nakao M.,1979]. Параметри iнгiбування уабаїном Na+,K+-АТР-азної активностi iзоформ ферменту (α+ и α1) в препаратах з мозку щура розраховували згiдно з моделi для двох незалежних центрiв зв'язування глiкозида. Специфiчну дiю агентiв на iзоформи каталiтiчної субодиницi Na+,К+-АТР-ази оцiнювали на основi аналiзу змiн двохфазної кривої залежностi ферментативної активностi от концентрацiї уабаїну [Sweadner K.J.,1989]]. Кiнцеве розведення середовища обробки при визначеннi АТР-азної активностi становить 100-200 разiв. В стацiонарних умовах iнгiбування активності окремих ізоформ розраховували за різницею між активностями без інгібітору і в присутності 5•10-6М уабаіну (α+: сумарна активність уабаінчутливих ізоформ α2 і α3 iз схожими бiохiмiчними властивостямi,активностi яких не диференцiюються кiнетично) або 5•10-6М і 3•10-3 М уабаіну (уабаїнрезистентна α1-ізоформа).
Обробку ферменту мозку 1 мМ N-етилмалеiмiдом (N-ЕМ) та трипсином (в присутностi 60мМ КСl) проводили у вiдповiдностi з роботами [Sweadner K.J.,1979; Matsuda T.et al.,1984]. Вивчення термоiнактивацiї Na+,K+-АТР-ази проводили при 500С або 550С в середовищi: 10 мМ iмiдазол (рН 7,5), 2,5 мМ дитiотреїтол, 0,2 мМ EДТА, 5% сахароза, 40 мкг/мл бiлка препарату. Обробку препаратiв Na+,K+-АТР-ази мозку фосфолiпазою (ФЛ) А2 з отрути Naja naja oxiana (iзофермент з М.м.=13 кДа) проводили 30 хв при 370С в середовищi, яке мiстило 25 мМ iмiдазол (рН 7,5), 1мМ СаСl2. Реакцiю зупиняли 10-кратним розведенням розчином з ЕГТА (кiнцева концентрацiя 5мМ).
Окисну модифікацію мембранних препаратiв Na+,K+-АТР-ази (0,5 мг/мл) проводили в 30 мМ тріс-HCl буфері (pH 7,4 при 370С), що містить 10 мкМ FeSO4 і 0,2 мМ аскорбінову кислоту. Реакцію зупиняли 10-кратним розведенням холодним 10мМ тріс-HCl буфером, що містив 0,5 мМ ЕДТА (кiнцева концентрацiя). Визначали вмiст малонового дiальдегiду (МДА) и кiлькiсть вiльних SH-груп за допомогою 5,5'-дiтiо-бiс(2-нiтробензойної кислоти) (ДТНБК) [Болдырев А.А. и др.,1992; Курелла Е.Г. и др.,1996].
Результати оброблено статистично [Плохинский В.М.,1981].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Характеристика мембранних препаратiв Na+,K+-АТР-ази. В препаратах Na+,К+-АТР-ази кори головного мозку на вiдмiну вiд нирок (α1) iдентифiкованi електрофоретично дискретнi бiлковi зони [γ-32P]фосфоiнтермедiатiв iзоформ α-субодиниць (α1 та α+). Продемонстровано специфiку дiї трипсину на α1-iзоформу Na+,К+-АТР-ази в Е2-конформацiї ферменту та N-ЕМ на α+-форму як критерiю для їх детекцiї в гетерогенних по iзоформному складу препаратах ферменту мозку.
В препаратах з мозку щура iдентифiкованi активностi глiкозидчутливого та глiкозидрезистентного типiв iзоформ Na+,К+-АТР-ази (α+ та α1) у вiдповiдностi з уабаїнзалежністю їх фосфоiнтермедiатiв та специфiкою дiї трипсину, N-EM, термообробки. Цi методичнi пiдходи застосовано для направленої iнактивацii iзоформ в препаратах мозку бика. Виявлено їх високу схожу чутливiсть до серцевого глiкозиду. Для рiзних видiв тварин показано, що вiдмiнностi спорiдненостi до уабаїну характернi для α1-iзоформи Na+,К+-АТР-ази. Характеристики iнгiбування Na+,К+-АТР-ази мозку щура та бика в двох експериментальних умовах наведено в табл.1,2.
Для демаскованої Na+,К+-АТР-ази мiкросом довгастого мозку (~90% активностi α+ в препаратах) виявлено бiльш високу у порiвняннi з α1-iзоформою ферменту нирок уявну спорiдненiсть до Na+ та субстрату Mg•АТР2- i однакову чутливiсть до активацiї К+ та iнгiбування Са2+.
Показано, що в плазматичних мембранах з сiрої речовини мозку щура в постнатальний перiод сформований стабiльний iзоформний комплекс iз схожими рецепторними властивостями. Ферментативна активнiсть iзоформ досягає максимуму на 30-й день постембрiонального розвитку – часу стабiлiзацiї електрофiзiологiчних характеристик мозку [Venadakis А.,Woodbury D.M.,1962;Abdel-Latif A.A.et al.,1967].
Таким чином, за iзоформним складом i структурно-функцiональними характеристиками мембраннi препарати Na+,К+-АТР-ази вiдповiдають тим,що використовуються при вивченнi структурно-функцiональних взаємозв'язкiв цiєї ферментної системи в мембранi [Matsuda T., Iwata H.,1986;1988; Iwata H.et al.,1988; Sweadner K.J.,1989].
Електрофоретична гетерогеннiсть бiлково-детергентних комплексiв каталiтичної субодиницi Na+,К+-АТР-ази, індукована термобробкою. Проведено вивчення електрофоретичного розподiлу в ПААГ бiлково-детергентних комплексів гiдрофобних бiлкiв iзоформ α-субодиниць Na+,К+-АТР -ази пiсля термообробки препаратiв в присутностi 1% DS-Na i 1% 2-меркаптоетанолу.
Показано,что в умовах електрофорезу у високопористому полiакриламiдному гелi виявляється термоiндуковане (при t0>700C) роздвоєння гомогенної бiлкової зони α1-субодиницi (~90 кДа) Na+,К+-АТР-азы нирок (свинi,щура,бика) з утворенням додаткової бiлкової зони з бiльшою електрофоретичною рухомiстю αII (~85 кДа) (у вiдповiдностi з дослiдженнями на ферментi з нирок собаки [Ohta T.,1982]).
Пiсля iнтенсивної термообробки (1000C,≥1хв) продемонстровано появу при електрофорезi по Лаемлi (Laemli K.,1970) також дифузної бiлкової зони в областi уявних молекулярних мас вищих, нiж у залишкової бiлкової полоси αI (рис.1). Це не є наслiдком утворення агрегатiв, бо межа дифузної зони (вiдмiчена *) не перевищує 105 кДа. Показано, що процес термоiндукованої трансформацiї бiлкової зони α-субодиницi чутливий до умов вiдновлення S-S-зв'язкiв. З часом обробки зростає iнтенсивнiсть дифузної бiлкової зони на фонi зменшення iнтенсивностi основних бiлкових зон αI и αII. Крiм того,пiдвищення концентрацiї 2-меркаптоетанолу з 1мМ до 5мМ (але не DS-Na) сприяло переважному утворенню зони "*".
Виявлений феномен є характерним для α1-субодиницi Na+,К+-АТР-ази нирок усiх дослiджених видiв тварин. Це свiдчить про iснування загальних структурних закономiрностей при термоiндукованому перетвореннi α-субодиницi, не залежних вiд структурних особливостей рецепторних типiв ферменту.
Причина аномальної поведiнки бiлкових зон каталiтичної субодиницi полягає у iснуваннi незвичайних бiлково-детергентних взаємодiй,неоднакових для гiдрофобних бiлкiв iзоформ Na+,К+-АТР-ази [Cortas N. et al.,1991]. Це може обумовлювати специфiчну здатнiсть гiдрофобних бiлкiв α-субодиниць набувати неповнiстю розгорненої конформацiї (бiльш глобулярної) з вищою електрофоретичною рухомiстю,нiж навiть у цiлком розгорненої конформацiї з максимальною кiлькостю зв'язаного детергенту, а в умовах термообробки спричиняє утворенню конформаційних “псевдоізоформ” [Sweadner K.J.,1990]. В цьому випадку дифузна зона (*) відповідає розгорненій конформації ферменту, що утворюється в умовах інтенсивного відновлення дисульфідних зв’язків, з уявною молекулярною масою, яка наближається до справжньої молекулярної маси каталітичної субодиниці.
При порівнянні електрофоретичних властивостей білково-детергентних комплексів ізоформ каталітичної субодиниці Na+,К+-АТР-ази мозку встановлено, що білкова зона α+ більш стійка до процесу термообробки, ніж α1 (рис.1,В). Виявлені закономірності електрофоретичної поведінки білково-детергентних комплексів α+ і α1 в умовах електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності DS-Na свiдчать про особливостi солюбiлiзацiї гiдрофобних бiлкiв iзоформ α-полiпептидiв Na+,К+-АТР-ази у вiдповiдностi з встановленою для них специфiкою гiдрофобних бiлково-детергентних взаємодiй [Cortas N.et al.,1991].
Термочутливiсть Na+,K+-АТР-азы мозку та нирок. Для оцiнки структурної стiйкостi функцiонально-активної нативної конформацiї бiлкової глобули Na+,К+-АТР-ази в мембранi було використано метод термоiнактивацiї (Козлов Ю.П. и др.,1983).
При дослiдженнi кiнетики термоiнактивацiї ферменту з мозку та нирок ряду видiв тварин виявлено таку послiдовнiсть в термочутливостi Na+,К+-АТР-ази в препаратах (у вiдповiдностi з вмiстом α+-форми): довгастий мозок > сiра речовина (мозочок) > нирки (рис.2,а). Судячи iз зменшення високоафiнного компонента iнгiбування уабаїном активностi Na+,К+-АТР-ази мозку щура на фонi збереження уявної спорiдненостi до уабаїну частково iнактивованої α1-iзоформи (рис.2,б;табл.1) i порушення утворення фосфоiнтермедiату α+ (рис.2,в), встановлено, що α+-форма характеризується високою термолабiльнiстю. Показано, що така iнтерпретацiя процесу термоiнактивацiї може бути застосована i для iнших препаратiв з кори мозку бика та кроля, якi мiстять α+-форму ферменту. Na+,К+-АТР-аза нирок (α1-iзоформа) характеризується значною термостiйкiстю.
Термочутливiсть Na+,К+-АТР-ази як з тканин мозку, так i нирок iстотно залежить вiд стабiлiзацiї ферменту в конкретних конформацiйних станах, iндукованих iонами натрiю та калiю (Na+- та K+-конформацiя), що вiдповiдає вищiй гiдрофобностi мембранного оточення каталiтичних полiпептидiв Na+,К+-АТР-ази в конформацiї Е2, нiж Е1 [Jorgensen P.L.,Andersen J.B.,1986]. Проте вiдмiнностi в термолабiльностi iзоформ не визначаються конформацiйним станом ферменту як результат вiдмiнностей в конформацiйнiй рiвновазi, якi виявленi для iзоформ Na+,К+-АТР-ази [Matsuda T.,Iwata H.,1988].
Проведенi дослiдження свiдчать про бiльш високу структурну стабiльнiсть в мембранi α1-iзоформи Na+,К+-АТР-ази мозку та нирок у порiвняннi з α+. Висока термостабiльнiсть α1-iзоформи Na+,К+-АТР-ази є її загальною структурною характеристикою i не обумовлена структурними особливостями глiкозидрезистентного типу ферменту щура.
В проведених дослiдженях виявлено вiдмiнностi в термолабiльностi мiж високогомологiчними за амiнокислотною послiдовнiстю α1-формами ферменту в препаратах нирок рiзних видiв (рис.2,а), а також мiж iдентичними α1-iзоформами Na+,К+-АТР-ази рiзних тканин одного виду: мозку та нирок щура. Це свiдчить,що термочутливiсть Na+,К+-АТР-ази визначають також тканиннi особливостi органiзацiї ферменту в мембранi.
Чутливiсть iзоформ Na+,K+-ATP-ази до фосфолiпази А2. Для з'ясування внеску лiпiдного компонента в стабiлiзацiю функцiонально-активної конформацiї iзоформ Na+,К+-АТР-ази в мембранi проведенi дослiдження з використанням ФЛ А2 з отрути Naja naja oxiana.
Показано, що помiрна iнактивацiя мембранозв'язаної Na+,К+-АТР-ази кори головного мозку щура пiд впливом ФЛ А2 (близько 40% залишкової ферментативної активностi в препаратi) супроводжується помiтним зменшенням чутливостi до уабаїну (рис.3,а). Цей ефект не є результатом змiни спiввiдношення активностей окремих iзоформ в препаратi внаслiдок їх рiзної чутливостi до модифiкуючого мембрану впливу ФЛ А2, але може бути пояснений сповiльненням зв'зування iнгiбiтору. Внаслiдок цього за стандартний час iнкубацiї з уабаїном не досягається стацiонарний рiвень iнгiбування модифiкованої Na+,К+-АТР-ази на вiдмiну вiд нативного ферменту. Пiдвищення часу iнкубацiї приводить до вiдновлення характеру залежностi активностi Na+,К+-АТР-ази вiд концентрацiї уабаїну,типового для нативного ферменту.
Крiм того, пiсля попередньої iнкубацiї з уабаїном тих самих препаратiв в присутностi лiгандiв (АТР, Na+, Mg2+),якi стабiлiзують E2-P-конформацiю Na+,К+-АТР-ази,з якою уабаїн зв'язується з найбiльшою швидкiстю [Болдырев А.А.,Мельгунов В.И.,1985],зникають розбiжностi в характерi iнгiбування контрольних i помiрно iнактивованих ФЛ А2 препаратiв (рис.3,б),що полягають в зменшеннi чутливостi ферменту до глiкозиду в умовах iнгiбування в процесi розвитку АТР-азної реакцiї. Обробка препаратiв Na+,К+-АТР-ази сироватковим альбумiном (СА) для вилучення вiльних жирних кислот – продуктiв гiдролiзу фосфолiпiдiв, також вiдновлює чутливiсть Na+,К+- АТР-ази до уабаїну при помiрнiй її iнактивацiї пiд дiєю ФЛ А2 до рiвня нативного ферменту (рис.3,в). Це вказує на модифікуючий вплив жирних кислот на фермент. Промивка без СА не ефективна.
Подальше зниження активності Na+,К+-АТР-ази під впливом ФЛ А2 супроводжується прогресуючим зменшенням компонента з низькою спорідненістю до уабаїну в двох експериментальних умовах інгібування (рис.3,а,б). Результати по визначенню вмісту активності α1-ізоформи в препаратах при досягненні стаціонарних рівнів інгібування ферменту, наведені на рис. 4, свідчать про її прискорену інактивацію у порівнянні з α+. Так, активність α1-ізоформи Na+,К+-АТР-ази після обробки препаратів ФЛ А2 (5 мкг/мл) знижувалась до 18,6±2,4% від сумарної Na+,К+-АТР-азної активності препарату у порівнянні з її рівнем в контролі – 31,0±0,6% (M±m,n=4-5,p<0,05), Кi,1 =0,44 мкМ, Кi,2=39,4 мкМ. В цих умовах специфіка чутливості активності ізоформ Na+,К+-АТР-ази до ФЛ А2 не зазнає якісних змін після обробки СА (рис.3,в).
Для уабаїнчутливої Na+,К+-АТР-ази кори головного мозку бика також продемонстровано зниження уявної спорідненості модифікованого ферменту до серцевого глікозиду (Кi~0,5мкМ) у порівнянні з контролем (Кi~0,2мкМ) в умовах інгібування в процесі АТР-фосфогідролазного циклу (рис.3,г). Ці відмінності нівелюються при попередній інкубації ферменту в умовах фосфорилювання (Кi~15нМ).
Висока чутливість α1-ізоформи Na+,К+-АТР-ази мозку до інактивації не є наслідком її вибірного протеолізу, про що свідчить збереження в дослідженнях електрофоретичного профілю ізоформ каталiтичної субодиницi в умовах обробки препаратiв ферменту ФЛ А2 та стiйкiсть Na+,К+-АТР-ази мозку до ендогенних протеаз [Владимирова Н.М.и др.,1995].
Можна стверджувати, що виявленi закономiрностi дiї ФЛ А2 на iзоформи обумовленi деградацiєю їх лiпiдного оточення, а їх характер визначається ступенем iнактивацiї ферменту. Наведенi данi свiдчать про iснування специфiки структурної органiзацiї бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ каталiтичної субодиницi Na+,К+-АТР-ази нейрональних мембран. Висновок про вiдмiнностi в лiпiднiй чутливостi iзоформ мозку також виходить з дослiджень з використанням iнших фосфолiпаз [Matsuda T.,Iwata H.,1986;Bougis P.E.et al.,1989].
Чутливiсть iзоформ Na+,K+-АТР-ази до DS-Na. Обробка мiкросом з сiрої речовини мозку щура DS-Na в концентрацiях, вище оптимальних,що використовуються для демаскування ферментативної активностi у везикулах, супроводжується переважаючою iнактивацiєю α1-изоформи ферменту у порiвняннi з α+. Це виявляється у послiдовному зменшеннi в препаратах вiдповiдного компонента Na+,К+-АТР-азної активностi з низькою спорiдненiстю до уабаїну при спiввiдношеннi детергент/бiлок вище величини 0,4 мг DS-Na/мг бiлка (рис.5). Уявна спорiдненiсть до уабаїну iзоформ Na+,К+-АТР-ази в процесi iнактивацiї детергентом не змiнюється, що дає можливiсть оцiнити вплив детергенту на їх активнiсть.
Для з'ясування причин специфiки iнактивацiї iзоформ Na+,К+-АТР-ази детергентом мiкросоми,обробленi DS-Na в умовах необоротної iнактивацiї, тобто при спiввiдношеннях до бiлка вище оптимальних для очистки нативних мембранозв'язаних препаратiв ферменту за методом Йоргенсена-Свiднер, центрифугували в градiєнтi щiльностi сахарози.
Як результат неоднорiдностi фiзико-хiмiчних властивостей популяцiй мембранних фрагментiв мiкросом в градiєнтi щiльностi сахарози виявляються двi бiлковi зони: на межi 15/25% сахарози (зона 1) и в 15% сахарозi (зона 2), якi вiдрiзняються за чутливiстю Na+,К+-АТР-аз до DS-Na, але, як i у випадку мiкросом,характеризуються бiльшою чутливiстю α1-iзоформи ферменту у порiвняннi з α+ до необоротної iнактивацiї детергентом (рис.6,а).
За допомогою електрофорезу в ПААГ в присутностi DS-Na препаратів мембранозв’язаної Na+,К+-АТР-ази кори головного мозку щура показано, що необоротна інактивація ізоформ детергентом супроводжується видаленням їх каталітичних субодиниць з мембран, яке превалює для α1-ізоформи (рис.6,в). В умовах рівновеликих співвідношень детергент/білок цей ефект виявлено при концентраціях DS-Na, які помірно перевищують величину критичної концентрації міцелоутворення, так і нищих за неї. Це свідчить про те, що зв’язування мономерної форми DS-Na, а не міцелярної, обумовлює специфічний до ізоформ мембранотропний ефект детергенту.
Такі закономірності інактивуючої і солюбілізуючої дії DS-Na для ізоформ Na+,К+-АТР-ази виявлено також в препаратах кори головного мозку бика (рис.6,б,г), мозочку щура, але не довгастого мозку, де чутливість ізоформ до детергенту однакова.
Отримані дані про відмінності у стабільності ізоформ Na+,К+-АТР-ази мозку до дезінтегруючої мембрану дії DS-Na вiдповiдають зробленому вище висновку про специфiку органiзацiї в плазматичних мембранах клiтин кори головного мозку бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ каталiтичної субодиницi Na+,К+-АТР-ази. Показано, що виявлений ефект DS-Na не є наслiдком вибiрного протеолiзу каталiтичної субодиницi в процесi обробки мiкросом детергентом. Специфiчна до α1-iзоформи Na+,К+-АТР-ази мембранотропна дiя DS-Na незалежно вiд типу її чутливостi до серцевих глiкозидiв (щур,бик) свiдчить про унiверсальнi особливостi її структурної органiзацiї в плазматичнiй мембранi клiтин сiрої речовини, а не бiлої речовини (довгастого мозку). Очевидно, що специфiка дiї детергенту обумовлена фiзико-хiмiчними властивостями мембрани, а саме її лiпiдного компонета, бо мають мiсце особливостi в чутливостi до DS-Na однакових iзоформ каталiтичної субодиницi Na+,К+-АТР-ази в рiзних субпопуляцiях мембранних фрагментiв кори головного мозку, а також особливостi iнактивацiї iзоформ в препаратах з рiзних тканин.
Збiльшення часу попередньої iнкубацiї мiкросом з детергентом пiдвищує ефективнiсть iнактивацiї Na+,К+-АТР-ази, но не усуває рiзницi в чутливостi iзоформ до DS-Na. Швидкiсть iнактивацiї детергентом також вища для α1-iзоформи (рис.7).
Вiдмiченi вище вiдмiнностi в чутливостi до iнактивацiї детергентом iзоформ Na+,К+-АТР-ази мозку дорослих щурiв виявляються також в мiкросомах мозку тварин молодого вiку i не залежать вiд змiни фiзико-хiмiчних властивостей плазматичних мембран в постнатальному онтогенезi. Це свiдчить, що особливостi бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ сформованi в постембрiональний перiод.
З метою вивчення впливу електростатичних взаємодiй в механiзмi iнактивацiї Na+,К+-АТР-ази детергентом дослiдження проведенi в умовах закислення середовища. Помiрне пiдвищення кислотностi середовища обробки мiкросом DS-Na в дiапазонi рН 7,5-6,2 супроводжується рiзким зростанням чутливостi Na+,К+-АТР-ази мозку щура до детергенту, що вказує на роль поверхневого заряду в забезпеченнi його iнактивуючої дiї на фермент (рис.8).
Аналiз ступеня iонiзацiї окремих груп бiлкiв та лiпiдiв в цих умовах свiдчить про можливiсть виникнення додаткових позитивних зарядiв за рахунок амiнокислотних залишкiв гiстидина,якi несуть слаболужну групу. В цьому випадку поява додаткових позитивних зарядiв може сприяти рiзкому пiдвищенню зв'язування детергенту з експонованими доменами молекули ферменту, дезорганiзацiя яких має суттєве значення в iнактивацiї ферменту.
Як видно з рис.8, захисний ефект АТР в бiльший мiрi виявляється в умовах необоротної iнактивацiї ферменту. При рН 7,5 специфiка дiї DS-Na на iзоформи каталiтичної субодиницi Na+,К+-АТР-ази iстотно не залежить вiд наявностi АТР в середовищi обробки мiкросом детергентом. Проте при закисленнi середовища виявленi закономiрностi в iнактивацiї iзоформ DS-Na зберiгаються лише в присутностi нуклеотиду. Це вказує на екрануючий ефект АТР, а приймаючи до уваги iснування контакту частини АТР-зв'язуючої дiлянки з мембраною [Lutsenko S.,Kaplan J.H.,1993], i стабiлiзуючий вплив на фермент.
Обробка мiкросом детергентом (середовище без АТР) в присутностi iонiв магнiю (кальцiю),що вносили для нейтралiзацiї анiонних груп компонентiв мембрани,супроводжується значним пiдвищенням чутливостi ферменту до DS-Na. В цьому випадку не усувається специфiка дiї детергенту на iзоформи (рис.9,а).
Для з'ясування залежностi ефекту детергенту вiд рiдинних властивостей лiпiдної фази мембрани вплив DS-Na на активнiсть iзоформ Na+,К+-АТР-ази вивчили в дiапазонi температур 20-370С. Необоротна iнактивацiя Na+,К+-АТР-ази DS-Na пiдсилюється з температурою. При екстракцiї мiкросом детергентом при 370С усуваються як вiдмiнностi в чутливостi до DS-Na Na+,К+-АТР-ази в мембранних препаратах рiзних тканин,так i окремих iзоформ в мiкросомах з кори головного мозку щура (рис.9,б).
Результати дослiджень вiдповiдають концепцiї локальної в'язкотропної регуляцiї функцiонування мембранних ферментiв, яка визначається фiзичним станом пограничних лiпiдiв [Дергунов А.Д. и др.,1984]. Зважаючи на механiзм мембранотропної дiї DS-Na на iнтегральнi бiлки [Неlenius А., Simons K.,1975;Lichtenberg D.et al.,1983;Кравцов А.В.,Алексеенко И.Р.,1993], специфiка iнактивуючого i солюбiлiзуючого впливу детергенту на iзоформи каталiтичної субодиницi Na+,К+-АТР-ази пояснюється iснуванням особливостей у доступностi гiдрофобних дiлянок на бiлку для зв'язування детергенту,обумовлених вiдмiнностями в ефективностi бiлок-лiпiдних взаємодiй.В цьому випадку ступiнь iммобiлiзацiї ацильних ланцюгiв міцно зв’язаних фосфоліпідів може характеризувати ефективність гідрофобних білково-ліпідних взаємодій, що визначає їх стійкість до заміни на білок-детергентні взаємодії. Зміна мікров’язкості пограничного ліпіду при термотропному фазовому переході супроводжується усуненням критичних відмінностей в ефективності білок-ліпідних взаємодій для ізоформ Na+,K+-ATP-ази не за рахунок ослаблення іонних взаємодій, а в результаті зміни щільності пакування пограничних ліпідів. Це приводить до конформаційної перебудови ферменту, підвищення доступності для DS-Na гідрофобних ділянок на білку, денатурації та солюбілізації ферменту.
Активність ізоформ Na+,K+-ATP-ази мозку при пероксидній модифікації мембран. Обробка препаратів мембранозв’язаної Na+,K+-ATP-ази кори головного мозку щурів в системі "Fe2+/аскорбат" приводила до необоротного інгібування ферментативної активності (рис.10,а), яке супроводжувалось паралельним утворенням МДА (рис.11) при пероксидному окисленнi лiпiдiв (ПОЛ) та зменшенням кiлькостi вiльних SH-груп в бiлкових компонентах препаратiв ферменту (75,53±3,26 та 31,92±2,65 нмолей/мг бiлка в контролi та пiсля 60 хв обробки вiдповiдно,M±m,n=3-5,p<0,05). ЕДТА усуває ефект iнактивацiї Na+,K+-ATP-ази, що вказує на зв'язок iнгiбування ферменту з механiзмом iнiцiацiї окисних процесiв iонами перехiдних металiв (Fe).
Комплекснiсть та паралельнiсть процесiв пероксидної модифiкацiї лiпiдного та бiлкового компонентiв мембрани не дозволяє диференцiювати їх вплив при порушеннi функцiонування Na+,K+-ATP-ази і доказово стверджувати про первопричину її окисної інактивації в нейрональній мембрані. Тому дослідження були спрямовані на вивчення внеску окисної модифікації білкової молекули ферменту та ліпідного матриксу мембрани в механізм інактивації Na+,K+-ATP-ази.
|
