Библиотечный каталог авторефератов Украины

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

Єсилевський Семен Олександрович

УДК 577.322

стохастичні колективні ефекти у функціонуванні іонних каналів та процесі фолдінгу білків

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фізико-математичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізики НАН України.

Науковий керівник        доктор фізико-математичних наук,

               професор
       Харкянен Валерій Миколайович,
       Інститут фізики НАН України,
       завідуючий відділом фізики
       біологічних систем.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник

Єрмаков Володимир Миколайович, Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, провідний науковий співробітник відділу нелінійної фізики конденсованих середовищ (м. Київ);

доктор фізико-математичний наук, старший науковий співробітник

Горбенко Галина Петрівна, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, професор кафедри біологічної та медичної фізики (м. Харків).

Провідна установа:

       Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біофізики.

Захист відбудеться “11” березня 2005 р. о 1500  годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна,

61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4 .

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розіслано “08” лютого 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                        Гаташ С.В.

Загальна характеристика роботи

       Актуальність теми. В останні роки методами біохімії та молекулярної біології було доведено вирішальну роль колективних рухів в процесах ферментативного каталізу, трансмембранного транспорту, молекулярної рецепції та сигналізації, функціонуванні молекулярних моторів, фолдінгу білків і т.д. Одними з найбільш активно досліджуваних сьогодні є процеси іонного транспорту та фолдінгу білків, розуміння яких матиме як загальнонаукове значення так і прямі практичні наслідки для медицини, біотехнології, нанотехнології та  ін. Не зважаючи на появу великої кількості експериментального матеріалу, у біофізиці іонного транспорту та фолдінгу білків спостерігається відсутність теоретичних моделей, які б не тільки розкривали основні фізичні механізми цих процесів, а й базувалися на новітніх даних щодо структурної організації відповідних макромолекул та ролі колективної стохастичної поведінки в їх функціонуванні. Це робить задачу створення таких моделей надзвичайно актуальною, як в фундаментальному аспекті так і для можливих практичних застосувань.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у відповідності з планами відділу фізики біологічних систем Інституту фізики НАН України щодо дослідження явищ структурно-функціональної самоорганізації біомакромолекул у нерівноважних умовах. Дослідження проводилися в рамках теми 1.4.1.В/81 “Дослідження структурних особливостей та нелінійної динаміки біологічних макромолекул та утворених ними структур” (№ держреєстрації 0102V000596).

Мета і задачі дослідження. Метою даної дисертаційної роботи є створення теоретичних моделей процесів іонного транспорту та фолдінгу білків, що розкривають основні фізичні механізми цих процесів та базуються на новітніх даних щодо структурної організації відповідних макромолекул та ролі колективної стохастичної динаміки в їх функціонуванні.

Для досягнення даної мети розв’язувалися наступні задачі:

1. побудова загальної теоретичної моделі іонного каналу з множинною заселеністю, потенціальний профіль якого має вигляд широкої потенціальної ями, що відповідає наявним даним про структуру цього об’єкта;
2. застосування загальної теорії до калієвого каналу KcsA з відомою просторовою структурою. Розрахунок макроскопічних параметрів каналу за допомогою теоретичних залежностей та методу броунівської динаміки. Аналіз застосовності теоретичної моделі;
3. розробка теоретичного підходу для врахування явища іонно-конформаційної взаємодії у каналі з множинною заселеністю;
4. теоретичне дослідження явища безбар’єрної виштовхувальної провідності в іонних каналах. Перевірка гіпотези про універсальність та оптимальність даного механізму провідності.
5. аналіз можливості реалістичного опису колективних рухів у гратковій моделі фолдінгу білків;
6. побудова нового алгоритму фолдінгу у гратковій моделі, який враховує структурно-специфічні мікронеоборотні колективні рухи; порівняльний аналіз енергетики, кінетики та термодинаміки фолдінгу модельних послідовностей розрахованих за допомогою нового та традиційних алгоритмів.

Об’єктом дослідження були іонні канали біологічних мембран та білки, що згортаються у процесі фолдінгу.

Предметом дослідження була роль колективних стохастичних ефектів в іонному транспорті через іонні канали біомембран та фолдінгу білків. Для іонних каналів предметом досліджень є колективна стохастична динаміка іонів в порах багатоіонних каналів та ефекти взаємодії іонного потоку з колективними конформаційними рухами, що призводять до явищ структурно-функціональної самоорганізації. Для явищ фолдінгу предметом досліджень є колективні стохастичні ефекти при утворенні нативної структури білку в рамках граткових моделей фолдінгу.

Методи дослідження:

1. методи теоретико-фізичного дослідження – використовувалися при побудові математичних моделей досліджуваних явищ;
2. метод чисельного комп’ютерного моделювання – використовувався для чисельного розв’язку отриманих рівнянь, аналізу поведінки моделей при різних значеннях параметрів, підбору оптимальних значень емпіричних констант, співставлення результатів моделювання з експериментальними даними.

Наукова новизна одержаних результатів

1. В роботі вперше створено теоретичну модель явища іонної провідності в порі багатоіонного мембранного каналу, яка базується на уявленні про специфічні квазічастинки (суперіони), що утворюються колективом іонів в порі і є переносниками заряду в системі. У моделі вперше використано енергетичний профіль каналу, який має вигляд широкої потенціальної ями з множинною заселеністю і відповідає профілю, побудованому на основі експериментальних даних. Іонна провідність розглядається як колективний процес руху квазічастинки (суперіону), що не зводиться

до переміщення поодиноких іонів. Модель успішно застосовано для розрахунку макроскопічних характеристик калієвого каналу KcsA з відомою просторовою структурою.

2. Удосконалено модель структурно-функціональної самоорганізації в іонному каналі, що виникає через наявність іонно-конформаційної взаємодії. Уявлення про суперіони та негармонійність конформаційних потенціалів вперше дозволили застосувати концепцію іонно-конформаційної взаємодії до багатоіонних каналів.
3. Створено новий метод чисельного моделювання колективної динаміки кластерів в процесі фолдінгу білків в рамках граткових моделей – алгоритм СМС. Унікальність методу полягає в тому, що він, на відміну від існуючих, дозволяє проводити моделювання нерівноважних структурно-специфічних колективних рухів кластерів у процесі фолдінгу. Метод дозволяє фізично коректно описати колективну динаміку в процесі фолдінгу в рамках граткових моделей, що підтверджено різнобічним порівняльним аналізом.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонована в роботі модель іонного транспорту може використовуватися для подальшого дослідження іонної провідності в моделях реальних каналів. Модель дозволяє описати явища в тому часовому інтервалі, який лежить між мілісекундним діапазоном, доступним для експериментальних методів, та наносекундним діапазоном, що доступний для методів молекулярної динаміки. Концепція іонно-конформаційної взаємодії може використовуватися для напрямленого пошуку функціонально важливих структурних детермінант іонних каналів, зокрема для виявлення колективних воротних рухів та їх зв’зку з іонним потоком.

       Метод СМС для моделювання фолдінгу може знайти широке застосування в дослідженні кінетики фолдінгу в граткових та неграткових моделях та дослідженнях конструйованості конформацій білку. Застосування концепції колективної динаміки кластерів до досліджень фолдінгу реальних білків може значно скоротити потрібні для цього розрахункові потужності та дозволити наблизитися до практичного визначення нативної конформації білків по їх амінокислотній послідовності.

Особистий внесок здобувача. У наукових роботах опублікованих із співавторами особистий внесок здобувача полягає у наступному:

у роботі [1] значний обсяг теоретичної роботи, обробка та інтерпретація результатів; у роботах [2-5, 7-10] участь у постановці задачі, значна частина теоретичної роботи, створення комп’ютерних програм для розрахунків та їх проведення, практично весь обсяг роботи з аналізу та інтерпретації результатів; у роботі [6] експериментальна робота по вимірюванню струмів і вольт-амперних характеристик поодиноких каналів типу Kir методом patch-clamp, участь у математичній обробці експериментальних даних, аналізі та інтерпретації результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені та доповідалися на:

Міжнародній школі фізики ім. Енріко Фермі “Protein folding evolution and design” (2000, Варенна, Італія); наукових семінарах департаменту біохімії Інституту ім. Вейцмана (2001, Реховот, Ізраїль); науковому семінарі інституту Max-Plank Institute of Biophysics (2001, Франкфурт-на-Майні, Німеччина), конференціях “Дні науки НаУКМА” (2000, 2001, 2002, 2004, Київ); конференції “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії - 2002” (2002, Київ); III з’їзді українського біофізичного товариства (Львів, 2002); конференції “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (2004, Київ), щорічній науковій конференції Інституту фізики НАНУ (2004, Київ); науковому семінарі Інституту теоретичної фізики НАНУ (2004, Київ).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано у 10 статтях у наукових журналах [1-10] та 2 тезах доповідей наукових конференцій [11-12].

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, шести розділів, висновків, переліку використаних джерел та трьох додатків. Загальний обсяг дисертації складає 135 сторінок, містить 34 рисунка, з них 5 займають 5 повних сторінок, 5 таблиць, з яких одна займає повну сторінку. Додатки займають 3 сторінки. Список використаних джерел містить 105 найменувань та займає 9 сторінок.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету та перелічено задачі, які необхідно розв’язати для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертації.

У Розділі 1 проведено огляд літератури за темою дослідження. Викладено сучасні уявлення про класифікацію та функціональні властивості іонних каналів. Детально розглянуто структурно-функціональні особливості каналу KcsA, можливі воротні механізми, структурні детермінанти селективності. Описано механізм безбар’єрної виштовхувальної провідності (БВП) каналу KcsA. Проаналізовано традиційні моделі багатоіонних каналів та їх недоліки. Викладено концепцію іонно-конформаційної взаємодії (ІКВ). Проведено огляд сучасного стану біофізики фолдінгу білків. Викладено основні концепції та гіпотези формування нативної структури білків. Детально проаналізовано граткові моделі фолдінгу та методи Монте-Карло, що застосовуються для моделювання фолдінгу.

У розділі 2 розвинуто загальну теорію іонного каналу з множинною заселеністю. Канал розглянуто як квазіодновимірну аксіально-симетричну систему, що сполучається з зовнішніми розчинами. Введено одноіонний потенціальний профіль (ОПП) , який задає енергію поодинокого іону в точці x на осі пори та включає взаємодію іону зі стінками пори і вклад мембранного потенціалу, а також енергію міжіонної взаємодії , де r – відстань між іонами. Рух іонів в порі описується рівнянням Ланжевена

,        (1)

де та – сили, що діють на і-ий іон з боку стінок пори та інших іонів відповідно; xi – положення і-ого іона; – коефіцієнт тертя; – білий шум.

Після переходу до нових координат

,  ,        

де q – положення центру мас всіх іонів в порі; pi – відстані між парами сусідніх іонів; N – кількість іонів в порі, рівняння (1) набувають вигляду

       (2)

Можна показати, що у випадку сильної міжіонної взаємодії та достатньо гладкого потенціалу , рух центру мас іонів q в системі (2) можна розглядати в адіабатичному наближенні. Рух центру мас q вважається повільним по відношенню до швидких флуктуацій міжіонних відстаней p. Після адіабатичного виключення швидких змінних маємо

,        (3)

де – ефективний коефіцієнт дифузії, – сила в ефективному потенціалі,
– квазірівноважний розподіл міжіонних відстаней при даному q.

Рівняння (3) є рівнянням Ланжевена для частинки з масою N мас іона, яка дифузійно рухається в ефективному потенціалі Ueff. Таким чином рух багатьох іонів в порі каналу у випадку сильної міжіонної взаємодії можна звести до руху їхнього центру мас. Його можна розглядати як квазічастинку, яку ми назвали суперіоном.

Після врахування можливості обміну іонами з зовнішніми розчинами було отримано систему рівнянь, що описує розподіл суперіонів по довжині відкритого каналу:

       (4)

де PN(q) імовірність знаходження суперіона розмірності N у точці q; та – імовірності знаходження іонів у “зонах виходу” шириною Δx на кінцях

каналу; – імовірності входу іонів в канал з розчинів з ефективними концентраціями CL та CR; L – напівдовжина каналу; k – кінетична константа переходу через границю каналу.

       На основі системи (4) було отримано вирази для струму I та середньої заселеності Nmean каналу:

;        (5)

,        (6)

де I0 – емпірична константа.

Рівняння (5) та (6) є основним результатом побудованої загальної теорії іонного каналу з множинною заселеністю.

       У розділі 3 загальну теорію було застосовано до селективного фільтру каналу KcsA з відомою структурою. Одноіонний потенціальний профіль було отримано апроксимацією профілю, розрахованого методами молекулярної динаміки для реальної структури. Вплив мембранного потенціалу враховано у наближенні Гольдмана:

,

де – мембранний потенціал; q – заряд іона; a – глибина ями одноіонного потенціального профілю.

Міжіонні взаємодії було взято у вигляді екранованого кулонівського потенціалу

,

де d – ефективна константа екранування.

Константу d було визначено з міркувань наявності в каналі БВП. Необхідною умовою цього є рівність енергій рівноважних станів подвійної та потрійної заселеності, з якої можна визначити d. Для модельного каналу було підтверджено застосовність адіабатичного наближення шляхом чисельного розрахунку відповідних умов. Макроскопічні характеристики каналу було розраховано за допомогою формул (5) та (6), а також прямого чисельного моделювання методом одновимірної броунівської динаміки. Порівняння результатів (рис. 1) свідчить про застосовність запропонованої теоретичної моделі. Показано, що спрощене описання іонного транспорту з використанням концепції суперіонів дозволяє отримувати макрохарактеристики каналу з високою точністю на основі чітких фізичних принципів.

Рис. 1. Макроскопічні характеристики каналу. а) Вольт-амперні характеристики каналу отримані теоретично за допомогою рівняння (5) та розраховані методом БД; б) Середні заселеності каналу отримані теоретично за допомогою рівняння (6) та розраховані методом БД;

У розділі 4 до модельного каналу застосовано концепцію ІКВ для пояснення появи дискретних станів провідності і моделювання швидких воротних процесів. Застосування ІКВ у його канонічному варіанті до багатоіонних каналів стикається з численними труднощами. Введення концепції суперіонів дозволяє звести задачу руху багатьох іонів до руху єдиної частинки – суперіона, що вже містить усереднення за швидкими ступенями вільності. Це значно спрощує задачу.

Як структурну координату ІКВ обрано глибину ями ОПП а, що робить розгляд незалежним від атомістичних деталей структури конкретного каналу. Параметром, що впливає на структурну координату обрано середню іонну заселеність. Проаналізовано залежність середньої заселеності від а. Рівняння руху структурної координати взято у вигляді

       (7)

де – структурний потенціал, який визначається будовою каналоутворюючого білку і описує енергію структури в залежності від значення координати а при відсутності іонів в порі; – сила, яка діє на конформаційну координату з боку іонів, що знаходяться у порі; N(a,ц) – заселеність каналу, яка залежить від конформаційної координати; Da – коефіцієнт дифузії; – білий шум.

       У лінійному наближенні впливу іонів на структуру стаціонарні стани системи визначаються як

,

де k – інтенсивність дії іонів на структуру.

Структурний потенціал обрано у вигляді

,        (8)

де U0 – точка відліку енергії структури; A, B, P, Q, r1, r2 – емпіричні константи. Наведено фізичні аргументи на користь вибору потенціалу у вигляді (8). На основі рівнянь (7) та (8) введено конформаційний потенціал

,        (9)

де а0 – точка відліку енергії. Він задає енергетичний профіль вздовж конформаційної координати в присутності іонів в порі каналу, тобто відповідає самоузгодженому режиму функціонування системи. Мінімуми цього потенціалу відповідають стаціонарним станам. Вигляд конформаційного потенціалу наведено на рис. 2.

Рис. 2. Вигляд конформаційного потенціалу системи: (а) – при концентрації іонів С = 0.01; (б) – при концентрації іонів С = 0.01; 1 – мембранний потенціал мВ; 2 – мембранний потенціал мВ; 3 – мембранний потенціал мВ.

Показано, що одна з ям може бути ідентифікована як закритий стан каналу, в якому струм через систему мінімальний, а інша я відкритий стан з максимальним струмом. Стохастичні активаційні переходи через потенціальний бар’єр на рис. 2 можуть відповідати швидкому воротному процесу в селективному фільтрі реальних каналів.

       У розділі 5 проаналізовано концепцію БВП. Вирішено питання про можливу універсальність цього механізму провідності для багатоіонних каналів. БВП узагальнено на випадок чергування довільних ізоенергетичних станів заселеності N та N+1 (для каналу KcsA N=2). Сформульовано необхідну умову існування узагальненого БВП:

,        (10)

де – рівноважні координати іонів у стані заселеності N; N – переважаючий стан заселеності каналу (порядок БВП); EN – енергія системи іонів у рівноважних умовах. Цю умову зручно виражати явними залежностями , що розраховуються чисельно. Досліджено серію модельних каналів, що відрізняються значеннями параметрів a та d в межах kT з кроком 2.5 kT, Е з кроком 0.15 Å. Для кожної комбінації значень проведено серію розрахунків за методом БД, в яких визначався струм та середня заселеність модельного каналу. Струм через канал наведено на рис. 3 у вигляді контурного графіку.

Ділянки великого струму являють собою чітко окреслені “гребені”, розділені зонами, де струм порівняно малий. Криві БВП практично точно співпадають з найвищими точками гребенів струму.

Отримані результати свідчать, що:

1. БВП можливе для значень , застосовність цього принципу не обмежується випадком N = 2, який реалізується у каналі KcsA.
2. Умови (10) є достатніми для існування БВП.
3. Струм в режимі БВП є максимально можливим при заданих умовах.

Отже, концепція БВП може бути універсальним механізмом провідності у багатоіонних каналах довільної заселеності, що забезпечує протікання через канал найбільшого можливого струму.

Рис. 3. Залежність струму через модельний канал від параметрів a та d. Контурний графік. На графік накладено сімейство кривих для різних значень N.

       У розділі 6 розвинуто модель врахування колективної стохастичної динаміки у гратковій моделі фолдінгу. Показано, що для адекватного опису колективних рухів ланцюгу у граткових моделях необхідно використовувати структурно-специфічний, мікронеоборотний, нелокальний набір дозволених рухів (НДР) у методі Монте-Карло. Описано запропонований автором новий метод моделювання фолдінгу – алгоритм СМС, що відповідає цим вимогам.

Основною ідеєю СМС є розгляд руху не окремого залишку, а кластеру залишків, розмір якого може варіювати. Фолдінг ланцюгу розглядається як процес утворення, асоціації, переміщення та розпаду кластерів. Рухи кластерів є мікронеоборотними і структурно- специфічними. Вони ініціюється рівноважними тепловими флуктуаціями “термостату” яким є оточуючий розчин. Енергія флуктуації витрачається на рух кластера та частково дисипує через наявність в’язкого тертя. Це дозволяє моделювати дисипативні ефекти в’язкості в рамках граткових моделей. Вказані риси алгоритму СМС є унікальними і вирізняють його з поміж традиційних методів, що оперують мікрооборотними неспецифічними рухами. Наведено детальну схему алгоритму та обґрунтування його фізичних положень. Блок-схему алгоритму СМС наведено на рис. 4.

Рис. 4. Блок-схема алгоритму СМС.

Для того щоб показати застосовність та переваги алгоритму СМС було розглянуто дві “мінімальні” спеціально сконструйовані послідовності довжиною 12 залишків на квадратній двовимірній гратці з використанням алфавіту PMN (рис. 5).

Було проведено велику серію розрахунків з використанням алгоритму СМС та двох традиційних алгоритмів – LMS та MS2. Було розраховано карти часів перебування, середні часи фолдінгу в залежності від температури і в’язкості розчинника (рис. 7), високо- та низькотемпературні енергетичні розподіли, характеристики переходу фолдінгу та коефіцієнти переходу (ТС) для обох послідовностей. Результати, отримані за допомогою різних алгоритмів, було піддано детальному порівняльному аналізу. Результати розрахунку ТС для послідовності 1, наведено на рис. 6. Чітко видно різну структуру інтермедіатів фолдінгу викликану відмінностями між традиційними алгоритмами та алгоритмом СМС. Аналіз отриманих даних дозволив чітко виявити артефакти традиційних методів, зокрема пов’язані з ігноруванням або нефізичним описом колективних рухів.

Отримані результати свідчать про те, що метод СМС адекватно описує процес фолдінгу, явно враховує поступове звуження конформаційного простору ланцюгу, коректно моделює колективні стохастичні рухи (динаміку кластерів) та враховує дисипативні ефекти в’язкості. СМС усуває штучні обмеження та нефізичні припущення щодо колективних рухів присутні у традиційних алгоритмах. Алгоритм СМС на сьогодні може вважатися найкращим наближенням при описі колективної динаміки в рамках граткових моделей.

Рис. 6. Коефіцієнти переходу (ТС) для послідовності 1 отримані у розрахунках методами СМС та MS2. Ліві графіки – ТС для кожної з 5696 можливих конформацій; праві графіки – гістограми густини станів. Поряд з гістограмами наведено схеми окремих конформацій.

Рис. 7. Середній час фолдінгу послідовності 1 як функція температури отримана за допомогою методів LMS, MS2 та CMC. У випадку методу СМС подано значення параметра Er0, що пропорційний модельній в’язкості. Оптимальну температуру фолдінгу позначено вертикальними лініями.

Висновки

Теоретично досліджено роль колективних стохастичних ефектів у білкових макромолекулах, які проявляються у процесах функціонування іонних каналів та фолдінгу білків. Створено теоретичні моделі цих процесів, що розкривають їх основні фізичні механізми та базуються на новітніх даних щодо структурної організації відповідних макромолекул. Показано, що стохастична колективна динаміка грає ключову роль у таких різних системах як іонні канали та білкові ланцюги під час фолдінгу. Це дозволяє зробити припущення про те, що  стохастична колективна динаміка є універсальним механізмом, який забезпечує зборку та функціонування білкових макромолекул.

1. Досліджено колективну стохастичну динаміку іонів в порах багатоіонних каналів. Створено нову теоретичну модель провідності багатоіонного каналу, що базується на концепції суперіонів та використовує новітні дані про структуру та механізм провідності іонних каналів.

2. Доведено універсальний характер явища безбар’єрної виштовхувальної провідності для багатоіонних каналів.
3. В контексті концепції суперіонів досліджено ефекти взаємодії іонного потоку в каналі з колективними конформаційними рухами, що призводять до явищ структурно-функціональної самоорганізації. Удосконалено модель іонно-конформаційної взаємодії, що дозволяє використовувати її для багатоіонних каналів.
4. Теоретично вивчено колективні стохастичні ефекти при утворенні нативної структури білку. Сформульовано концепцію ієрархічної динаміки кластерів під час фолдінгу.
5. Створено новий метод чисельного моделювання фолдінгу в граткових моделях – алгоритм СМС, який дозволяє описувати нерівноважні структурно-специфічні колективні рухи кластерів в процесі фолдінгу. В результаті різнобічного порівняльного аналізу доведено, що новий метод найбільш адекватно описує колективну динаміку в процесі фолдінгу.

список опублікованих праць за темою дисертації