|
Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна
Гладковська Наталя Олександрівна
УДК 577.32
Спектрофотометричний аналіз зв'язування біологічно активних лігандів з молекулами ДНК
03.00.02. – біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фізико-математичних наук
Харків – 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова
НАН України (м. Харків)
Науковий керівник:
доктор фізико-математичних наук, професор
Малєєв Володимир Якович, Інститут радіофізики та електроніки
ім. О.Я. Усикова НАН України, старший науковий співробітник
відділу біофізики
Офіційні опоненти:
доктор фізико-математичних наук, професор Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур
ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник
відділу молекулярної біофізики (м. Харків);
кандидат фізико-математичних наук, доцент Євстигнєєв Максим
Павлович, Севастопольський національний технічний університет,
доцент кафедри фізики.
Провідна установа:
Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,
кафедра біофізики.
Захист відбудеться " 9 " 06 2006 року о 15 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному
університеті ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків,
пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий " 6 " 05 2006 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Взаємодія малих молекул з ДНК активно вивчається останні десятиліття з метою з'ясування молекулярних механізмів і розвитку технологій синтезу нових ефективних лікарських препаратів. Багато малих молекул - лігандів, що в експериментах іn vіtro зв'язуються з ДНК, використовуються як лікарські препарати, не дивлячись на те, що механізми їхньої дії повністю не з'ясовані. В останні роки інтерес до цієї області досліджень зростає у зв'язку з розвитком біотехнологічної індустрії, що дозволяє використовувати відносно недорогі методи тестування будь-яких новосинтезованих лікарських препаратів на молекулярному рівні і прогнозувати їхню ефективність на рівні клітин. Дослідження іn vіtro комплексоутворення таких малих молекул з нуклеїновими кислотами (ДНК, РНК, олігонуклеотидами) є одним з основних напрямків в області створення нових протипухлинних препаратів. Розробка методик, що дозволяють швидко, якісно і без особливих витрат оцінювати термодинамічні параметри і механізми зв'язування біологічно активних речовин з НК, є на даний момент актуальною задачею.
У представленій дисертаційній роботі запропоновано новий комплексний підхід до аналізу спектрофотометричних даних у системах ДНК - біологічно активний ліганд. Ефективність запропонованого підходу була перевірена при вивченні комплексоутворення двох біологічно активних лігандів: актиноцинового похідного актиноцил-біс-(діметиламіноетил) аміна (Act ІІ) і нуклеозиду 6-азацитідіну (6AZC) з молекулами ДНК. Актиноцинове похідне Act ІІ є аналогом відомого протипухлинного антибіотика актиноміцину D, що використовується при лікуванні деяких типів захворювань, у тому числі й онкологічних. Біологічно активний нуклеозид 6AZC також використовується при лікуванні деяких типів онкологічних захворювань (лейкемія). Молекулярні принципи взаємодії Act ІІ і 6AZC з полінуклеотидними матрицями різні, тому що речовини, які досліджуються, мають різні потенційні можливості для зв'язування з молекулами ДНК. Можливості спектрофотометричного аналізу для характеристики комплексоутворення лігандів з ДНК вважаються досить обмеженими. Ми пропонуємо такий підхід, при якому поєднання спектрофотометричних вимірів і розрахункових методів дозволяють одержувати більш повну інформацію про спектральні і термодинамічні характеристики всіх комплексів, що утворюються, у системах ліганд - ДНК.
Зв'язок роботи з науковими програмами планами, темами.
Дослідження за темою дисертації проводилися згідно з планом науково-дослідницьких робіт відділу біофізики Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України в рамках фундаментальних держбюджетних НДР: "Фізичні механізми взаємодії новосинтезованих біологічно активних речовин з гідратованою ДНК" (Шифр "Ліганд", номер держреєстрації 0100U006336, постанова Бюро ВФА НАН України від 24.10.2000, протокол № 9, 2001-2003 рр.); "Дослідження взаємодії електромагнітних та акустичних полів, а також електронних пучків з твердотільними та біологічними структурами" (Шифр "Структура", номер держреєстрації 0102U003139, постанова Бюро ВФА НАН України від 19.02.02, протокол № 2, 2002-2006 рр.); " Дослідження енергетичних та гідратаційних характеристик взаємодії біологічно активних речовин з полінуклеотидними та колагеновими матрицями" (Шифр "Спіраль", номер держреєстрації 0103U002268, постанова Бюро ВФА НАН України від 27.11.2003, протокол № 11, 2004-2006 рр.).
Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи є розробка нових спектрофотометричних методик, що дозволяють аналізувати поглинання суміші ліганд - НК на основі розрахункових методів комп'ютерного моделювання. За допомогою цих методик можна одержати інформацію про особливості зв'язування лігандів з НК при різних іонних силах і температурах, а також розраховувати термодинамічні параметри зв'язування. У роботі на прикладі реальних систем ліганд - поліелектроліт показано практичне застосування розробленого нами підходу. У роботі були поставлені і вирішувались наступні задачі:
- Порівняти наявні теоретичні моделі, що дозволяють адекватно описувати спектрофотометричні концентраційні залежності в досліджуваних системах ліганд - ДНК, і вибрати для кожної розглянутої системи оптимальну модель.
- Розглянути ефективність використаного нами підходу у випадку, коли поглинання ліганду і поліелектролітної матриці не збігаються (Act ІІ і ДНК), і коли поглинання біологічно активної речовини і поліелектроліту дуже близькі (6AZC і ДНК).
- Провести спектрофотометричний аналіз комплексоутворення похідного актиноцина Act ІІ з матрицями поліфосфату і ДНК різного АТ-, ГЦ- складу в залежності від іонної сили і температури розчинів.
- Дослідити різницю в процесах зв'язування біологічно активного нуклеозиду 6AZC з нативной ДНК і з ДНК зі структурними ушкодженнями.
- Використовуючи обрані моделі зв'язування за допомогою розроблених нами алгоритмів і відповідних комп'ютерних програм оптимізації в системах ліганд - поліелектроліт розрахувати спектральні (молярні коефіцієнти екстинкції для всіх комплексів, що утворюються) і термодинамічні (величини констант і місць зв'язування) параметри при різних іонних силах і температурах.
- Використовуючи отримані температурні залежності констант зв'язування розрахувати термодинамічні параметри зв'язування ΔG, ΔH, ΔS у сумішах Act ІІ - ДНК і 6AZC - ДНК.
- Порівняти величини зсуву температур плавлення δТm, які отримані з експериментальних кривих плавлення сумішей (Act ІІ - ДНК різного АТ-, ГЦ - складу і 6AZC - ДНК, яка виділена з опромінених тварин) з результатами теоретичних розрахунків.
Об'єктом досліджень є комплекси біологічно активних лігандів з поліаніонами, включаючи поліфосфат, ДНК різного АТ-, ГЦ - складу і ДНК з ушкодженнями в структурі.
Предмет дослідження: моделювання процесів комплексоутворення в сумішах ліганд - поліелектроліт на основі аналізу спектрофотометричних концентраційних залежностей.
Методи дослідження: спектрофотометричне титрування у видимій та ультрафіолетовій областях спектра, дослідження кривих плавлення полінуклеотидів в УФ-області спектра, чисельні методи комп'ютерного моделювання комплексоутворення в системах ліганд - поліелектроліт.
Наукове значення і новизна. У даній роботі розроблено новий підхід до аналізу спектрофотометричних концентраційних залежностей у сумішах ліганд - поліелектроліт. Використовуючи запропоновану методику, можна вибирати оптимальну модель комплексоутворення, одержувати детальну інформацію про типи комплексів і їх стехіометрію, обчислювати спектральні і термодинамічні параметри зв'язування лікарських препаратів з полінуклеотидними матрицями при різних іонних силах і температурах.
- Для кожної розглянутої суміші ліганд - ДНК, використовуючи програми оптимізації спектрофотометричних концентраційних залежностей, були розраховані величини констант і місць зв'язування;
- Для сумішей Act ІІ - ДНК розраховані спектри поглинання комплексів, що утворюються, у широкій області концентрацій при різних іонних силах і температурах. Отримані залежності констант зв'язування від іонної сили дозволили оцінити внесок поліелектролітних взаємодій (ΔGpe) для кожного типу комплексів у загальну вільну енергію зв'язування;
- З аналізу температурних залежностей констант зв'язування в сумішах Act ІІ - ДНК і 6AZC - ДНК отримані величини термодинамічних параметрів ΔG, ΔH, ΔS для кожного типу комплексів при різних концентраціях солі в розчині. Показано, що стабілізація комплексів Act ІІ з ДНК досягається в основному за рахунок енергії водневих зв'язків і конформаційних змін. Зв'язування 6AZC із ДНК відбувається за рахунок гідрофобних взаємодій;
- Отримано криві плавлення для всіх розглянутих зразків ДНК у відсутності та у присутності лігандів. Величини зсуву температур плавлення у всіх розглянутих системах ДНК - ліганд оцінено безпосередньо з експериментальних даних і порівняно з відповідними величинами, що отримані за допомогою розрахункових методів.
Практична цінність. Зв'язування лікарських препаратів із ДНК і полінуклеотидними матрицями відбувається різними способами (інтеркаляція, розміщення в малій і великій борозенках ДНК і ін.). Мультимодальність зв'язування в таких системах призводить до труднощів при визначенні спектральних характеристик різних типів комплексів, до неоднозначності при побудові ізотерм зв'язування в різних довжинах хвиль і при обчисленні термодинамічних параметрів комплексоутворення (констант і величин місць зв'язування). Розходження в молярних коефіцієнтах екстинкції зв'язаних з ДНК лігандів можуть спостерігатися при їхньому розміщенні на сусідніх і віддалених друг від друга місцях зв'язування: мономерно зв'язані й агреговані ліганди (кооперативне зв'язування). Крім того, деякі лікарські препарати можуть взаємодіяти з матрицею ДНК одночасно двома способами, шляхом інтеркаляції і розміщаючись у малій чи великій борозенках ДНК, виявляючи АТ- або GС- специфічність. У зв'язку з викладеним вище, важливо вміти обчислювати термодинамічні параметри зв'язування лігандів із ДНК з урахуванням розходжень у спектрах поглинання всіх комплексів, що утворюються.
Запропонована нами методика аналізу спектрофотометричних концентраційних залежностей сумішей ліганд - ДНК дозволяє досить швидко тестувати зв'язування будь-якого новосинтезованого препарату з НК, комбінуючи спектрофотометричні дослідження з чисельними методами комп'ютерного моделювання. Такий підхід дозволяє вибирати оптимальну модель зв'язування лікарських препаратів з полінуклеотидними матрицями, обчислювати спектральні і термодинамічні параметри комплексів, що утворюються, при різних іонних силах і температурах. Отримані оптимальні величини констант і місць зв'язування дозволяють розраховувати рівноважний склад сумішей ліганд - ДНК при будь-яких концентраціях реагуючих компонентів і вибирати такі співвідношення концентрацій лиганда і ДНК, у яких концентрація найбільш ефективно діючого комплексу (наприклад, інтеркаляція) максимальна. Додаткові дослідження сумішей ліганд - ДНК саме в цих концентраційних областях методами Раман- чи ІЧ- спектроскопії дозволяють визначити групи атомів лікарського препарату, що беруть участь в утворенні кожного типу комплексів.
Особистий внесок здобувача. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача складається: у роботах [1-3] участь у проведенні експериментальних досліджень по приготуванню і плавленню сумішей 6AZC - ДНК, обговоренні отриманих результатів по зв'язуванню біологічно активних нуклеозидів з матрицями ДНК різного ступеня деградації; у роботах [4-7] - у проведенні спектрофотометричного титрування сумішей Act ІІ - ДНК різного АТ-, ГЦ - складу при різних іонних силах і температурах, розрахунках по програмах оптимізації констант і величин місць зв'язування для різних типів комплексів, внеску поліелектролітних взаємодій і термодинамічних параметрів зв'язування ΔG, ΔH, ΔS. У роботах [8-22] участь в експериментальних і розрахункових дослідженнях для всіх розглянутих систем, в аналізі літературних даних та разом зі співавторами в інтерпретації отриманих результатів.
Апробація роботи.
Основні результати дисертаційної роботи були представлені на:
- ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства. Харків, 1998.
- XV Іnternatіonal School -Semіnar. Spectroscopy of Molecules and Crystals. Chernіhіv, 2001.
- Другій Харківській конференції молодих вчених. "Радіофізика і НВЧ електроніка". 2002.
- X Міжнародній конференції "Математика. Компьютер. Образование." Пущино. 2003 р.
- Третій Харківській конференції молодих учених. "Микроволновая электроника и радиолокация", Харків, Україна. Усна доповідь "Взаимодействие актиноциновых антибиотиков с молекулами ДНК разного АТ -, ГЦ – состава" відзначена дипломом І ступеня як краща доповідь у секції "Біофізика" (наказ № 2 від 16.01.2004)- 2004.
- 5th Іnternatіonal Conference on Bіologіcal Physіcs. ІSBP 2004, August 23-27, Gothenburg, Sweden.
- Четвертій Харківській конференції молодих вчених "Радиофизика и СВЧ электроника". Україна. Усна доповідь "Расчет термодинамических параметров связывания ΔH, ΔS, ΔG для комплексов Act II – ДНКCl.perf. и Act II – ДНКM.lys. из спектрофотометрических данных " відзначена дипломом І ступеня як краща доповідь у секції "Біофізика" (наказ № 199/ОК від 15.12.2004)-2004.
- І Українській науковій конференції "Проблеми біологічної і медичної фізики". ПБМФ - 2004.Харків
- V Іnternatіonal Young Scіentіfіc Conference - SPO 2004. Problems of optіcs and hіgh technology materіal scіence. Kyіv. Ukraіne.
- Семінарах відділу біофізики ІРЕ НАН України.
- Семінарі харківського відділення Українського біофізичного товариства, Харків, 2006
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, шести розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 140 сторінок, містить 59 рисунків, 11 таблиць, з них 1 рисунок розміщений на 1 окремому аркуші. Список використаних джерел містить 224 найменування на 22 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мету і визначені задачі дослідження, відзначені наукова новизна і практичне значення роботи, приведені відомості про апробацію результатів.
У першому розділі представлено огляд літератури за темою дисертації. Розглянуто літературні дані, що на сучасному рівні висвітлюють комплексоутворення біологічно активних лігандів з молекулами ДНК. Висвітлено основні методи розрахунку параметрів зв’язування в системах ліганд – ДНК та вплив на них іонної сили та температури. Проаналізовано термодинамічні складові вільної енергії утворення різних типів комплексів лігандів з ДНК та наведено схеми ентальпійно-ентропійної компенсації.
У другому розділі коротко розглянуто фізичні основи використаних методів дослідження: спектрофотометрії у видимій та ультрафіолетовій областях; наведені характеристики вивчених препаратів.
Вимірювання спектрів поглинання сумішей ліганд – поліелектроліт при різних значеннях P/D, де P/D - відношення концентрації фосфатів поліелектролітів (Cp0) до концентрації ліганду (CD0), проводили в термостатованих кварцевих кюветах с довжиною оптичного путі 1, 2 та 10 мм на спектрофотометрі Specord M 40 у видимій та УФ областях спектру.
Поглинання сумішей ліганд – ДНК при любій довжині хвилі згідно закону Ламберта –Бера можливо представити у наступному вигляді:
 , (1)
де Сi и εi – концентрація та значення молярного коефіцієнту екстинкції кожної частинки в дослідженій системі, а l – довжина оптичного шляху.
Описано розрахунковий метод, що дозволяє на базі даних спектрофотометричних вимірювань за допомогою нелінійного метода найменших квадратів отримувати значення параметрів комплексоутворення в системах поліелектроліт – ліганд.
У розділі 3 наведено результати комплексоутворення в системі актиноцинове похідне Act II – поліфосфат (ПФ).
Рис. 1. Спектри поглинання сумішей Act II – ПФ у видимій області при постійній концентрації ліганду CActII= 4,69×10-5 М та різних концентраціях поліфосфату при СNaCl=0,02 M (а); залежність поглинання суміші Act II – ПФ від концентрації поліфосфату (б).
З аналізу концентраційних залежностей спектрів поглинання сумішей Act II – ПФ, зроблено висновок, що в системі присутні декілька по-різному поглинаючих типів комплексів. Розрахунок рівноважного складу сумішей при заданих загальних концентраціях поліфосфату (СР0) і ліганду Act ІІ (СD0), а також концентраціях іонів натрію (СNa0), що додаються в систему, проводили по рівняннях (2.1)-(2.5) (програма оптимізації DALSPH). Рівняння (2.1)-(2.3) описують конкурентне зв'язування двох лігандів з матрицею ПФ із відповідними константами зв'язування К1 і К2 у припущенні, що один з лігандів це іон Νа+, а другий - Act ІІ. Величина місця зв'язування іонів Νа+ - n1=1, а величина місця зв'язування Act ІІ - n2, де n - число фосфатів, що зайняті зв'язаними лігандами на матриці ПФ. Рівняння (2.2) - (2.3) тотожні рівнянню МакГі і фон Хіппела для кооперативного зв'язування ліганду, а ω - фактор кооперативності, що характеризує утворення агрегатів на тих же місцях зв'язування. Рівняння (2.4) і (2.5) відбивають закон збереження загальних концентрацій іонів Na+ і лігандів.
 (2.1)
     (2.2)
 (2.3)
 (2.4)
 (2.5)
У рівняннях (2.1)-(2.5): R1 і R2- долі зв'язаних іонів Na+ і Act ІІ, які дорівнюють частці від ділення відповідних рівноважних концентрацій на СP0; m1 і m2 - концентрації вільних іонів Na+ і мономера ліганду; КD - константа дімеризації Act ІІ. Величина γ характеризує імовірність розташування лігандів Act ІІ на сусідніх місцях зв'язування.
Розраховані по рівняннях (2.1)-(2.5) параметри зв’язування в системі Act ΙΙ - ПФ надано в таблиці 1. Видно, що термодинамічні параметри зв'язування Act ΙΙ із ПФ змінюються в залежності від P/D. Про це свідчать різні величини констант і місць зв'язування. З ростом P/D значення n і К збільшуються, що ми пов'язуємо з "розгортанням" ліганду щодо осі поліфосфату при утворенні комплексів по типу мономерного зв'язування.
Таблиця 1.
Параметри зв’язування лігандів Act ΙΙ з ПФ у трьох різних областях P/D, що були вичислені по моделі кооперативного зв’язування за допомогою програми оптимізації DALSPH.
Таким чином, спектрофотометричні дослідження комплексоутворення актиноцинового похідного Act ІІ з ПФ показали, що в процесі зовнішнього зв'язування цього ліганду на поліфосфаті з ростом P/D змінюються величини місць зв'язування і молярних коефіцієнтів екстинкції комплексів, що утворяться.
У четвертому розділі надано результати дослідження взаємодії актиноцинового похідного Act ΙΙ з двоспіральними молекулами ДНК.
Отримано концентраційні залежності спектрів поглинання сумішей Act ІІ - ДНК для зразків ДНК різного АТ-, ГЦ-складу в розчинах з різними іонними силами (рис.2).
Рис.2. Спектри поглинання сумішей Act ΙΙ - ДНК в залежності від концентрації ДНК в розчині 2×10-2M NaCl у видимій області спектру при постійній концентрації ліганда: Act II – ДНКM. lys., СD=4,13×10-5 M (а); Act ΙΙ - ДНКthym, СD=4,40×10-5 M (б), Act II – ДНКCl. perf. , СD=3,35×10-5 M (в).
При аналізі процесів комплексоутворення в системі ліганд - ДНК і розрахунку параметрів зв'язування була використана програма оптимізації DALSMOD. У цій програмі для розрахунку рівноважного складу кожної суміші при заданих загальних концентраціях іонів Nа+ (CNa0), ліганду (CD0), фосфатів ДНК (Cp0) і пар основ (CN0) використовувалось шість рівнянь (3.1)-(3.6) із шістьма невідомими: m1, R1, m2, R2, γ, R3.
 (3.1)
     (3.2)
 (3.3)
 (3.4)
 (3.5)
 (3.6)
У рівняннях (3.1)-(3.6): К1- константа зв'язування іонів Nа+ з фосфатами ДНК на місці зв'язування n1 = 1; К2 - константа мономерно зв'язаного ліганду (комплекс 1) на місці зв'язування n2; ω- фактор кооперативності, що характеризує утворення агрегатів на тих же місцях зв'язування; К3 - константа зв'язування ліганду на місці зв'язування n3 (комплекс 2); R1 і R2- долі зв'язаних іонів Na+ і комплексу 1, що дорівнюють частці від ділення відповідних рівноважних концентрацій на Cp0; R3- доля комплексу 2, що дорівнює частці від ділення відповідної рівноважної концентрації на CN0; m1 та m2 - концентрації вільних іонів Nа+ і мономера ліганду; КD - константа дімеризації ліганду. Величина γ характеризує імовірність розташування лігандів на сусідніх місцях зв'язування і задається рівнянням (3.2)
З використанням різних моделей зв'язування (модель І та модель ІІ) були розраховані спектральні і термодинамічні параметри зв'язування Act ІІ з ДНК при різних іонних силах. модель І описує кооперативне зв’язування лігандів з ДНК (рівняння (3.1)-(3.3),3.5,3.6). модель ІІ враховує утворення комплексів на різних місцях зв’язування (рівняння (3.1)-(3.6)). Обрано оптимальну модель зв'язування, по якій Act ІІ утворює на всіх розглянутих матрицях ДНК, як у розчинах з низькими, так з високими іонними силами, три типи комплексів: агрегати, мономерно зв'язаний зовнішній тип комплексу та інтеркаляція (модель ІІ).
Порівняння зв'язування ліганду Act ІІ з АТ- та ГЦ- збагаченими зразками ДНК дозволили визначити, що як і для актиноміцину D, інтеркаляція Act ІІ відбувається переважно між двома поруч розташованими ГЦ - парами з константою зв'язування ((6±2)×105 М-1) (таблиця 2). Величини місць зв'язування для комплексів по зовнішньому типу (n2) в сумішах Act ІІ з ДНК різного АТ-, ГЦ - складу практично однакові та дорівнюють n2=3, а величини констант зв'язування комплексів відрізняються для кожного з розглянутих зразків ДНК.
| 
