|
Українська Академія Аграрних Наук
Державний Нікітський ботанічний сад
УДК 582. 594. 2: 581. 143. 6
Попкова Лариса Леонідівна
Рідкісні види орхідних флори Криму,
їх мікророзмноження та підтримання біологічної різноманітності
03. 00. 05 - ботаніка
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Ялта - 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі біотехнології Державного Нікітського ботанічного саду.
Науковий керівник: доктор біологічних наук,
Митрофанова Ольга Володимирівна
Державний Нікітський
ботанічний сад УААН,
завідувач відділу;
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Бугара Олександр Михайлович,
Iнститут ефірно-олійних та
лікарських рослин УААН,
завідувач лабораторією;
кандидат біологічних наук
Теплицька Людмила Михайлівна,
Сімферопольський державний
університет, доцент
Провідна установа: Київський Національний університет ім.Тараса Шевченка
Захист дисертації відбудеться “ 7" травня 1999 ð.
о 10-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369. 01. при
Державному Нікітському ботанічному саді за адресою:
334267, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад
З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Державного Нікітського ботанічного саду за адресою: 334267, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад.
Автореферат розісланий “18“ березня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук С. Ю. Садогурський
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Серед представників родини Орхідних (Orchidaceae Juss) природної флори Криму, всі 47 видів, являючись рідкісними та зникаючими рослинами, занесені до Червоної книги України. Багато з них високодекоративні, що дає перспективу їхнього використання у зеленому будівництві та квітникарстві, а також мають лікарські властивості і застосовуються в офіційній та нетрадиційній медицині. Деякі орхідні є унікальними об'єктами вивчення їх як ендемічних та вузькоареальних видів, наприклад Ophrys taurica (Agg.) Nevski, Cоmperia comperana (Stev.) Aschers. et Graebn., Himantoglossum caprinum (Bieb.) C. Koch, особливо у зв'язку з різким скороченням чисельності під впливом антропогенних факторів. Слід відзначити, що 27 видів орхідних, віднесених до I та II категорій рідкості (Червона книга України), у Криму дуже малочисельні, а на три вище згаданих види поширюється дія Додатку II Конвенції про міжнародну торгівлю видами дикої фауни і флори, що знаходяться під загрозою зникнення (Голубев, 1996; Собко, 1989). Оскільки, природне відтворення (від проростання насіння до генеративного віку) триває 8-12 років, і вскладнене тісною залежністю діючих у біоценозах спеціфічних запилювачів та мікоризних грибів, збереження і відновлення популяцій рідкісних видів орхідних у природі можливо із застосуванням способів прискореного розмноження.
Метод клонального мікророзмноження орхідей з'явився в практиці квітникарства завдяки працям Pіхтера (Richter, 1969) та Мореля (Morel, 1974). До цього часу детально спосіб розроблений лише для 30 видів промислових декоративних тропічних видів орхідей, представників родів Cymbidium Sw., Dendrobium Sw., Phalaenopsis Bl., Cattleya Ldl., Vanda Jones (Arditti, 1976; Fast, 1982; Черевченко, Кушнир, 1986; Митрофанова та ін., 1992). Застосування цього способу до орхідних помірної зони майже не розроблено, що зумовлено особливостями репродуктивної біології та сезонним розвитком цієї групи орхідей. Тому дуже актуальним здається підбір способів прискореного мікророзмноження рідкісних дикоростучих орхідних з використанням вегетативних і генеративних органів в умовах in vitro. Головним при виборі вихідного матеріалу є не пошкодження, а цілковите збереження популяцій в природних місцях зростання. Наступна пересадка ювенільних особин в сприятливі природні умови для відновлення чисельності популяцій цих видів може стати, поряд з традиційними засобами охорони, важливим елементом практичного збереження біологічної різноманітності рідкісних орхідних Криму.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувались в зв'язку з тематичним планом Державного Нікітського ботанічного саду за проблемами 01.02. “Провести оцінку стану рідіксних видів, що охороняються, на території південнобережних районов Криму” і 01.03.”Провести популяційно-кількісний облік рідіксних, зникаючих і ендемічних видів Гірського Криму” та планом аспірантської підготовки.
Мета і задачі досліджень. Метою даної роботи є вивчення біологічних особливостей дикоростучих орхідних та їх мікророзмноження для збереження рідкісних видів з наступним відтворенням чисельності популяцій в природних умовах. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання.
1. Вивчити особливості біології рідкісних видів орхідних Криму в природі, які потребують першочергового збереження.
2. Провести порівняльне вивчення морфогенетичних потенцій різноманітних органів та тканин орхідних в умовах in vitro.
3. Встановити оптимальні первинні експланти для мікророзмноження орхідних в залежності від таксономічного статусу, вікового та фізіологічного стану рослини.
4. Вивчити вплив трофічних, гормональних та фізичних факторів на морфогенез (оптимізувати склад живильних середовищ, а також визначити умови вирощування на різних етапах розвитку протокорму, проростка та ювенільної рослини).
5. Розробити спосіб мікророзмноження дикоростучих видів орхідних.
Наукова новизна. Проведене порівняльне вивчення особливостей біології бульбоносних (Ophrys taurica, O. oestrifera, Platanthera chlorantha) та кореневищних (Goodyera repens) видів орхідних у природі та в умовах in vitro. Показано, що ритми розвитку, які характерні для малого життєвого циклу орхідних, зберігаються при культивуванні in vitro, а в межах великого життєвого циклу відбувається скорочення ранніх фаз онтогенезу. Вперше вивчені морфогенетичні потенції видів орхідних Крыму Comperia comperana, Himantoglossum caprinum, Ophrys taurica, що мають статус I категорії рідкості. Встановлено, що життєздатність експлантів з вегетативних органів орхідних корелює з кількістю та відносною активністю ізоформ пероксидази, що зумовлює загальну стійкість рослин до несприятливих факторів зовнішнього середовища. Визначені оптимальні первинні експланти для розмноження in vitro (насіння із нерозкритих коробочок). У видів, які володіють глибоким спокоїм насіння встановлена залежність проростання насіння від стадії їхнього визрівання. Підібрані склади живильних середовищ для розвитку протокормів та проростків. Визначений термін для адаптації рослин.
Практичне значення роботи. Розроблений спосіб мікророзмноження в умовах in vitro дикоростучих орхідных Криму, застосування якого дозволяє скоротити тривалість розвитку стадії протокормів до 8-12 місяців і стадії ювенільної рослини до 10-12 місяців у порівнянні з 2-4 роками їх розвитку в природі. При цьому прискорюється процес розмноження орхідних завдяки скороченню ранніх фаз онтогенезу в 2,5-3 рази для бульбоносних та в 3-5 разів для кореневищних видів. Даний спосіб може застосовуватися для отримання сіянців та рослин-регенерантів з метою введення їх в культуру, підтримання біологічної різноманітності і репатріації в природні місця зростання.
Особистий внесок здобувача полягає в самостійному зборі матеріалу, проведенню експериментів та обробці отриманих даних, підготовки наукових статей, оформленні дисертаційної роботи. Спільно з науковим керівником здійснено вибір об'єктів досліджень, застосування методик та розробка структури роботи.
Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідалися на міжнародних конференціях: молодих вчених “Проблеми дендрології, квітникарства і плодівництва” (Ялта, 1995; 1996; 1997; 1998); “Шляхи вирішення проблем і перспективи розвитку біотехнології в декоративному садівництві та плодівництві” (Ялта, 1997); “Охорона та культивування орхідей” (Краснодар, 1998), а токож на засіданнях відділу біотехнологіі та вченої ради ДНБС (1995-1998 рр.)
Публікації. По темі дисертації опубліковано 10 робіт, з них чотири - в збірниках наукових праць і шість - в матеріалах конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, 6 розділів, висновків та переліку літератури, що містить 159 джерел, в тому числі 98 на іноземних мовах. Робота викладена на 132 сторінках машинописного тексту і містить 20 рисунків, 17 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Проведений аналіз опублікованих даних по біології та екології орхідних, а також по розмноженню в умовах in vitro тропічних та деяких наземних видів орхідних помірних зон.
Об'екти та методи дослідження. Об'єктами вивчення для розробки способів мікророзмноження дикоростучих орхідних в умовах in vitro являлись рослини з природних фітоценозів: види середземноморської групи ареалів - Cоmperia comperana (Stev.) Aschers. et Graebn., Himantoglossum caprinum (Bieb.) C. Koch, Ophrys taurica (Agg.) Nevski, O. oestrifera Bieb., що відносяться до життєвої форми вегетативного однолітника із сферичними стеблекореневими тубероїдами та осіннім початком вегетації; європейсько-середземноморський неморальний вид Platanthera chlorantha (Cust.) Reichenb. з веретеновидними стеблекореневими тубероїдами і весняним початком вегетації, а також голарктичний літньо-зимовозелений вид Goodyera repens (L.) R. Br. довгокореневищної життєвої форми з поліциклічними пагонами (Голубев, 1996; Татаренко, 1996). Окрім цього в експериментах були використані Anacamptis pyramidalis (L.) Rich., O. mascula (L.) L., Orchis pallens L., O. purpurea Huds., Dactylorhiza romana (Seb. et Mauri) Soo.
Экспедиційними дослідженнями (1994-1997 рр.) були охоплені центральний район головної гірської гряди (г. Чатирдаг, Перевальницьке лісництво) та західний район Південного берега Криму (мис Сарич, мис Мартьян). Фенологічні спостереження за рослинами, облік вікової структури популяцій та геоботанічні описи місць зростання орхідних проводилися згідно з “Методичними вказівками...” (Голубев, 1978; Голубев, Корженевский, 1985).
З метою визначення морфогенетичних потенцій природного рослинного матеріалу в умовах in vitro, були використані всі основні органи орхідей, за винятком молодих бульб з бруньками відновлення. Основною умовою вибору первинного експланту є не пошкодження, а цілковите збереження рослин в природних ценопопуляціях.
При проведенні лабораторних досліджень в роботі дотримувались як загальновідомих в біотехнології способів (Бутенко, 1964; Черевченко, Кушнир, 1986) так і способів, розроблених у відділі біотехнології Нікітського ботанічного саду УААН (Митрофанова, 1997).
В експериментах по вивченню морфогенетичних потенцій орхідних первинні експланти з вегетативних та генеративних органів поміщувались на живильні середовища: Knudson C (1922), Burgeff (1932), Prasad-Mitra (1975), MS - Murashige, Skoog (1962), 1/2 MS, а також MS і 1/2 MS з 2,4-Д від 0,45 до 4,52 мкМ; Gamborg (1968), Nitsch (1969), Bourgin-Nitsch (1967).
Посуд з експлантами знаходився в культуральній кімнаті, де підтримувалась постійна температура в межах 20-250С, 16-годинний фотоперіод з освітленістю 1 - 2,5 клк і 70%-ва відносна вологість повітря. В залежності від поставленого завдання культивування експлантів проводилося також в термостаті при температурі 270С при відсутності освітлення.
З метою вивчення впливу температурного режиму на проростання насіння орхідних, пробірки з насінням поміщували в нижню камеру холодильника з температурою 40С на 6-8 тижнів. Температура культивування насіння в контролі, а в подальшому протокормів та проростків, складала 20-250С.
Для вивчення впливу умов освітлення на розвиток протокормів і проростків, пробірки або колби витримували в темряві (термостаті) 4-8 тижнів, на слабоосвітлених стилажах (0,5-1,0 клк) та стилажах з освітленістю 1,5-3,0 клк.
Субкультивування протокормів та проростків здійснювали один раз в 10-30 днів в період інтенсивного росту, і один раз в 30-50 днів в період, коли морфогенетичні процеси уповільнювалися. При тривалому культивуванні насіння в спеціальних експериментах, пасажи на свіжеприготовлені живильні середовища здійснювали один раз в 8-15 місяців.
З метою оптимізації різогенезу проводили дослід з використанням різноманітних концентрацій і співвідношень ауксинів (НОК, IМК, IОК, 2,4-Д) в живильних середовищах. Рослини висаджували на адаптацію в контейнери з сумішшю різноманітного складу: торф, перліт, мох (суха суміш лісових видів Hypnum cupressiforme, Dicranum scoparium) в співвідношеннях - 2:1:1, 2:1:2, 2:2:1, або земельну суміш з мохом з природних місць зростання. Рослини поміщували на СПВР (стилаж прискореного вирощування рослин) при температурі 220С, освітленісті 2-3 клк з 16-годинним фотоперіодом.
Изоферментні спектри пероксидази вивчали з бензидином та галовою кислотою як субстратів методом диск-електрофорезу за прописом фірми "Ренал і Маурер" в 7% ПААГ. Пероксидазу екстрагували з рослинного матеріалу при охолодженні до 00 С тріс-гліциновим буфером з захисними додатками по Сафонову (1969). Відносну активність кожної фракції пероксидази визначали по Лиу (Liu, 1973) в модифікації Грушина, Івакіна (1985).
Кожний експеримент був поставлений тричі в п'ятикратній повторністі. Спостереження за зміною стану експлантів і рослин проводилися через 5, 10, 20, 40 та 60 діб. Всі отримані цифрові експериментальні дані статистично оброблялися з допомогою пакету прикладних програм Excel для Windows 95.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Біологічні особливості і вікова структура ценопопуляцій рідкісних видів орхідних Криму
В ході досліджень були встановлені особливості вегетації, вікового складу популяцій та плодоутворення рідкісних орхідних, які потребують першечергового збереження.
Himantoglossum caprinum - вид з дуже раннім початком вегетації. Після дисемінації в кінці серпня, практично без періоду спокою молодої бульби, починається відростання корінців. Прикоренева розетка листків формується в вересні-жовтні у генеративних (g) та вегетативних (vm) особин. Надземна вегетація іматурних (im) і ювенільних (j) рослин починається на 1-1,5 місяці пізніше. Веснянє відростання відбувається в квітні, коли здійснюється розвиток ювенільних особин першого року наземного життя. Також в цей період відбувається відмірання перезимувавших листків у генеративних, вегетативних та іматурних рослин. Цвітіння відмічається з 2-3 декади червня, в роки з ранньою та теплою весною - з першої декади червня, і триває по 1-2 декади липня. Плодоношення та дисемінація зафіксовані з 3 декади липня по 1-2 декади серпня. Плодоутворення не перевищує 10-18% (іноді 5-9%), ювенільні особини появляються поблизу генеративних тільки в місцях зростання, де є вільна від трав'яного покриву земля і достатнє зволоження.
Comperia comperana, Ophrys taurica, O.oestrifera характеризуються визначеним періодом спокою влітку протягом 2,5-3 місяців на стадії молодої бульби. Відростання корінців починається в середині вересня, розетка листків утворюється в жовтні, що є ознакою типового середземноморського сезонного ритму розвитку. Рослини цвітуть з останньої декади квітня по 1-2 декади травня. У O. taurica початок вегетації і цвітіння спостерігається на 7-10 днів раніше. Плодоношення та дисемінація видзначаються у 1-2 декади червня. Плодоутворення становить 5-8% (іноді 1-3%) і дуже залежить від погодних умов.
Ценопопуляції всіх видів, що досліджувалися в природних місцях зростання, відносяться до типу нормальних неповночленних, завдяки не чітко визначених протокормів та сенільних рослин (табл. 1). Вони мають правосторонній характер з домінуванням вегететивних та генеративних особин, співвідношення яких може коливатися в залежності від екологічних умов в період закладення генеративної сфери.
Таблиця 1 - Вікова структура ценопопуляцій рідкісних орхідних в різних умовах місцезростання
Незважаючи на велику потенційну плодопродуктивність, відтворення орхідних обмежується вже на першому етапі розвитку від початку запилення як недостатністю запилення, пошкодженням фітофагами і мишовидними гризунами, так і масовим пошкодженням генеративних пагонів рослин в місцях з посиленим антропогенним навантаженням.
Асимбіотичне розмноження насінневим способом деяких орхідних Криму
Отримання асептичної культури органів та тканин орхідних. Важливою задачою на початковому етапі вивчення морфогенетичних потенцій in vitro є отримання асептичної культури органів та тканин орхідей, відібраних з природних умов. Оскільки поверхневе забруднення сапрофітними бактеріями і спорами грибів підземних органів істотно відрізняється від надземних, зниження забруднення до 5% було досягнуте лише при східчастій стерилізації 70%-вим етанолом (1 хвил), 1%-вим Тhymerosal (5-7 хвил) і 0,8%-вим AgNO3 (6-8 хвил) з трьох-чотирьох разовим промиванням в стерильній дистильованій воді після кожного реагенту. В деяких випадках (бутони та квітки) достатньо було застосування одного 70%-вого етанолу (до 1 хвил), або короткочасного занурення (по 30 с) в 70%-вий етанол, а після цього в 0,8%-вий AgNO3, що захищало дані органи від загибелі в процесі стерилізації.
Вивчення життєздатності первинних експлантів з нативних органів різноманітних видів орхідних. Виявлена чітка залежність між числом ізоферментів (ІФ) та відносною активністю пероксидази у орхідних in situ та життєздатністю експлантів з вегетативних органів (листків і коренів) в умовах in vitro. Так, максимум відносної активності і найбільше число ІФ пероксидази з бензидином у Ophrys taurica, O. oestrifera, Himantoglossum caprinum, Anacamptis pyramidalis виявлене на початку осінньої вегетації. В ці періоди экспланти з молодих листків та коренів досить довго (до 1-3 місяців) зберігалися на живильних середовищах без зовнішніх ознак некрозу. При вивченні ізоферментного спектру (ІФС) пероксидази з галовою кислотою як природного субстрату, в листках двох видів роду Ophrys L. відмічена наявність видоспецифічної фракції у Ophrys oestrifera, на відміну від стабільного ІФС O. taurica. З бензидином такої залежності не вдалося виявити. Ці дані можна використати як хемосистематичні критерії для визначення ще неквітучих особин близькоспоріднених видів, що морфологічно важко відрізнити.
Ophrys taurica Ophrys oestrifera
Умовна активність: > > > >
Рис.1. Ізоферментний спектр та відносна активність (%) пероксидази в листках видів роду Ophrys L. А - с галовою кислотою, Б - с бензидином
Залежність проростання насіння орхідних від стадії їхньої стиглості. Виявлені оптимальні терміни посіву насіння для кожного виду орхідних в залежності від терміну їхнього визрівання (кількості діб з моменту запилення): 40-45 діб для Anacamptis pyramidalis та Platanthera chlorantha, 45-50 діб - для видів родів Ophrys, Comperia, 50-55 діб для Himantoglossum caprinum і 30 діб - для Goodyera repеns. Для останнього виду із-за відсутності глибокого спокою у насіння, термін посіву не грає такої істотної ролі. Полегшувальною стерилізацію обставиною було те, що насіння знаходилось в нерозкритих коробочках, а також досить легко відділялося від плацент. Схожість насіння в умовах in vitro складала 50-75% (в природі 5%), що в подальшому дозволяло отримати необхідну кількість протокормів та проростків орхідних для наступних експериментів.
Вивчення впливу біотичних та абіотичних факторів середовища на проростання насіння і на різні етапи морфогенезу орхідних in vitro. З метою підбору оптимального живильного середовища, нами здійснене випробування трьох складів середовищ для вирощування тканин та органів, які рекомендуються для культивування деяких видів орхідних в промисловому квітникарстві: Knudson C (1922), Burgeff (1932), Prasad, Mitra (1975). В наших дослідах модифікацію середовища Knudson C проводили введенням природного адаптогену 0,05-0,2% гумату калія, а також доданням 2,32 мкМ кінетина та 2,85 мкМ ІОК. Найкращим було живильне середовище Knudson C, доповнене 0,1%-вим гуматом калію. Відзначали також проростання насіння та утворення протокормів на середовищі Knudson C без гумату калію (контроль). Однак, в першому випадку кількість проросшого насіння та сформованих протокормів досягала 50-75%, в той час як в контролі вона не перевищувала 10-15%. Винятком був вид Goodyera repеns, для якого було характерне масове проростання і утворення протокормів навіть на модифікованих середовищах MS, неспецифічних для культивування орхідей.
Для всіх видів встановлена залежність розвитку протокормів та проростків від освітленості, особливо в період позеленіння листочків, скручених в трубку. Найбільш відчутними до інтенсивності освітлення виявилися протокорми та проростки Goodyera repens. Для їхнього нормального розвитку необхідна освітленість 2-3 клк (табл. 2).
Таблиця 2 - Вплив інтенсивності освітлення на розвиток протокормів та
проростків
Протокорми Ophrys oestrifera також краще розвивалися на сильно освітлених стилажах, в той час як у Platanthera chlorantha розвиток протокормів відбувався найбільш інтенсивно при освітленості 0,5-2,0 клк. Напевно, це пов'язано з біологічними особливостями даних видів: O. oestrifera - геліофіт, зростаючий на світлих схилах та відкритих місцях; G. repens також є світлолюбивим видом, в той час як P. сhloranthа - тіневитривала лісова рослина.
Період активного росту проростків в умовах in vitro супроводжувався виділенням в живильне середовище значної кількості фенольних сполук, які уповільнювали зростання проростків. Причому, їх виділення відмічалося лише у видів, схильних до утворення фенолів і при культивуванні эксплантів дорослих нативних рослин. Це види, зростаючі на відкритих просторах - на узліссі та світлих схилах, такі як Ophrys oestrifera, Anacamptis pyramidalis, Himantoglossum caprinum. Певно, таку здатність ці види орхідних утворили в ході еволюційних пристосувань та алелопатичних взаємодій рослин в фітоценозі.
Склад живильного середовища, що застосовується для регенерації рослин Cymbidium Sw. у відділі біотехнології Нікітського ботанічного саду, був модифікований для видів, що інтенсивно виділяють в живильне середовище феноли. При цьому застосовували підвищені концентрації гліцину (50,6-63,2 мкМ) як при культивуванні проростків, так і органів природних рослин. Найкраще коренеутворення відзначене при використанні ІМК і НОК в концентрації 2,46 мкМ та 2,69 мкМ відповідно (табл 3).
Таблиця 3 - Вплив ауксинів на різогенез
Умови тривалого збереження насіння в культурі in vitro. В ході експериментів по пророщуванню насіння рідкісних видів орхідних нами виявлені умови тривалого збереження насіння, здатного до проростання протягом трьох років з моменту посіву. При цьому насіння, що знаходилося на живильному середовищі in vitro понад два роки, прорастає в ті ж періоди, що й висіяне в поточному сезоні, відповідно початку вегетації рослин в природі. Простота способу - підтримання вологості всередині культурального посуду, низька інтенсивність освітлення (1-1,5 клк) і тривале знаходження насіння на живильному середовищі (субкультивування один раз в 8-15 місяців) - роблять даний спосіб не лише зручним, але й економічним. Це дає можливість збереження орхідних в умовах in vitro і відкриває перспективи відтворення генофонду рідкісних видів.
Порівняльне вивчення морфогенезу видів орхідних з різноманітними типами життєвих форм, ареалів та сроків вегетації. Вивчення морфогенезу в умовах in vitro бульбоносних та кореневищных орхідних виявило характерні особливості ранніх етапів розвитку. Так, самий нетривалий період стадії протокорму був у Goodyera repens, а при наявності достатнього освітлення у неї формувалися зелені проростки. В подальшому відбувалося лише наростання метамерів повзучого пагона, а на нижніх метамерах спостерігався розвиток листків та коренів. Для Platanthera chlorantha стадія протокормів, які мають спочатку витягнуту, а потім зігнуту форму, тривала досить довго (3-5 місяців). При цьому проростки формувалися в період, що співпадав з початком весняної вегетації рослин в природі. В ході досліджень була простежена чітка залежність між сезонним розвитком in situ та in vitro. Більш детально цю залежність розглянемо на прикладі Ophrys oestrifera.
Морфогенез в культурі in vitro Ophrys oestrifera. В наших дослідах насіння даного виду поодиноко починало проростати через 6 тижнів після посіву на живильне середовище. Масове проростання насіння відзначене через 9-12 тижнів після посіву, що відповідало початку вегетації рослин в природі - відростанню прикореневої розетки листків (рис. 2). Через 1,5-2 місяця після перенесення на свіжоприготовлене середовище, спостерігалася швидка диференцировка стеблевої частини. В такому стані протокорми, майже без змін, знаходились з листопада по лютий, незначно збільшуючись до 4,0-4,5 мм в діаметрі. Це відповідало фазі зимового спокою рослин в природі - зимуючої розеткі листків (рис. 2).
Активне збільшення діаметру мікробульби та скручених в трубку листочків, що набувають зеленого забарвлення, починається з лютого. До середини березня у багатьох проростків відзначалося розгортання першого зеленого листочка з добре помітною центральною жилкою. Ця фаза відповідала весняній вегетації в природі, коли апікальна стеблева меристема перебудовується на розвиток генеративної сфери з утворенням квітконоса.
Найбільш інтенсивний розвиток проростків: розгортання 2-3-х листочків 8-13 мм довжиною, збільшення діаметру мікробульби до 6-9 мм, утворення додаткових зон зростання і відростання 1-2-х корінців до 5-8 мм довжиною, відзначалося в другу і третю декади квітня, і першу-другу декади травня. Даний період розвитку в умовах in vitro співпадає з активною вегетацією, цвітінням і початком плодоношення рослин O. oesrtifera у природі (рис. 2).
В умовах in vitro
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
__________________________________________________________________________
VII VIII IX X XI XII I II III IV V VI
місяць
В умовах in situ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
__________________________________________________________________________
VII VIII IX X XI XII I II III IV V VI
місяць
Рис. 2. Розвиток O. oestrifera в умовах in vitro та in situ (малий життєвий цикл).
В умовах in vitro: 1 - посів насіння (період фізіологічного спокою); 2 - поодиноке проростання; 3 - масове проростання і формування протокормів; 4 - збільшення розмірів протокормів; 5 - диференцировка стеблевої частини; 6 - формування листків; 7 - розгортання листків; 8 - коренеутворення; 9 - формування мікророзетки та корінців; 10 - уповільнення процесів росту (літній спокій). В умовах in situ: 1 - період спокою; 2 - відростання молодих корінців; 3 - початок відростання листків на поверхні грунту; 4 - формування прикореневої розетки листків; 5 - зимуюча розетка листків; 6 - розвиток і формування квітконоса; 7 - цвітіння; 8 - початок плодоношення та закінчення вегетації; 9 - дисемінація та відмирання всіх надземних частин; 10 - період спокою молодої сформованої бульби.
З початком фази закінчення вегетації та періоду спокою влітку, що характерно для середземноморських видів, морфогенетичні процеси в культурі in vitro уповільнювалися. В першій декаді жовтня, з початком вегетації рослин в природі (відростанням прикореневої розетки листків) у проростків в умовах in vitro активно розвивалися нові листочки, з'являлися нові корінці і рослини починали наступний етап розвитку.
Таким чином, сезонний ритм, характерний для малого життєвого циклу роду Ophrys (від бульби до бульби), зберігався при культивуванні in vitro. В межах великого життєвого циклу (від насіння до насіння) розвиток протокорму та проростку в умовах in vitro минав за 6-8 місяців в порівнянні з двома-трьома роками в природі. До другого року розвитку з моменту посіву проростки вступали в стадію, відповідну 4-5-річній молодій ювенільній рослині в природі.
Мікророзмноження in vitro ювенiльних рослин та адаптація in vivo дикоростучих орхідних
Вивчення морфогенетичних потенцій ювенільного матеріалу, отриманого in vitro, показало значиму роль життєвої форми (генотипу) в розмноженні. Особливо пластичним виявився вид Goodyera repеns з кореневищною життєвою формою, здатний до адвентивного пагоноутворюння при розділенні повзучого пагону на живильному середовищі ОII c 2,69 мкМ НOK. В природі цей вид також може вегетативно розмножуватися розділенням кореневища. Регенераційна здатність при розділенні протокормів орхідних з життєвою формою вегетативного однорічника з сферичними або веретеновидними стеблекореневими тубероїдами виявилася дуже низькою, що не суперечить особливостям їхньої біології в природі.
Терміни адаптації рослин до умов in vivo були пристосовані до їх сезонних ритмів розвитку. Для Ophrys oestrifera була найкращою осіння адаптація, для Platanthera chlorantha - весняна, для літньо-зимовозеленої орхідеї Goodyera repеns таких властивостей не виявлено. Кращими субстратами є суміш торф:перліт:мох (2:1:2), що наближається за складом до природних, та природний грунт з мохом з місць зростання, попередньо простерилізований. Рослини спочатку вирощувалися на СПВР, а через 3-6 місяців пересаджувалися в теплицю.
Таким чином, морфогенетичний потенціал органів та тканин дикоростучих орхідей реалізувався через утворення проростків і рослин з насіння при асимбіотичному розмноженні in vitro з наступним культивуванням частин стерильных проростків для мікророзмноження. На першому етапі пророщування насіння та формування протокормів відбувається за 2-3 місяця, у порівнянні з 6-9 місяцями в природі, коли після дисемінації насіння орхідних починає проростати навесні наступного року. В межах великого життєвого циклу у видів, які досліджувалися, відмічено скорочення ранніх етапів онтогенезу в 2,5-3 рази для бульбоносних і в 3-5 разів для кореневищних видів, у порівнянні з їхнім природним розвитком.
Проблеми та перспективи охорони рідкісних орхідних Криму
В теперішній час існуючі природоохоронні засоби не можуть повністю забезпечити збереження орхідних в Криму. У зв'язку з цим вважаємо необхідним внести свої пропозиції щодо охорони фітогенофонду орхідних Криму.
Необхідно подальше всебічне вивчення рідкісних видів орхідних, зокрема, вузькоареальних: Comperia comperana, зростаючої тільки в Криму; Himantoglossum caprinum, відміченому також на Кавказі; Ophrys taurica, що є ендемічним видом. Необхідно встановити регулярний контроль за станом їх популяцій, а також розглянути питання оптимізації охоронного режиму в місцях зростання з інтенсивним антропогенним навантаженням.
Так, пропонуємо створення локальних охоронних територій в “Орлиному міжгір'ї” біля села Перевальне де зустрічається Himantoglossum caprinum, та на мису Сарич (Південний берег Криму) з найбільшим місцезростанням Comperia comperana. Ендемік Криму Ophrys taurica також підлягає цілковитій охороні і для цього рекомендується створення ботанічних заказників в урочищі Бакла та інших найбільш репрезентованих районах.
Вважаєм цілеспрямованим утворення в ДНБС генетичного банку орхідних, шляхом введення в культуру та створення регіональної ботанічної колекції. Репатріація видів ще не вивчена на даний момент, і це питання планується вирішити головним чином за рахунок рослин, розмножених в культурі. Рослини будуть переноситися в природні фітоценози, для чого нами проводилося геоботанічне вивчення місць зростання орхідних.
Вперше пропонується створення насінневої колекції в умовах in vitro, зважаючи на виявлену можливість тривалого збереження насіння орхідних, здатних до проростання на живильних средовищах. Збережені та отримані в умовах культури види рослин родини Orchidaceae Juss будуть служити матеріалом для експериментального відтворення популяций та репатріації орхідних в їхні природні місця зростання.
| 
