|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ
На правах рукопису
СЕРЕБРЯНИК Олександр Ілліч
УДК 577.217.34
577.217.344
577.5.53
577.217.39
РИБОСОМНА АТРаза ВИЩИХ ЕУКАРІОТ
03.00.03 - молекулярна біологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 1998
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор,
академік НАН України
ЄЛЬСЬКА Ганна Валентинівна,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, зав.
відділом механізмів трансляції генетичної інформації
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук,
Козлов Едуард Андрійович
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,
провідний науковий співробітник відділу ензимології білкового синтезу
доктор біологічних наук, професор
Стародуб Микола Федорович
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, зав.
відділом біохімії сенсорних і регуляторних систем.
Провідна установа:
Київський університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії
Захист дисертації відбудеться 23 червня 1998 р. о 10-00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 252143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.
Автореферат розіслано 23 травня 1998 р.
Вчений секретар спеціалізованої Вченої Ради
кандидат біологічних наук Л.Л. Лукаш
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Відомо, що цикл елонгації поліпептидного ланцюгу на рибосомах в усіх живих організмах промотується двома білковими факторами. Проте виявилося, що різні види грибів містять ще один додатковий розчинний фактор EF-3(Skogerson, 1979), функціонування якого є також суттєвим для стадії елонгації. На відміну від двох попередніх факторів EF-3 має слабку АТРазну активність, яка на декілька порядків збільшується у присутності рибосом. Детальне вивчення участі EF-3 у біосинтезі білка надало підставу припустити, що він промотує перехід рибосоми з пост- у претранслокаційний стан (Nierhaus, 1993) та приймає участь у забезпеченні точності відбору аміноацил-тРНК на А-сайті рибосоми.
Проте апарат біосинтезу білка з інших еукаріотичних організмів функціонує у відсутності дріжджового EF-3 або його розчинного аналогу. Особливий інтерес у цьому плані становлять рибосоми з інших нижчих еукаріот, Tetrahymena pyriformis, які володіють міцно зв'язаною АТР/GТP-азною активністю, близькою за деякими параметрами до дріжджової EF-3 АТРази (Miyazaki, 1990).
Що стосується АТРазної активності рибосом вищих еукаріот, то в літературі з'явилися окремі вказівки на її можливу наявність, хоча до початку цієї роботи вони викликали великий сумнів і питання залишалося відкритим.
Мета роботи та задачі досліджень. Метою роботи є з'ясування питання, чи мають високо очищені рибосоми вищих еукаріот здатність гідролізувати АТР, та порівняння властивостей АТРази з дріжджовим EF-3 у разі її виявлення.
Для досягнення поставленої мети слід було вирішити такі питання:
- дослідити здатність високо очищених рибосом з ряду вищих еукаріот гідролізувати АТР;
- за наявності рибосомної АТРази вивчити її властивості, у тому числі субстратну специфічність, кінетичні параметри реакції гідролізу АТР, вплив на функціонування А-сайту рибосоми, чутливість до інгібіторів EF-3;
- визначити, чи здатні рибосоми вищих еукаріот стимулювати АТР/GТP-азну активність дріжджового EF-3.
Наукова новизна роботи. Вперше доказано, що високо очищені рибосоми вищих еукаріот містять міцно зв'язану АТРазу. Понад 50 % АТРазної активності зберігається у рибосомах навіть після відмивання 1,5 М LiCl, і тільки їх обробка 4 М LiCl, яка сполучена з втратою частини рибосомних білків, призводить до майже повного зникнення здатності рибосом гідролізувати АТР. Показано, що АТРазна активність рибосом не є наслідком їх забруднення факторами елонгації.
Вперше проведено порівняння рибосомної з дріжджовим EF-3 і виявлено ряд загальних властивостей, у тому числі широку субстратну специфічність та пригнічення специфічними інгібіторами.
Вивчено кінетичні параметри рибосомної АТРази печінки кроля, показано наявність двох активних центрів та виявлено стимулюючу дію аміноацил-тРНК на каталітичну активність одного з них.
Вперше отримано дані, що свідчать про участь рибосомної АТРази у контролі над функціонуванням А-сайта рибосоми, де відбувається відбір кодон-специфічних тРНК. Встановлено, що рибосоми вищих еукаріот, маючи власну АТРазну активність, зберегли у процесі еволюції підсилюючий елемент(и), необхідний для стимуляції EF-3.
Теоретичне значення роботи. Робота носить фундаментальний характер і її цінність полягає у новому зрозумінні детальних механізмів циклу елонгації поліпептидного ланцюгу на 80S рибосомі та виявленні нових можливих точок прикладання факторів, які регулюють біосинтез білку у вищих еукаріот.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках плану науково-дослідних робіт відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за грантом № 5.3/16 Державного фонду фундаментальних досліджень по темі "З'ясування ролі АТРазної активності рибосом у біосинтезі білка в еукаріот" та за грантом UBA 200 Міжнародного Соросівського фонду.
Особистий внесок здобувача. Роботу виконано під керівництвом д.б.н., академіка Г.В.Єльської у співробітництві з к.б.н. Г.В. Овчаренко та к.б.н. М.В. Родніною, з якими було опубліковано спільні роботи. Особистим внеском автора дисертації була участь у плануванні роботи, виконанні експериментів та обговоренні одержаних результатів. Експериментальні дані, наведені в дисертації, отримано за безпосередньої участі автора.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка включає опис матеріалів та методів дослідження, виклад результатів, їх обговорення, висновків та списку цитованої літератури, який включає 191 найменування. Роботу викладено на 107 сторінках, включаючи 17 рисунків та 2 таблиці.
Апробація роботи. Матеріали роботи доповідалися на міжнародній конференції "Conference on the translational apparatus" (Berlin, Germany, 1992).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 роботи у вітчизняних та закордонних журналах.
Матеріали та методи
Тріс, полі (U), NTP, GDP, ДТТ виробництва "Calbiochem", США. 2-меркаптоетанол, дeзоксіхолат натрію, MgCl2 - "Merk", акриламід, бісакриламід, TEMED, пуроміцин, кумасі синій R-250 - "Serva", ФРН. Сефадекси, сефарози - "Pharmacia", Швеція. Синтетичні носії: DEAE-, CM-ToyoPerl, - "Toyo-TCM", Японія. Гідроксіапатит - "Bio-Rad", США. Фільтри "Whatman", Великобританія, "Millipore", США, "Sartorius-GmbH", ФРН.
Основним об'єктом досліджень була печінка кроля.
Отримання рибосомних субчасток проводили з активних полісом за методом (Falvey, 1970) у модифікації (Потапов, 1986). Їх концентрацію визначали, припускаючи, що 1 од. А260/мл відповідає 28 пмоль/мл для 40S субчасток та 55 пмоль/мл для 60S субчасток. 80S рибосоми отримували реасоціацією 40S та 60S субчасток. "Run-off" рибосоми з кролячої та бичачої печінки, а також ретикулоцитів кроля, отримували з полісом ультрацентрифугуванням у присутності 10 мМ MgCL2М.
Препарат сумарних АРСаз (КФ 6.1.1) отримували відповідно (Von der Haar, 1974). Білкові фактори елонгації (EF-1H та EF-1a) отримували ступінчастим осадженням постполісомального супернатанту сульфатом амонію з послідуючою гель-фільтрацією та серією хроматографій на іонообмінниках та гідроксіапатиті. Отримання та очищення EF-3 з дріжджів проводили як описано в (Skogerson, 1979).
Сумарну тРНК отримували за методом фенольної екстракції з послідуючою хроматографією на DEAE-целюлозі,очищену тРНКPhe -хроматографією на BD-целюлозі. Для отримання [14С]Phe-тРНКPhe здійснювали препаративне аміноацилювання тРНКPhe з подальшою хроматографією на БД-целюлозі. Ступінь збагачення отриманих препаратів складала 1600 пмоль/од. А260. N-ацетил-[14C]Phe-тРНКPhe (AcPhe-тРНКPhe - аналог пептиділ-тРНК) отримували за методикою (Rappoport, 1974). Зв'язування Ac[14C]Phe-тРНКPhe з 80S рибосомами вимірювали за допомогою методу фільтрації через нітроцелюлозні мембрани. Заповнення Р-сайту контролювали за допомогою пуроміцинової реакції (Rodnina, 1989). Факторзалежне зв'язування тРНК з рибосомою проводили як описано в роботі (Rodnina, 1995).
Визначення ATP/GPTазної активності проводили за методом (Parmeggiani, 1981). Радіоактивність проб визначали у сцинтиляційному лічильнику.
Електрофорез білків проводили за (Laemmli, 1970) у присутності 0,1 % додецилсульфату натрію в 12,5% ПААГ.
Для описання нелінійних графіків (та ділянок графіків) у координатах Іді-Хофсті використовували емпіричний підхід Хілла (Курганов, 1978).
Графічний аналіз, інтерполяцію та розрахунок кінетичних параметрів проводили за допомогою статистичної програми "AsEasy" та спеціалізованого пакету програм аналізу біохімічних процесів "Enzefitter".
Результати
Здатність 80S рибосом вищих еукаріот гідролізувати АТР
Основним завданням цього розділу роботи було з'ясування питання, чи є у складі 80S рибосом вищих еукаріот можливий аналог фактору EF-3. Для цього було вивчено здатність 80S рибосом різного походження гідролізувати АТР та GTP (рис. 1).
Рис. 1. Кінетика гідролізу ATP/GTP "run-off" рибосомами вищих еукаріот: із печінки бика; із печінки щурів; із ретикулоцитів кроля.
Реакція протікає досить ефективно у присутності всіх препаратів рибосом - 10-20 молекул АТР/рибосома, хв. На рис. 2 показано, що 80S рибосоми, реконструйовані з 40S та 60S субодиниць, також здатні гідролізувати АТР без будь-якого додаткового розчинного білкового фактору.
Рис. 2. Кінетика гідролізу ATP/GTP реасоційованими 80S рибосомами із печінки кроля
Виявилося, що GTP також гідролізується як "run-off", так і реконструйованими 80S рибосомами, хоча й менш ефективно, ніж АТР.
Промивання рибосом 0,66 М (KCl + NH4Cl), обробка низькими концентраціями Mg2+, центрифугування у градієнті сахарози, дисоціація рибосом та реасоціація їх з субодиниць не призводять до зникнення АТРазної активності. Крім того, рибосомальна ATP/GTPазна активність не пригнічується фусидовою кислотою та антитілами проти EF-1
| 
