|
Київський університет імені Тараса Шевченка
УДК 582, 287; 577, 156
НIКIТIНА ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРIВНА
Регуляцiя активностi екзопротеїназ молокозсiдальної
дії штамiв Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv
Спеціальність - 03.00.04 бiохiмiя
Автореферат
на здобуття наукового ступеня
кандидата бiологiчних наук
Київ – 1999
Дисертацією є рукопис
Дисертація виконана у Донецькому державному унiверситеті
Науковий керівник - Бойко Михайло Iванович, доктор біологічних наук,
професор, завідувач кафедри Донецького державного університету.
Офіційні опоненти - Варбанець Людмила Дмитрiвна, доктор біологічних
наук, Інститут мiкробiології i вiрусології iм.Д.К.Заболотного НАН України.
- Хижняк Свiтлана Володимирiвна, доктор біологічних
наук, Київський університет імені Тараса Шевченка.
Провідна установа - Харкiвський державний унiверситет, кафедра фізіології
та бiохiмiї рослин, м.Харків.
Захист відбудеться 25 травня 1999 року о 13 годині на зсіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського університету імені Тараса Шевченка за адресою: 252127, пр. акад.Глушкова, 6)
Автореферат розісланий 22 квітня 1999 року.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського університету імені Тараса Шевченка (252033, м.Київ, вул.Володиирська, 58)
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальнiсть проблеми. Розробка та освоєння нових високоефективних технологiй, якi сприяють комплексному використанню молока, - важливе нородно-господарське завдання. Впровадження до технологiї виробницьтва ферментних препаратiв мiкробного та грибного походження може суттєво впливати на досить довгi пасивнi схеми одержання молочних продуктiв. Ферменти повиннi широко вивчатися та вживатися з метою пiдвищення якостi продукцiї, отриманя принципово нових продуктiв та пiдвищення рентабельностi виробництва.
Сичужний фермент, за традицєю, виробляють iз сичуга ягнят та телят. При цьому отримується не досить активний фермент з великим вмiстом баластових речовин. Розширення виробництва сирiв та iнших молочних виробiв потребують пошуку замiнникiв сичужних ферментiв.
Ферментнi системи вищих базидiальних грибiв зараз вивчаються бiльш широко та планомiрно, але мiцелiальнi гриби у цьому аспектi вивченi ще не досить добре. Важливiсть подiбних дослiджень безперечна, тому що як фiзiологiчнi, так i ферментативнi характеристики чистих мiцелiальних культур, їх первиннi та вториннi процеси метаболiзму та вiдповiднi продукти явно вказують не тiльки на наукове значення напрямку, але i на його перспективнiсть для практичного використання.
Порiвняльна простота культивування грибiв, їх висока фiзiологiчна та генетична пластичнiсть вiдкривають великi можливостi cтосовно промислової ферментологiї та селекцiї штамiв-продуцентiв.
Отримання цiнних грибних метаболiтiв пов′язано з оптимiзацiєю умов для їх бiосинтезу пiд час штучного культивування та є однiєю з основних задач, яка потребує вирiшення. Впровадження до сфери промислового використання як можна бiльшої кiлькостi базидiомiцетiв приведе до збiльшення корисних ресурсiв нашої держави.
Мета i завдання дослiджень. Метою роботи було пiдвищення синтезу протеїназ молокозсiдальної дiї штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 H. laricinus шляхом використання рiзних факторiв.
Для досягнення цiєї мети вирiшувалися такi завдання :
- з′ясування здатностi штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 до синтезу молокозсiдальних протеїназ;
- вивчення впливу та пiдбiр найкращих екологiчних факторiв: способу культивування, температурного, кислотного режимiв росту; та особливостей бiосинтезу дослiджуваних штамiв;
- виявлення специфiки вуглецевого та азотного живлення продуцентiв молокозсiдальних протеїназ;
- встановлення ролi рiзних бiологiчно-активних речовин : ауксину та гiберелiну, екстракту росткiв картоплi, соєвого борошна, якi додавалися до живильного середовища;
- дослiдження можливостi вирощування продуцентiв на дешевих та доступних субстратах;
- виявлення динамiки росту, бiосинтезу i кiнетичних параметрiв при культивуваннi штамiв на рiзноманiтних живильних середовищах.
Наукова новизна роботи. Дослiджено понад 120 середовищ. Отриманi новi вiдомостi про рiвень молокозсiдальної активностi й росту штамiв на цих середовищах. Пiдiбранi оптимальнi показники кислотного та температурного режимiв культивування, умов стерилiзацiї середовищ, спосiб аерацiї. Вперше визначено константи iонiзацiї, якi контролюють активнiсть молокозсiдальних протеїназ у кожного з дослiдженних штамiв i тенденції змiнювання молокозсiдальної активностi та кислотностi середовища у динамицi.
Пiд час вивчення азотного та вуглецевого живлення вперше виявлено двовершинний харктер синтезу ферменту з молокозсiдальними властивостями у H. laricinus на джерелах вуглецю, якi легко засвоюються. Доведено, що тiльки присутнiсть бiлка у середовищi культивування сприяє активному синтезу молокозсiдальних протеїназ. Шляхом пiдбору концентрцiй цукрiв у живильному середовищi досягнуто збiльшення активностi молокозсiдального ферменту та збiльшення його виходу в чистому виглядi в 5 разiв. Середовище з пiдвищеним вмiстом цукрiв запатентовано у Держпатентi України.
Використаня методiв математичного планування дозволило докладно вивчити характер залежностi молокозсiдальної активностi й росту H. laricinus вiд концентрації молочної сироватки та пивного сусла. Вирахованi функції дають можливiсть прогнозувати поведiнку продуценту у будь-якiй точцi простору, обмеженого рiвнями факторiв. Завдяки цьому було пiдiбрано найкраще середовище культивування, яке мiстить молочну сироватку та пивне сусло. На це середовище отримано рiшення про видачу патенту на винахiд.
З′ясовано, що усi дослiджуванi штами H. laricinus мають здатнiсть утворювати позаклiтиннi протеїнази з високою молокозсiдальною активнiстю. Доведена висока пластичнiсть штамiв. Культура штама А-032 H. laricinus запатентована у Держпатентi України, як активний продуцент протеїназ молокозсiдальної дії. Усi дослiдженi штами не виявили плодоношення у культурi.
Практична цiннiсть роботи. Штами H. laricinus можна використовувати як продуценти молокозсiдальних ферментiв, що можуть знайти застосування у виробництвi сирiв.
Можливiсть культивування H. laricinus на дешевих субстратах дозволяє зробити процес виробництва молокозсiдального ферменту бiльш дешевшим, тому що молочна сироватка, яка є вiдходом виробництва молочних продуктiв, зокрема сиру, може вiдразу використовуватись для отримання молокозсiдального ферменту.
Вiдсутнiсть плодоношення у культурi та висока фiзiологiчна пластичнiсть продуцентiв характеризує їх як важливi об′єкти бiотехнології, враховуючи те, що кислi та слабокислi протеолiтичнi препарати у нас взагалi не виробляються.
Зв′язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Представленi дослiдження - це частина роботи, що проводиться на кафедрi фiзiології рослин Донецького державного унiверситету в рамках держбюджетної теми № 97-1вв/16 “Одержати i апробувати новi високоактивнi штами базидiальних грибiв i розробити на їх основi технологiю виробництва цiнних бiопрепаратiв i харчових продуктiв”, яка координується планом науково-дослiдних тем Мiнiстерства освiти Украпни.
Особистий внесок здобувача. Робота виконана особисто автором пiд керiвництвом док.бiол. наук, професора, С.Ф. Негруцького i док. бiол. наук, доцента М.I. Бойко. Особиста участь дисертанта полягала у плануваннi та проведеннi лабораторних дослiджень, аналiзi, узагальненнi одержанних експериментальних даних, спiвставленнi пх з лiтературними матерiалами. Автор приносить щиру вдячнiсть всiм спiвробiтникам кафедри фiзiологiп рослин Донецького державного унiверситету.
Апробацiя роботи. Про основнi положення дисертації доповiдалося на мiжнароднiй конференції, присвяченiй проблемам кореневих та комлевих гнилей (Францiя, 1997), мiжнароднiй конференції “Методологические основы познания особенностей грибов - продуцентов физиологически активных веществ и пищевых продуктов” (Донецьк, 1997), конференції молодих вчених “Актуальнi проблеми фiзiології рослин та генетики” (Київ, 1996), Х з′iздi Украiнського ботанiчного товариства (Полтава, 1997), на наукових конференцiях Дон ДУ (Донецьк, 1994-1997), Всеукраiнських студентських конференцiях (Донецьк, 1992-1997).
У завершеному варiантi дисертацiя доповiдалась на засiданнях кафедри фiзiології рослин Дон ДУ.
Публiкації. За матерiалами дисертації опублiковано 11 наукових праць: 4 статтi в наукових журналах, 2 патенти i 5 тез конференції.
Структура та обсяг роботи. Дисертацiя викладена в 150 сторiнках та склада∈ться з вступу, 7 роздiлiв, висновкiв, рекомендацiй, списку лiтератури ( 198 джерел ). Праця iлюстрована 28 таблицями та 54 малюнками, ма∈ 5 додаткiв.
ЗМIСТ РОБОТИ
Огляд лiтератури
Огляд лiтератури складається iз 3 роздiлiв, в яких висвiтленi питання регуляцiп синтезу позаклiтинних ферментiв мiкроорганизмiв, подана класифiкацiя протепназ та принципи застосування пх у промисловостi, а також охарактеризовано процес ферментної коагуляцiї молока.
Об′єкти i методи дослiджень
Об′єктами наших дослiджень були штами H. laricinus М-81, А-031, А-032 i Р-323. Використовувались чистi культури, видiленi з плодових тiл на кафедрi фiзiології рослин ДонДУ. Штам А-032 та М-81 задепоновано у колекцiю Iнституту Ботанiки iм. М.Г. Холодного НАН Украiни. На штам М-81 H. laricinus спiвробiтниками кафедри отримано патент Украiни ( Бойко, Негруцкий, Мирошниченко та iн., 1994 ).
Гриби вирощували на рiдких живильних середовищах при температурi 300С (Бойко,1996). Основним середовищем було глюкозо-пептонне з додатком мiнеральних речовин (Федорова, Шиврина, 1974). Iнокулювали середовища 7-ми добовим мiцелiєм, який зростав на сусло-агарi.
Молокозсiдальну активнiсть (МЗА) визначали за методом Кавап та Мукап (Kawai, Mukai, 1970). Розрахунок МЗА проводили згiдно з формулою:
40 . 100 . К
МСАКФ= ––––––––––– од/мл,
П
де: К - коефiцiєнт разведення культурального фiльтрату; П - час, за який зi 10 мл молока при додаваннi 1 мл культурального фiльтрата утворю∈ться щiльний сгусток, у хвилинах; 40 - середнiй час зсiдання молока при виробництвi сирiв, у хвилинах.
Кислотнiсть середовища реєстрували потенцiометричним методом, накопичення бiомаси - ваговим (Петербургский, 1966). Залишкову кiлькiсть цукрiв визначали за методом Швецова та Лук′яненко (Ермаков, 1987), а кiлькiсть амiнокислот - фотометричним методом за визначенням амiнного азоту (Ермаков, 1987). Вмiст бiлку визначали за методом Бредфорда (Bredford, 1976).
Одержання ферментного препарату сичужної дії здiйснювали шляхом додавання у культуральну рiдину сiрчанокислого амонiю у кiлькостi, яка вiдповiдає 80% насичення (Бойко, 1996).
Статистичну обробку результатiв здiйснювали за допомогою однофакторного дисперсiйного аналiзу порiвняння середнїх арифметичних величин методом множинних порiвнянь за критерiями Дункана та Тьюки, та критерiю Стьюдента (Лакин, 1980; Негруцкий, Фильчаков, 1984).
Оптимiзацiю середовища з пивним суслом та молочною сироваткою здiйснювали за допомогою повного факторного екcперименту ПФЕ - 52 (Максимов, Пименова, Гречушкина, 1976). Аналiз даних проводили згiдно з алгоритмом Йєйтса. За допомогою комп′ютерних програм здiйснювали побудову поверхней вiдгуку.
Усi эксперименти виконувалися неменш нiж у 3-х повторностях.
Результати дослiджень та пх обговорення
1.Фiзико-хiмiчнi умови культивуваня Hirschioporus laricinus
В роботi було проведено вивчення впливу температури зовнiшнього середовища, рН, аерації, а також режимiв cтерилiзації середовища на рiвень МЗА та накопичення бiомаси штамами H. laricinus.
Встановлено, що змiна температури в межах 28 0С-32 0С не вiдбивається на характерi синтезу молокозсiдального фермента у дослiджуваний перiод (30 дiб) (рис.1), а також на накопиченнi бiомаси. Для культивування H. laricinus можна використовувати температуру 28 0С-32 0С.
Рис. 1. Показники МЗА штаму М-81 H. laricinus пiд час культивування
в рiзних температурних режимах.
Зроблено припущення, що короткочасова дiя пiдвищених та знижених температур на мiцелiй H. laricinus перед реєстрацiєю показникiв МЗА та бiомаси буде викликати порушення напiвпроникностi мембран та обмiнних процесiв у клiтинах, що приведе до збiльшення виходу ферменту в культуральну рiдину.
Вперше встановлено, що дiя температур 40 0С i 45 0С протягом двох годин викликає пiдвищення активностi ферменту. Температура 450С збiльшує МЗА в 3,5 разiв, а температура 40 0С - у 1,9 разiв. Дiя температури 550С пртягом двох годин знижує активнiсть ферменту. Iмовiрно, молокозсiдальна протеiнза H. laricinus не термостабiльна, як бiльшiсть грибних протеїназ. Вплив зниженних температур також пiдвищує МЗА.
Порiвняльне вивчення ферментативнiй активностi H. laricinus в умовах глибинного i поверхневого культивування вказує, що у рiзнi сроки культивування перемiшування по-рiзному вiдбивається на МЗА (рис.2). З′ясовано, що при кiмнатнiй температурi краще здiйснювати культивування глибинним способом.
Рис.2. Молокозсiдальна активнiсть H. laricinus пiд час вирощування
поверхневим та глибинним способом
Дослiдження кислотного режиму культивування продуцента у динамицi дозволили з′ясувати, що всi дослiджуванi штами прявляють здатнiсть до регулювання кислотностi середовища. Пiд час вирощування продуцентiв на середовищi з рН 2,5 молокозсiдальної активностi невстановлено. Характерно те, що оптимальнi значення рН для накопичення бiомаси та синтезу молокозсiдального ферменту не збiгаються, що свiдчить про доцiльнiсть використання комбiнованного кислотного режиму: спочатку пiдтримувати кислотнiсть, яка сприяє росту грибiв, а потiм - ферментації. Оптимальною кислотнiстю середовища для росту штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 є значення рН 5,0 i вище. Для бiосинтезу молокозсiдальних ферментiв вихiдне значення кислотностi повинно складати рН 3,5.
Концентрацiя iонiв водню може регулювати iонний стан субстрату. Змiна кислотної рiвноваги до значень, якi виходять за межi значення рКа, викликає змiну концентрації субстрату i швидкiсть синтезу ферменту.
Спосiб подання експериментальних даних у логарифмiчних координатах дає змогу визначити рКа. На рис. 3 у логарифмiчних координатах подано кiнетику синтезу молокозсiдального фермента штамом М-81 H. laricinus у залежностi вiд рН культивування. Згiдно з теорiєю дії ферментiв - приєднання одного протону до активного центру вiдображається у рН залежностi швидкоcтi у логарифмiчних координатах змiною тангенсу кута нахилу дотичної до вiток сигмоід на одиницю. Оскiльки перехiд тангенсу кута нахилу α на рис. 3 вiд |1,38| до 0, то синтез молокозсiдальної протеїнази, за нашими даними, контролюється однiєю iоногенною групою з рКа менше нiж 3,5 та iншою з рКb близько 3,85.
Концентрацiя iонiв водню у зовнiшньому середовищi й усерединi компартменту, де синтезується фермент, пов′язанi лiнiйним спiввiдношенням:
H+внутр = α / β . H+зовн ,
де α i β - кiнетичнi коефiцiєнти (Варфоломеев, Калюжный, 1990).
Рис. 3. Теоретична залежнiсть логарифма μуяв вiд рН, штама М-81
H. laricinus.
Звiдси, коли α > β (рис. 3), то можна з увпевненiстю стверджувати, що у клiтинах штаму M-81 H. laricinus пiдтримується бiльш кисле середовище. Теж саме стосується й iнших штамiв.
Таким чином активнiсть молокозсiдальної протеїнази пiд час культивування на глюкозо-пептонному середовищi для усїх штамiв контролюється однаково - двома iоногенними групами. Взагалi рН зовнiшнього середовища 3,5 одиниць входить в усi плато логарифмiчного профiлю утворення молокозсiдального ферменту штамiв Н. laricinus i може бути визначена, як оптимальна концентрацiя iонiв водню для синтезу молокозсiдальної протеїнази.
2. Культивування Hirschioporus laricinus на середовищах з
вуглеводами
Пiд час культивування штаму А-032 на середовищах з рiзними цукрами виявлено двовершинний характер синтезу молокозсiдальних протеаз на середовищах з глюкозою (рис. 4), крохмалем та iнулiном, якi легко споживаються продуцентом. У динамiцi накопичення бiомаси на середовищах з цими цукрами вiдмiчається дiауксичний характер росту (рис. 5). Схожа картина росту i синтезу ферменту спостерiгається також при культивуваннi штаму Р-323 на сахарозi та мальтозi.
Рис. 4. Динамiка молокозсiдальної активностi штамiв
- laricinus на середовищi з глюкозою.
Рис. 5. Динамiка накопичення бiомаси штамами H. laricinus
на средовищi з глюкозою.
У цих випадках має мiсце катаболiтна репресiя, коли висока концентрацiя цукрiв на початковому етапi культивування стримує синтез ферментiв, якi асимiлюють iнше джерело живлення. Зменшення кiлькоcтi цукру дозволяє органiзму продукувати нову ферментну систему, що атакує другий субстрат, можливо продукти власного метаболiзму, або джерела азотного живлення.
Щодо штаму А-031, можна довести, що пiсля досягнення високих значень МЗА у 10-ти добовому вiцi вона мало змiнюється до кiнця перiоду культивування.
Таким чином, можна сказати, що всi вивченi цукри, крiм арабiнози, добре використовуються штамами H. laricinus для синтезу молокозсiдальних протеїназ.
Кiнетичнi показники росту та МЗА рiзняться (табл.1). Як правило, для штамiв А-031 и А-032 максимальна швидкicть пiдвищення МЗА вища, нiж швидкiсть збiльшення сухої речовини. Для штаму Р-323 - навпаки. Час подвоєння показникiв бiомаси перевищує час подвоєння показникiв МЗА. Iндивiдуальним для кожного середовища та цукру є час найвищого економiчного коефiцiєнту культури. На середовищi з арабiнозою економiчнi коефiцiєнти усїх грибiв вищi, нiж на середовищах з iншими цукрами.
Таблиця 1
Кiнетичнi показники росту i бiосинтезу молокозсiдального ферменту пiд час культивування штамiв H. laricinus на середовищi з глюкозою.
Дослiдження показали, що пiдбором джерел вуглецевого живлення можна регулювати вiдповiднiсть процесiв росту та змiни МЗА як у бiк прискорення синтезу молокозсiдального ферменту, так i в бiк збiльшення швiдкоcтi росту. Максимальнi швидкоcтi росту та МЗА виявляються на раннїх стадiях розвитку культури.
У випадку пiдвищення концентрації цукрiв у два рази в порiвняннi з стандартним середовищем вiдбувається збiльшення МЗА на усїх середовищах з протягом 30-добового культивування. Пiдвищення концентрації глюкози, мальтози i крохмалю викликає зниження значень бiомаси наприкiнцi перiоду культивування. Це, мабуть, пов′язано зi здатнiстю цих цукрiв у зазначенiй концентрації стимулювати синтез ферментiв, що викликають руйнування клiтинних оболонок мiцелiю H. laricinus.
Пiдвищення вмiсту цукрiв у середовищi культивування у 2 рази доцiльно, тому що це збiльшує вихiд молокозсiдального ферменту у 5 разiв i пiдвищує його активнiсть
3. Роль джерел азоту для культивування штамiв
Hirschioporus laricinus
Пiд час дослiдження джерел азотного живлення ( NH4NO3, (NH2)2CO, (NH4)2SO4, CH3COONH4, NaNO3, KNO3 та пептон ) рiст продуцентiв виявлено на всїх речовинах, що мiстять азот (рис.6). Добре використовуються для накопичення бiомаси H. laricinus сечовина й сiрчанокислий амонiй, але показники бiомаси в обох випадках нижчi, нiж на середовищi, яке мiстить пептон.
 Рис.6. Накопичення бiомаси штамом А-031 пiд час вирощування на
рiзних джерелах азоту.
Стосовно МЗА можна вiдзначити, що нiтрат натрiю та калiю, а також ацетат амонiю цiлком iнгiбують синтез молокозсiдального ферменту. На рештi джерел рiвень МЗА нижчий, нiж на середовищi з пептоном в 5-27 разiв. Таким чином, штами H. laricinus для росту та синтезу молокозсiдального ферменту краще використовують азот пептону. Нiтрат- iон непридатний до культивування штамiв H. laricinus.
Вивчення впливу амiнокислот: DL-триптофан, DL-фенiлаланiн, DL-лiзинмоногiдрохлорид, DL-лейцин, DL-метiонiн, L-iзолейцин, L-гiстидингiдрохлорид, DL-валiн, L-аргiнiнгiдрохлорид, DL-треонiн, проводили шляхом додавання їх у середовище у кiлькостi, еквiвалентнiй 3 г пептону по амонiйному азоту.
На середовищах з триптофаном, лiзинмоногiдрохлоридом, валiном та треонiном МЗА не виявлена. На середовищах, де була МЗА, рiвень ії складав близько 2500 од/мл. Для росту H. laricinus краще використовувати лiзинмоногiдрохлорид. Використання амiнокислот штамами проходить неоднаково. Краще з усїх амiнокислот використовуються триптофан та аргiнiн, слабко - метiонiн та валiн.
Значення МЗА на середовищах з амiнокислотами на порядок нижче, нiж на середовищi з пептоном, але значення бiомаси на цих середовищах незначно поступаються значенням бiомаси на глюкозо-пептонному середовищi. Це свiдчить, що амiнокислоти використовуються продуцентом переважно для росту органiзму.
Таким чином, для синтезу молокозсiдального ферменту штамами H. laricinus необхiдна наявнiсть у середовищi культивування бiлкового азоту, який серед усїх вивчених джерел азотного живленя ∈ тiльки у пептонi.
| 
