|
Національна Академія Наук України
Інститут молекулярної біології і генетики
ОБОЛЕНСЬКА Марія Юріївна
УДК 577.113.083:577.218
РЕГЕНЕРАЦІЯ ПЕЧІНКИ У ЩУРІВ :
молекулярно-біологічні процеси,
їх регуляція та часова шкала
03.00.03 - молекулярна біологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ 1999
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі молекулярних механізмів біосинтезу білка Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (зав. відділом - доктор біологічних наук О.М.Платонов ), в Інституті геронтології АМН України і в Альберт-Людвіг Університеті (Фрайбург, Німеччина).
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Соломко Олександр Петрович Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ зав. відділом біохімічної генетики;
доктор медичних наук, професор Бикоріз Анатолій Йосипович Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ зав. відділом біології пухлинної клітини;
доктор біологічних наук, професор Стойка Ростислав Степанович Інститут біохімії ім. акад. О.В. Палладіна НАН України, Львів директор відділення регуляторних систем клітини.
Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України, Київ
Захист дисертації відбудеться _22 червня 1999р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м. Київ-143, вул.Заболотного 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м. Київ-143, вул.Заболотного 150.
Автореферат розісланий 22 травня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Л.Л. Лукаш
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Регенерація печінки - складний компенсаторний процес відновлення маси і функції органу внаслідок необоротного ушкодження або механічного видалення частини його паренхіми. Цей процес стоїть в одному ряду з такими біологічними явищами як ріст, розвиток, диференціювання, апоптоз. Розшифрування молекулярних механізмів, які зумовлюють ці процеси, залишається актуальною проблемою сучасної біології. Передумови для вирішення таких задач створені досягненнями в різних галузях біології, зокрема, в царині експресії геному і процесів диференціювання, взаємодії між клітинами різної природи та між системами організму тощо.
Регенеруюча печінка гризунів вважається класичною моделлю для вивчення загальних закономірностей і тканиноспецифічних особливостей відновлювальних процесів. Постулюється, що регенераційний процес в печінці має такі складові: реакція на ушкодження; біохімічна адаптація органу до функціонального навантаження, що зросло; перехід клітин із проліферативно неактивного стану до клітинного поділу і реакції, які зумовлюють зміну старого фенотипу; власне проліферація клітин; реакції, які зумовлюють перехід від клітинного поділу до стану "спокою". В інтегральному процесі регенерації печінки приймають участь всі клітини органу. Регуляція клітиноспецифічних функцій та поділу клітин одного типу, а також взаємодія між клітинами різних типів здійснюється за допомогою сигнальних молекул, зокрема тих, що виробляються клітинами печінки. Процеси, що відбуваються в регенеруючій печінці, координуються також з потребами цілісного організму. Все це зумовлює складну ієрархію регуляторних процесів на різних рівнях організації - субклітинному, клітинному, органному та організменному, і забезпечує чітку часову та просторову організацію процесу.
Кінцева мета у вивченні регенераційного процесу полягає у розшифруванні ключових механізмів кожної складової процесу і засобів їх координації як між собою, так і з вимогами організму, що змінюються. Ці знання повинні розширити уявлення про принципи функціонування живого і можуть бути використані для формального описання відновлювального процесу, що стало би суттєвим етапом у його пізнанні.
Зараз зібраний великий матеріал про біохімічні процеси, які відбуваються в печінці та в організмі під час відновлення печінки, існують різні гіпотези відносно природи процесу, однак кінцевої мети ще не досягнуто. Відсутня загальна схема процесу, в якій би враховувався його розвиток в часі і в просторі різнорідного за своїм клітинним складом органу. Як і раніше актуальними залишаються
питання про природу регуляторних факторів, що запускають регенерацію, координують діяльність всіх клітин протягом відновлювального процесу і завершують його. Здобутки сучасної молекулярної біології дають можливість звертатися до цих питань і вирішувати їх як на новому теоретичному, так і на методичному рівні.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводилися у відділі молекулярних механізмів біосинтезу білка ІМБіГ НАН України (зав. відділом доктор біологічних наук О.М. Платонов) (бюджетні теми: №01.86.0069116 - "Характеристика цитоплазматичних білкових факторів, які активують ядерний геном на ранніх стадіях регенерації печінки"; №01.9100034 - "Вивчення генів, експресія яких залежить від клітинного циклу гепатоцитів"; №0195U005358 - "Послідовність експресії протоонкогенів і тканиноспецифічних генів у клітинному циклі гепатоцитів". Частина робота виконувалася в Інституті геронтології АМН України та в Інституті клітинної і молекулярної біології Альберт-Людвіг Університету (Фрайбург, Німеччина) за проектом SFB154 від Німецького наукового товариства.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягає у з'ясуванні деяких молекулярних механізмів, які забезпечують перехід високоспеціалізованих і неактивних у проліферативному відношенні клітин печінки до проліферації та координацію їх клітиноспецифічної і проліферативної активності протягом відновлювального процесу, зумовленого частковою гепатектомією (ЧГЕ). Основну увагу планувалося приділити вивченню експресії геному і деяких його генів, що кодують специфічні та неспецифічні для паренхімних і непаренхімних клітин печінки регуляторні фактори. Для досягення поставленої мети вирішувались такі задачі: 1. Ввести орієнтири для створення часової шкали регенерації печінки як динамічного процесу; 2. Дослідити деякі особливості експресії геному і регуляторних факторів протягом переходу печінки від "спокою" до проліферації, оскільки цей період є критичним для подальшого відновлення органу; 3. Дослідити, як протягом відновлювального процесу регулюються характерні для гепатоцитів властивості, а саме здатність знешкоджувати чужерідні речовини і синтезувати клітиноспецифічні білки. Для оцінки цих властивостей обрано експресію відповідних генів, які кодують цитохром Р4502Е1, білок першої фази дезінтоксикації, і клітиноспецифічний транскрипційний фактор - ядерний фактор гепатоцитів 1 (ЯФГ-1); 4. Дослідити клітиноспецифічну і проліферативну активність непаренхімних клітин печінки на прикладі синтезу, зокрема, фактора некрозу пухлин і ДНК;
5. Провести порівняльне дослідження експресії клітиноспецифічних (ЯФГ-1) і клітинонеспецифічних (c-Fos, c-Myc) транскрипційних факторів в печінці у щурів після ЧГЕ і лапаротомії (ЛАП) з тим, щоб визначити роль цих факторів у проходженні гепатоцитами клітинного циклу та у відповіді гепатоцитів на травму;
6. З'ясувати як впливають події посттранскрипційного рівня на регуляцію експресії геному та окремих генів у регенеруючій печінці, зокрема, шляхом дослідження синтезу і внутрішньоклітинного розподілу новоствореної РНК, відносного вмісту індивідуальних транскриптів у фракціях ядерної і цитоплазматичної РНК, а також шляхом визначення ензиматичної активності системи 2',5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L, яка регулює вміст РНК в клітині;
7. Зважаючи на важливу роль окису азоту як універсального біорегулятора, визначити його продукцію різними клітинами регенеруючої печінки і можливу роль у відновленні маси і функції органу.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше запропоновано використовувати показники синтезу ДНК у клітинах печінки різного типу як орієнтири для створення часової шкали регенераційного процесу.
На підставі даних про синтез РНК і розподіл новоствореної РНК в клітинних структурах гепатоцитів, а також даних про експресію геному та індивідуальних генів вперше виділено два принципово різних процеси протягом переходу печінки із стану "спокою" до стану проліферативної активності. Для першого процесу характерні миттєві компенсаторні реакції: активація загального синтезу РНК у гепатоцитах і синтезу в ядрах і мітохондріях, підвищення вмісту досліджених індивідуальних мРНК. Вміст клітиноспецифічних РНК ЯФГ-1 та Р4502Е1 зростає більшою мірою, ніж вміст РНК, які кодують клітинонеспецифічні транскрипційні фактори c-Myc та c-Fos. Другий процес характеризує зміну фенотипу клітин печінки і проявляється тимчасовим зниженням синтезу РНК, затримкою новоствореної РНК в ядрі і відповідно меншим надходженням її в цитоплазму. Вперше продемонстровано зниження і підвищення активності системи 2',5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L відповідно в ядерній і цитоплазматичній фракціях. Вказана система відповідає за розщеплення вибраних молекул РНК. Вперше виявлено підвищення активності інтерферону /, специфічного індуктора системи 2',5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L.
Вперше виявлено підвищення експресії фактора некрозу пухлин протягом перехідного періоду, що свідчить про активацію клітиноспецифічних функцій клітин Купфера або "осілих" макрофагів
печінки. Продемонстровано зростаючу сприйнятливість клітин печінки до цього фактору внаслідок підвищення експресії обох рецепторів. Вперше з'ясовано, що в період, коли в регенеруючій печінці одночасно відбуваються синтез ДНК в гепатоцитах і тканиноспецифічна відповідь на травму, підвищена експресія транскрипційних факторів c-Fos i ЯФГ-1 пов'язана з відповіддю на травму. Вперше показано, що в регенеруючій печінці зміни експресії фактору c-Мyc корелюють з фазами клітинного циклу і пов'язані з проліферативною відповіддю з боку гепатоцитів.
У цілісній тканині регенеруючої печінки та в популяціях гепатоцитів, "осілих" макрофагів і ендотеліальних клітин із синусоїдів печінки вперше визначено синтез окису азоту. Виявлено, що синтез окису азоту позитивно корелює із G1- та G2-періодами клітинного циклу відповідних клітин і негативно - з S-фазою клітинного циклу тих же клітин.
На підставі аналізу літературних даних і результатів нашої роботи вперше висловлено декілька припущень відносно ролі специфічної і проліферативної активності паренхімних і непаренхімних клітин печінки протягом відновлювального процесу. Синусоїдальні клітини печінки, які є клітинами мезенхімного походження, протягом перехідного періоду і клітинного циклу гепатоцитів інтенсивно продукують сигнальні молекули і за їх допомогою регулюють перехід до проліферації і власне проліферацію гепатоцитів. З початком клітинного циклу синусоїдальних клітин їх паракринна активність знижується. Проліферативна активність клітин печінки одного типу поєднується з специфічною активністю клітин печінки іншого типу. Для кожного типу клітин печінки існують клітиноспецифічні мітогени, деякі з яких одночасно діють як клітиноспецифічні інгібітори проліферації для інших клітин регенеруючої печінки.
Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Теоретичне значення одержаних результатів полягає у тому, що вони розширюють уяву про молекулярні механізми відновлювальних процесів. Вони, зокрема, свідчать про необхідність активної зміни "старого" фенотипу під час переходу високодиференційованих клітин до проліферації, про характер взаємодії клітин мезенхімного і епітеліального походження, а також про взаємодію регуляторних систем таких як окис азоту та 2'5'-оліго(А)аденілати з цитокінами. Отримані результати дають уяву про природу транкскрипційних факторів, які зумовлюють відповідь печінки на травму і проходження клітинного циклу, про подвійну функцію, принаймні, деяких регуляторів проліферації, які діють як клітиноспецифічні активатори і клітиноспецифічні інгібітори проліферації.
Практичне значення одержаних результатів полягає у їх використанні при плануванні дослідницької роботи в галузях, пов'язаних із вивченням проліферації та диференціювання печінки. Крім того, отримані результати можуть бути корисними при розробці стратегії лікування багатьох захворювань печінки або наслідків хірургічного втручання, наприклад, для стимулювання відновлювальних процесів у хворих на гепатит або для гальмування злоякісного росту, для контролю за ростом трансплантованої печінки тощо.
Особистий вклад здобувача. Більшість результатів, які викладено в дисертації, одержані пошукачем самостійно. Частину експериментальних досліджень було проведено в співробітництві з Герасимовою Т.Б., Білич К.І., Новіковою Л.В., Сазоновою Л.Я., Ваніним А.Ф., Мордвінцевим П.І. і Шульце-Шпекінг А. Усі досліди планувались пошукачем, проводились і обговорювались під її безпосереднім керівництвом. Підготовка матеріалів до друку і написання текстів наукових повідомлень здійснювалась виключно пошукачем. Матеріали опубліковано в спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на: IV всесоюзному біохімічному з'їзді (Львів, 1979); IV всесоюзному симпозіумі "Молекулярні механізми генетичних процесів " (Москва, 1979); VII всесоюзному симпозіумі "Структура і функції клітинного ядра" (Харків, 1980); V всесоюзному симпозіумі "Міжмолекулярні взаємодії і конформації молекул" (Алма-Ата, 1980); IV симпозіумі СРСР-ФРН "Структура і транскрипція геному" (Єреван, 1981); Українському біохімічному з"їзді (Дніпропетровськ, 1982); XII всесоюзній конференції з електронної спектроскопії (Суми, 1982); республіканській конференції "Ядерні білки і експресія геному" (Канів, 1983); VI всесоюзній конференції "Питання регенерації і клітинного розмноження" (Москва, 1985); V всесоюзному біохімічному з'їзді (Київ, 1986); школі "Сучасні проблеми регенерації" (Йошкар-Ола, 1986); IX всесоюзному симпозіумі "Структура і функції клітинного ядра" (Черноголовка, 1987); V українському біохімічному з'їзді (Івано-Франківськ, 1987); школі-конференції "Структура і функція біополімерів" (Львів, 1989); Фальк-симпозіумі "Білки в регуляції генів печінки" (Базель, Швейцарія, 1989); Всесоюзній нараді "Актуальні питання клітинної біології" (Ленінград, 1989); Всесоюзній школі-семінарі "Молекулярна біологія і медицина" (Ленінград, 1990); Всесоюзному симпозіумі "Молекулярна і клітинна онкобіологія" (Львів, 1990); VI, VII i VIII міжнародних симпозіумах "Клітини синусоїдів печінки" (Антверпен, Бельгія, 1992; Кіото, Японія, 1994; Бордо, Франція, 1996); нараді німецького товариства дослідників печінки (Берлін, Німеччина, 1993); міжнародному симпозіумі "Регуляція експресії генів печінки в нормі і патології (Колд-Спрінг-Харбор, 1993);
симпозіумі американського товариства дослідників печінки "Регенерація печінки" (Аерлі, США, 1993); Фальк-симпозіумі "Цитокіни і печінка" (Фрайбург, Німеччина, 1994), Фальк-симпозіумі і конгресі "Хвороби печінки і клініка" (Базель, Швейцарія, 1995); Фальк-симпозіумі "Сигналізація в печінці" (Фрайбург, Німеччина, 1997); Фальк-симпозіумі "Нормальний і злоякісний ріст" (Халле, Німеччина, 1998).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 55 робіт, які включають розділ у монографії, 26 статей, із них 6 одноосібних і 20 в співавторстві, 7 - в зарубіжних виданях, і 28 тез доповідей наукових конференцій.
Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 290 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, об'єктів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, підсумків і висновків. Список літератури включає 380 найменувань. Дисертація проілюстрована 17 таблицями і 57 рисунками.
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для роботи використовували самців білих щурів лінії Wistar віком 4-5 місяців вагою 200-300 г. Регенерацію печінки моделювали за допомогою операції видалення лівої латеральної та серединної часток печінки [Higgins, Anderson, 1931], реакцію печінки на травму - за допомогою лапаротомії. Основним об'єктом дослідження була печінка інтактних і оперованих щурів у різні строки після операцій.
ДНК-синтетичну активність в клітинах регенеруючої печінки визначали за допомогою 3Н-тимідіну, який вводили внутрішньовенно за 1 год до декапітації. Виділення ДНК проводили за методом Цанєва і Маркова [1969]. Показники проліферативної активності клітин Купфера і ендотеліальних клітин синусоїдів визначали за відносним вмістом клітин з подвоєною кількістю ДНК у популяції відповідних ізольованих клітин. Суспензію ізольованих клітин обробляли розчином РНКази з наступним фарбуванням ДНК пропідіуміодидом. Відносний вміст клітин з різною кількістю ДНК визначали на приладі для сортування клітин з використанням програми CELLFIT і моделі SOBR.
Дослідження внутрішньоклітинного синтезу і розподілу новоутвореної РНК в гепатоцитах проводили методом електрономікроскопічної авторадіографії. У нижчезазначені терміни щурам вводили внутрішньочеревинно 3Н-оротову кислоту. Обробку печінки і підготовку зрізів проводили стандартним методом у модифікації Герасимової і Білич [1986]. Використана методика дає
розмір зерен срібла менший за найменшу досліджену органелу клітини - мітохондрію, що дозволяє ототожнювати зерна срібла з новоутвореною РНК, яка належить цим і іншим структурам клітини. Кількість зерен срібла над різними компартментами (ядро, ядерце, мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум) гепатоцитів визначали за допомогою електронного мікроскопу JEM-IOOB методом прямого влучення [Подымов, Кортуков, 1981].
Кінетичну складність ядерної РНК визначали в реакції гібридизації між зникаючими кількостями радіоактивно мічених фракцій клітинної ДНК і надлишком ядерної РНК. Фракції ДНК, в яких послідовності повторюються близько 105, 103 і 1-10 разів, розділяли за швидкістю реасоціації і виділяли за допомогою хроматографії на оксиапатиті. ДНК мітили в реакції нік-трансляції з 32Р-дЦТФ згідно [Rigby, 1977]. Для виключення реасоціації ДНК під час гібридизації реакцію здійснювали у присутності 80% формаміду. Ступінь гібридизації визначали як частку радіоактивної ДНК, яка входить до складу гібридних молекул. Гібриди відокремлювали від одноланцюгової нуклеїнової кислоти хроматографією на оксиапатиті.
Відносний вміст індивідульних РНК визначали в складі ядерної і полі(А)+ цитоплазматичної РНК за методом Northern-гібридизації та в складі тотальної РНК за методом зворотньої транскрипції - ланцюгової полімеразної реакції. Ядерну і цитоплазматичну фракції клітин печінки розділяли центрифугуванням тканинного гомогенату в розчині 0,25 М сахарози - 2,5% лимонної кислоти при 600 g. Тотальну, ядерну і цитоплазматичну РНК виділяли гуанідінізотіоціанатним методом [Cathalа et al., 1983]. Полі(А)+ цитоплазматичну РНК отримували шляхом фракціонування цитоплазматичної РНК на колонці з оліго(дТ)целюлозою. кДНК-зонди мітили в реакції нік-трансляції або в реакції з розсіяною затравкою згідно до інструкції виробника відповідних реактивів (Amersham, Англія). Гібридизацію проводили на фільтрах Hybond N+ стандартною технікою Dot- i Blot-гібридізації у модифікації Патер та інш. [1991]. Ступінь гібридизації кДНК з РНК кількісно оцінювали за допомогою денситометрії радіоавтографів. В кожний із моментів дослідження визначався вміст індивідуальних транскриптів в РНК фракцій у %% стосовно до вмісту відповідних транскриптів в РНК із інтакної печінки, а також вміст індивідуальних транскриптів у перерахунку на ДНК з врахуванням змін, які стосуються вмісту відповідної фракції РНК в тканині протягом операційного періоду [Atryzek, Fausto, 1978].
Зворотню транскрипцію тотальної РНК і ланцюгову полімеразну реакцію отриманої кДНК здйснювали згідно з протоколом фірми Pharmacia (Швеція). Для підвищення чутливості ланцюгової полімери-
зації 5'-праймери мітили (-32Р)дАТФ в Т4-полінуклеотидкіназній реакції згідно до протоколу фірми - виробника реактивів. Цикл полімеризації складався із денатурації 1 хв при 94С, віджигу 1 хв при специфічнй температурі для кожної пари праймерів і власне полімеризації 1 хв. при 72С. Початкова денатурація і завершальна полімеризація тривали відповідно 5 і 25 хв. Реакційну суміш піддавали електрофорезу в 5% поліакріламідному гелі за неденатуруючих умов. Радіоактивність характерних смуг на радіоавтографах визначали за методом Черенкова. Активність 2',5'-оліго(А)синтетази визначали в ядерній і цитоплазматичній фракції S15 за кількістю міченого АМФ, який включається в олігоаденілати в присутності ензиму [Smekens-Etienne et al.,1983]. Ядра виділяли в розчині 0,32 М сахарози в присутності інгібіторів протеіназ і очищали центрифугуванням через 1,5 М сахарозу [Bush et al., 1967]. Ензим із ядерної і цитоплазматичної фракції S15 афінно зв'язували з надлишком кополімера поліІ - поліЦ, який фіксували на папері Whatman 3ММ. Продукти реакції олігомеризації розділяли за допомогою тонкошарової хроматографії на поліетіленіміноцелюлозі і кількісно визначали за їх радіоактивністю у сцинтиляційному лічильнику.
Вміст РНКази L визначали методом ковалентного зв'язування її специфічного активатора 2-5А4-3'-(32Р)фЦ [Bisbal et al., 1989]. Реакцію зв'язування олігоаденілату здійснювали в двох варіантах - з клітинним екстрактом печінки з наступним електрофорезом і з Western-блотом клітинного екстракту. У кожний з моментів дослідження кількість зв'язаного олігоаденілату визначали денситометрією електрофореграм і по відношенню до кількості олігоаденілату, зв'язаного з ензимом інтактної печінки, видаленої під час ЧГЕ у тієї ж тварини. Активність інтерферону / в екстракті тканини печінки визначали за його здатністю пригнічувати цитопатогенну дію вірусу везикулярного стоматиту в культурі клітин [Ho, Enders, 1959]. Рівень синтезу окису азоту в печінці визначали методом електронного парамагнітного резонасу [Vanin et al., 1984]. Метод базується на здатності диетилтіокарбамату (ДЕТК), який вводиться за 30 хв до декапітації, зв'язуватися з ендогенним негемовим залізом з утворенням "пастки" для окису азоту. При взаємодії ендогенного окису азоту з "пасткою" утворюється мононітрозильний комплекс заліза з ДЕТК, який і дає специфічний ЕПР-сигнал. Спектри ЕПР визначали на радіоспектрометрі ЕПР Varian E9. NO-синтетичну активність гепатоцитів, клітин Купфера і ендотеліальних клітин синусоїдів визначали за кількістю нітритів, які накопичуються протягом однієї доби у культуральній рідині відповідних ізольованих клітин [Griess et al., 1982].
Гепатоцити ізолювали колагеназним методом [Tran-Thi et al., 1985], а клітини Купфера і ендотеліальні клітини синусоїдів - проназно-колагеназним методом з їх подальшим розділенням в елютріаторі [Eyhorn et al., 1988]. Ізольовані клітини ідентифікували за структурою, здатністю поглинати частинки латексу (1,16µ), притаманну клітинам Купфера, наявністю характерного для ендотеліальних клітин синусоїдів поверхневого антигену, що взаємодіє з антитілами RECA [Duijvestijn et al., 1992] і за специфічною для клітин Купфера реакцією на хлорацетатестеразу [Shlayer et al., 1988]. Ізольовані клітини культивували на пластикових планшетах згідно [Tran-Thi et al., 1985; Eyhorn et al., 1988].
Дані досліджень оброблено статистично з використанням -критерію Стьюдента, а дані електрономікроскопічної авторадіографії - за методом одно- і двофакторного дисперсійнного аналізу [Плохинский, 1975].
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
Часова характеристика регенераційного процесу.
Показники ДНК-синтетичної активності клітин регенеруючої печінки вивчали з метою використання їх як часових орієнтирів процесу відновлення органу. Відносна легкість визначення цих показників, різноманітність існуючих методів, універсальність прояву проліферативної активності з боку клітин усіх типів зумовлюють цей вибір.
Інтенсивність синтезу ДНК в печінці інтактних щурів є незначною ( 0,66 х 104 імп х хв-1 х мг-1 ДНК ), але через 18 год після ЧГЕ питома радіоактивність ДНК зростає більше, ніж в 100 разів і тримається на цьому рівні біля 10 год, що відповідає тривалості S-фази (рис.1). Через 38 і 50 год після ЧГЕ виявлено додаткові підйоми біосинтезу ДНК. Якщо згідно з даними Bucher et al. [1964], перший підйом повністю зумовлений синтезом ДНК в гепатоцитах, то другий пов'язаний з активністю епітелію жовчних протоків і перисинусоїдаль-них зірчастих клітин [Tanaka et al., 1990; Michalopoulos, 1997], а також з активністю певної фракції гепатоцитів, які повторно вдаються до проліферації.
Проліферативна активність клітин Купфера виявляється менш синхронною, ніж у гепатоцитів, оскільки за даними FACS-аналізу клітини знаходяться в фазах S - G2 протягом 37-62 год (рис. 2А).
Відповідна фаза в ендотеліальних клітин синусоїдів припадає на промі жок часу між 72 і 120 год після ЧГЕ (рис.2Б).
Враховуючи зазначені і раніше відомі показники проліфе-ративної активності клітин регенеруючої печінки, проміжок часу від початку G1-фази клітинного циклу гепатоцитів (близько 3-4 год після ЧГЕ) [Lu et al., 1992] до, принаймні, 6-ої доби після операції можна розглядати як клітинні цикли гепатоцитів, епітелія жовчних протоків, перисинусоїдальних зірчастих клітин, клітин Купфера і ендотеліальних клітин синусоїдів, що відбуваються в названій послідовності.
Рис. 2. Відносний вміст клітин Купфера (А) і ендотеліальних клітин синусоїдів (Б) в G0- і G1- та в S- і G2-фазах клітинного циклу.
Більш докладними орієнтирами є показники окремих фаз клітинного циклу різних клітин.
Проміжок часу від операції до початку першого клітинного циклу гепатоцитів виділяється як перехідний, і для його періодизації використані чисельні показники експресії геному і окремих генів.
Експресія геному і деякі механізми її регуляції протягом перехідного періоду регенераційного процесу
Синтез і внутрішньоклітинний розподіл новоутвореної РНК
У гепатоцитах печінки щурів після ЧГЕ і ЛАП методом електрономікроскопічної авторадіографії оцінювали синтез і внутрішньоклітинний розподіл новоутвореної РНК за середньою чисельністю зерен срібла над різними компартментами одиночної клітини і за відносною кількістю клітин, в яких зерна виявляються над відповідними структурами.
Рис. 3. Розташування зерен срібла над клітинними структурами гепатоцита.
Я - ядро, ЯД - ядерце, ЯП - ядерна пора, М - мітохондрія, ЭР - ендоплазматичний ретикулум, ЭХ - еухроматин, ГХ - гетерохроматин.
3Н-оротову кислоту (3Н-ОК) вводили на короткий (за 15 хв до забору зразків) і більш тривалий (введення в момент операції) час. У першому випадку показники характеризують інтенсивність процесів, а в другому - кількість і розподіл новоутвореної РНК внаслідок процесів, що відбуваються з РНК протягом експозиції з ізотопом (рис.3,4).
Рис.4. Інтенсивність синтезу РНК в нуклеоплазмі (Н), ядерці (Яд), мітохондріях (М), інтенсивність її надходження до цитоплазми (EР) та відносна кількість задіяних в цих процесах гепатоцитів в печінці щурів після ЧГЕ.
3Н-ОК вводили за 15хв до забору зразків печінки.
t0 i ti - час забору зразків у інтактних і оперованих щурів.
Показники досто-вірності сили впливу за [Плохинский, 1970]:
Н: Ф=7>Ф0,999=5,4; Яд.: Ф=10,5>Ф0,999=7,5; М: Ф=11,5>Ф0,999=5,6; ЭР: Ф=4,5>Ф0,95=2,7
Через 15 хв після введення 3Н-ОК новоутворена РНК виявляється з різною частотою в окремих компартментах гепатоцитів випадкового зрізу. Всі гепатоцити інтактної печінки містять зерна срібла над без'ядерцевою частиною ядра, ядерцем і над ендоплазматичним ретикулумом і тільки біля 10% клітин - над мітохондріями (рис.4). Через 30 хв після ЧГЕ стрімко зростає синтез РНК в ядрі і підвищується кількість новоутвореної РНК в ендоплазматичному ретикулумі. Значно зростає синтез РНК у мітохондріях окремо взятого гепатоцита і на порядок зростає кількість гепатоцитів, в яких виявляються зерна над мітохондріями. Мітохондрії з новоутвореною РНК розташовані у безпосередній близькості до ядра. В інтервалі 0,5-3,0 год після ЧГЕ зберігається підвищений рівень синтезу РНК у без'ядерцевій частині ядра і уповільнюється в ядерці і мітохондріях, причому значною мірою за рахунок зменшення частки гепатоцитів, які приймають в ньому участь. Після зменшення кількості новоутвореної РНК в ендоплазматичному ретикулумі відбуваєтсья її повільне зростання.
При більш тривалій присутності ізотопу в організмі теж виявляється двофазний характер змін - початкове підвищення вмісту РНК у зазначених відділах клітин, яке змінюється тимчасовою затримкою новоутвореної РНК в ядрі і відповідно меншим її надходженням до цитоплазми. Цей процес збігається з перебудовою апарату трансляції - з скороминучим зменшенням числа зв'язаних з ендоплазматичним ретикулумом рибосом. Наступне збільшення кількості рибосом та їх впорядкування було зафіксовано, починаючи з 3-ої години після ЧГЕ [Платонов и др., 1980]. Таким чином, згідно з нашими даними перехідний період включає фазу адаптивного посилення експресії ядерного і мітохондріального геномів і фазу заміни існуючої програми діяльності клітин на нову.
Кінетична складність ядерної РНК
Для загальної характеристики ядерної РНК був використаний метод гібридизації надлишку РНК із слідовими кількостями основних фракцій ДНК, які було розділено за частотою повторення послідовностей. Виявилося, що ядерна РНК із печінки через 3 год після ЧГЕ гібридизується з меншою часткою унікальних послідовностей ДНК (частота повторення 1-10 разів), ніж ядерна РНК із печінки через 3 год після ЛАП ( 7,9% ДНК в гібридах проти 11,4 % ) (рис.5). Звідси розраховано кінетичну складність РНК, яка передається довжиною (або масою) всіх різновидностей РНК, взятих по одній. Вона становить 3,0х108 та 4,8х108 нуклеотидів для ядерної РНК із печінки щурів відповідно після ЧГЕ і ЛАП. За характером змін отримані результати
збігаються з даними гібридизації унікальних послідовностей ДНК з загальною клітинною, полі(А)-ядерною і ново-утвореною РНК (фракція 63С) із регенеруючої печінки щурів [Grady et al., 1979; 1981; Прима и др., 1982], а також корелюють з вищенаведеними даними про синтез і внутрішньоклітинний розподіл новоутвореної РНК. Зниження кінетичної складності загальної РНК та її фракцій, затримка новоутвореної РНК в ядрі і зменшене її надходження до апарату трансляції, що
пере6удовується, свідчить про тимчасове часткове обмеження експресії геному і відповідно деяких функцій гепатоцитів, які, ймовірно, не є пріоритетними на цьому етапі регенераційного процесу. На подальших етапах кодуючі білок транскрипти не відрізняються за кінетичною складністю від транскриптів із печінки щурів після ЛАП, хоча дещо інші за якісним набором [Colbert et al., 1977; Krieg et al., 1979].
Послідовності ДНК із середньою і високою частотою повторення транскрибуються після ЧГЕ в більшій мірі, ніж після ЛАП (3,6% проти 2,6% через 3 год після кожної операції). Окрім відомих рибосомальних, транспортних і низькомолекулярних РНК транскрипти цих послідовностей ДНК остаточно не ідентифіковані. Деякі транскрипти послідовностей з високою частотою повторення входять до складу високомолекулярних РНК, як, наприклад, транскрипти В2 послідовностей в РНКР4502Е1 і РНК основного комплексу гістосумісності [Крамеров, 1989].
Дані, які було отримано за допомогою методів електроно-мікроскопічної авторадіографії і гібридизації ДНК-РНК, свідчать про те, що в перехідний період регенераційного процесу відбуваються зміни на різних рівнях експресії геному. Тому постає закономірне питання про механізми і наслідки цих змін.
Експресія транскрипційних факторів c-Fos, c-Myc, ЯФГ-1 і високоспеціалізованого білка Р4502Е1
Для розв'язання питання про молекулярні механізми виявлених змін дослідження здійснювали в декількох напрямках. Зокрема, вивчали експресію транскрипційних факторів c-Fos, c-Myc, ЯФГ-1 і високоспеціалізованого білка Р4502Е1. Гени c-fos i c-myc належать до генів миттєвої відповіді, а також до генів, які самі регулюють свою експресію, тобто знаходяться на найвищім щаблі ієрархії регуляторних білків. Транскрипційний фактор ЯФГ-1 регулює численні тканиноспецифічні гени, зокрема, ген Р4502Е1. Експресія гену Р4502Е1 уособлює максимально спеціалізований фенотип печінки. При найменших ознаках дедиференціювання тканини експресія цього гену припиняється найпершою [Padgham et al., 1993].
Рис. 6. Гібридизаційний сигнал полі(А)+ цитоплазматичної РНК Р4502Е1.
Відносний вміст всіх досліджуваних індивідуальних РНК у складі полі(А)+ цитоплазматичної РНК змінюється під впливом ЧГЕ і ЛАП. За характером змін одночасно виявляються схожість і різниця між двома процесами. Частіше кількісно більш вираженими є зміни в регенеруючій печінці. Протягом перехідного періоду регенераційного процесу спостерігається миттєве (0 - 0,5 год після ЧГЕ) підвищення вмісту всіх досліджуваних транскриптів у складі полі(А)+ цито- плазматичної РНК і наступна реакція ( 0,5 - 3 год після ЧГЕ ), характерна для транскриптів кожного типу (рис. 6 - 8).
Етапність в експресії досліджуваних генів відповідає періодичності, яку спостерігали в синтезі і розподілі новоутвореної РНК. Підвищена експресія різних за характером дії транскрипційних факторів протягом миттєвої реакції розкриває механізм, що призводить до підвищення експресії геному (див. вище), зокрема самого транскрипційного фактору ЯФГ-1 [Flodby et al., 1993] і гену Р4502Е1 як одного з його мішеней.
| 
