|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
Межидов Султанбек Хумаідович
УДК 612.111:577.352 464:57.086.13:576.311.32
ПРОНИКНІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ ДО КРІОПРОТЕКТОРІВ
І СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІЙ СТАН
КОМПОНЕНТІВ ЇХ ЦИТОПЛАЗМИ НА
ЕТАПАХ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ
03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Харків -1999
Дисертація є рукописом
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і
кріомедицини Національної Академії наук України
Науковий консультант: Лауреат Державної премії України,
доктор біол. наук, професор Моісеєв
Віктор Олексійович, зав. відділом
кріобіофізики Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України
Офіційні опоненти:
1. Доктор фіз.-мат. наук, професор, зав. відділу молекулярної біофізики Фізико-технічного інституту НАН України Благой Юрій Павлович
- Доктор біол. наук, професор кафедри біофізики Київського національного університету ім. Тараса Шевченка Зима Валентин Леонідович.
- Академік Української академії аграрних наук, доктор біол. наук, професор, зав. відділу фізіології размноження та штучного осеменіння Харківського біотехнологічного центру Української академії аграрних наук Осташко Федір Іванович
Провідна організація:
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, м. Київ.
Захист відбудеться "__21__"_вересня____1999 р. в _12.00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України ( 310015, м. Харків, вул. Переяслівська, 23).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою:
310015, м. Харків, вул. Переяслівська, 23.
Автореферат розісланий "_25_"_ червня__1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої ради
доктор мед. наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Кріоконсервування біологічних об`єктів є дуже важливим для вирішення різних задач в галузі медицини, генетики, мікробіології, сільського господарства, промисловості ( Белоус, Грищенко, 1994; Бабийчук, 1990; Цуцаева, Гольцев, Попов и др., 1988; Meryman, 1966). Тому створення нових і удосконалення існуючих кріобіологічних технологій має велике значення. Для успішного вирішення цих задач необхідні знання про особливості дії тих фізико-хімічних чинників, які мають місце на етапах кріоконсервування біологічних об`єктів:
- вплив температури, складу зовнішньо- та внутрішньоклітинних розчинів на проникність клітин;
- зміна властивостей розчинів назовні і всередині клітини в залежності від їх складу при зміні температури;
- підвищення концентрацій електролітів і неелектролітів назовні та всередині клітини через виморожування води при фазовому переході "вода-лід" та їх вплив на всі компоненти клітини.
Вивченню проникності клітин до неелектролітів та електролітів присвячена достатня велика кількість експериментальних і теоретичних робіт (Трошин, 1956, 1985; Kadem i Кatchalsky, 1958; Stein, 1967; Костюк, 1986). Але до сьогодні багато її сторін залишаються неясними, і на разі існують мембранна теорія та сорбціонна гіпотеза (Трошин, 1985). Так, до цього часу не вивчено вплив концентрації внутрішньоклітинного білка на проникність мембран клітин. Крім того, коефіцієнт проникності еритроцитів до гліцерину, отриманий різними дослідниками, відрізняється більш ніж на порядок (3-40) 10-5 см/хв (Orskov, 1935; Stein, 1967; Mazur i Miller, 1976), що вказує на недоліки існуючих методів дослідження.
На разі існують поодинокі роботи, в котрих досліджена мікров`язкість цитоплазми еритроцитів та структурно-функціональний стан внутрішньоклітинних білків в залежності від температури і невеликих концентрацій різних речовин ( Моисеев, 1984; Грищенко, Межидов, Моисеев, Нардид, 1995; Цимбал, 1992; Грек, 1979; Стусь, Розанова, 1992). Але цих даних недостатньо для широких узагальнень.
Кінцевою метою таких досліджень є створення ефективних та економічних способів кріоконсервування різних біологічних об`єктів. Так, в медичній практиці широко використовують переливання крові та її компонентів при лікуванні різних захворювань. Але існуючі методи кріоконсервування еритроцитів мають недоліки: трудомісткість, дороговизна, малі терміни зберігёання в ресуспендуючому середовищі після кріоконсервування та відмивання.
Необхідність виконання даної роботи, в наслідок її важливості, знайшла відображення в наукових програмах Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України:
1. Тема № 9, 2.2.6.9, шифр 2.28.3.1:2.28.3.2,
номер держреєстрації 01944005297.
“Вивчення впливу температури на структурний стан ізольованих та мембраннозв`язаних білків, в тому числі цитозолю та цитоскелету, на фізико-хімичні процеси в середовищі інкубації і на метаболізм в клітинах з метою вивчення кріорезистентності клітинних структур”.
2. Тема № 69, 2.2.6.69, шифр 2.28.3.1:2.28.3.2.
“Дослідження впливу температури на структурний стан мембрани і цитозолю, а також на проникність до електролітів та неелектролітів еритроцитів людини на різних стадіях розвитку і при деяких патологіях”.
Державного фонду фундаментальних досліджень:
1. Тема № 5/282, шифр "Іній"
"Дослідження проникності еритроцитів до електролітів та неелектролітів з метою визначення внеску до неї мембрани і фізико-хімічних властивостей поза- та внутрішньоклітинних середовищ ".
В зв`язку з вищевикладеним метою роботи було вивчення впливу різних фізико-хімічних чинників на структурно-функціональний стан компонентів цитоплазми еритроцитів та проникність їх мембран до кріопротекторів.
Для досягнення поставленої мети було необхідно вирішити такі задачі:
- вивчити проникність еритроцитів до кріопротекторів та вплив на неї температури, концентрації внутрішньоклітинного гемоглобіну;
- вивчити вплив температури, різних концентрацій натрію хлориду, калію хлориду, сахарози, глюкози, 1,2-пропандіолу, полівінілпіролідону-12600 на дифузію зонду ТЕМПОН в цитоплазмі еритроцитів ;
- вивчити вплив концентрації натрію хлориду, калію хлориду, сахарози на структурно-функціонаьний стан внутрішньоеритроцитарного гемоглобіну;
- вивчити вплив поєднання 1,2-пропандіолу з хлоридом натрію, а також переохолодження на збереження еритроцитів;
- вивчити вплив комбінацій високомолекулярних (полівінілпіролідон-12600, поліетиленоксид-1500, желатина, оксиетильований крохмаль-180000) та низькомолекулярних (сахароза, глюкоза, натрію хлорид, натрію гідроцитрат) речовин на збереження еритроцитів при кріоконсервуванні;
- теоретично обгрунтувати підхід до розробки економічних кріоконсервантів для кріоконсервування клітинних суспензій;
- створити спосіб кріоконсервування еритроцитів людини при температурі -196оС.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведені систематичні дослідження проникності мембран еритроцитів людини до різних кріопротекторів при температурах 0-10оС. Визначені коефіцієнти проникності та енергія активації процесу їх проникання. Показано, що низка, котру утворюють кріопротектори за величиною коефіцієнту проникності до еритроцитів людини не повністю корелює з низкою, в якій їх послідовність визначається їх розмірами, ліотропними та діелектричними властивостями, а також кількістю зв`язаної з ними води.
Вперше показано, що концентрація внутрішньоклітинного білка впливає на коефіцієнт розподілу кріопротекторів між еритроцитами та оточуючим їх середовищем, а також на швидкість проникання гліцерину.
Досліджено стан хромофорної групи внутрішньоеритроцитарного гемоглобіну в гіпертонічних розчинах сахарози, натрію і калію хлориду. Встановлено, що в гіпертонічних розчинах натрію та калію хлориду відбувається зміна співвідношення форм внутрішньоклітинного гемоглобіну (окси-, дезокси- та метгемоглобін), що свідчить про зміну його конформації.
Вперше показано, що при пошкодженні еритроцитів в гіпертонічних розчинах натрію та калію хлориду в першу чергу зменшується кількість клітин, що містять більшу кількість оксигемоглобіну, в той час як кількість клітин, що містять більше метгемоглобіну, збільшується.
Досліджено вплив різних концентрацій натрію хлориду на перші похідні спектрів поглинання (ППСП) глобулярної частини внутрішньоклітинного гемоглобіну та вперше показано, що в гіпертонічних розчинах з`являється додатковий негативний максимум на ППСП гемоглобіну, що вказує на зміну його конформації.
Встановлено, що відхилення від лінійного характеру залежності часу кореляції обертальної дифузії (ЧКОД) спинового зонду ТЕМПОН в цитоплазмі еритроцитів від концентрації позаклітинної речовини пов`язано з виходом з еритроцитів основної маси вільної води.
Показано, що кількість ушкоджених еритроцитів не корелює з величиною переохолодження суспензії клітин при наступній кристалізації. Причинами різниці в їх збереженні в цих умовах є як стискання, так і деформації зсуву, які розвиваються у вузьких каналах між кристаламі льоду, в котрі витісняються еритроцити при виморожуванні води у лід.
Вперше теоретично показано, що збільшення концентрації кріопротектора в кріоконсерванті дозволяє зменшити його кількість, котра необхідна для кріоконсервування клітинних суспензій.
Виявлено, що в присутності еритроцитів, починаючи з певної їх концентрації, відбувається збільшення екстинції хромофорної групи позаклітинного метгемоглобіну. Показано, що збільшення концентрації клітин і натрію хлориду призводить до подальшого збільшення екстинції позаклітинного метгемоглобіну, в той час, як кріопротектори її зменшують, починаючи з певної їх концентрації. Окрім того, встановлено, що в присутності еритроцитів зникає смуга поглинання метгемоглобіну в діапазоні довжин хвиль смуги Соре, хоча концентрація еритроцитів зменшена так, що екстинція метгемоглобіну відповідає його значенню в надосаді без еритроцитів.
Вивчено вплив поєднання різних високо- та низькомолекулярних кріопротекторів на збереження еритроцитів. Встановлено, що поєднання високо- та низькомолекулярних кріопротекторів дозволяє зменшити концентрацію низькомолекулярного кріопротектора, збільшити діапазон швидкостей заморожування, при яких збереження клітин залишається високою. Крім того, це поліпшує результати кріоконсервування еритроцитів при помірно низьких температурах.
Встановлено, що 1,2-пропандіол та етиленгліколь при концентраціях вищих 20% чинять на еритроцити токсичну дію, котра сприяє посиленню ушкодження еритроцитів в розчині натрію хлориду з концентрацією 3,2 моль/л (LD50).
Практичне значення одержаних результатів. Показано, що збільшення концентрації кріопротектора у складі кріоконсерванту дозволяє створити економічні, менш трудомісткі способи кріоконсервування клітинних суспензій. Створені економічні, ефективні і менш трудомісткі способи кріоконсервування еритроцитів людини при -196 оС та -85 ÷ -90 оС.
Показано, що еритроцити при ресуспензії (після центрифугування) в тому ж гіпертонічному розчині, в якому вони знаходились перед центрифугуванням, руйнуються, починаючи з концентрації натрію хлориду 0,6 моль/л.
Запропоновано простий спосіб ініціації кристалізації в контейнері для запобігання переохолодження суспензії клітин при кріоконсервуванні, що дозволяє зменшити кількість ушкоджених клітин і отримати їх високе морфо-функціональне збереження.
Знайдене явище збільшення екстинції хромофорної групи позаклітинного метгемоглобіну в присутності еритроцитів використано для вивчення впливу різних речовин на мембрану еритроциту.
Запропоновані методи дослідження проникності та дегідратації, а також інші методичні підходи можуть бути використані для дослідження і кріоконсервування інших біологічних об`єктів.
Особистий внесок здобувача. В роботах, що опубліковані у співавторстві, дисертантом запропоновані ідеї робіт, методи дослідження, готувались зразки. Здобувач приймав безпосередню участь в проведенні експериментів, особисто виконував статистичну обробку результатів, приймав участь в науковому обговоренні всіх результатів, формулював основний зміст висновків за допомогою наукового консультанта доктора біол. наук, професора Моісеєва В.О.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на Всесоюзній конференції "Магнитный резонанс в биол. и медиц." (Чорноголовка, 1989), на I з`їзді Білоруського товариства фотобіологів та біофізиків (Мінськ, 1994), на III з`їзді Українського товариства гематологів і трансфузіологів (Суми, 1995), на I з`їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995), на міжнародній конференції “Актуальные проблемы разработки и производства кровезаменителей и консервантов крови” (Минск 1994), на II з`їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998).
Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 21 стаття в наукових журналах, 9 тез і отримано 6 авторських свідотцтв та патентів.
Об`єм та структура роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, трьох глав, в яких викладені результати експериментальних досліджень, заключення, списку використаних джерел, списку скорочень. Матеріали викладені на 319 стор. Машинописного тексту і вміщують 47 рис., 40 табл.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Експерименти проведені на еритроцитах донорської крові людини 3-5 діб зберігання при 4 оС. Еритроцити використовували після 3-кратного відмивання фізіологічним розчином натрію хлориду, виготовленим на 5 ммоль/л натрій-фосфатному буфері з рН = 7,3±0,2. В залежності від мети дослідження еритроцити центрифугували на центрифузі Опн-3 при 1500-3000 об/хв, або ЦСЛ-3 при 1500-2400 об/хв.
Червоні тіні еритроцитів одержували за методом, запропонованим раніше (Whittam, Ager, 1964). Всі використані в роботі препарати були марки ЧДА або ХЧ. Реактиви, що не відповідали цим вимогам, очищали перекристалізацією або перегонкою. Зонд 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопіперидин-1-оксил (ТЕМПОН) синтезовано за відомою методикою та ідентифіковано різними методами. В якості парамагнітного розширювача використовували фероцианід калію (ФК) у фізіологічній концентрації 0,1 моль/л. Осмолярність розчинів визначали на осмометрі ОМКА 1Ц-01 (СРСР). За допомогою універсального йономера ЕВ-74 визначали рН.
Мікров`язкість цитоплазми еритроцитів і проникність їх мембран вивчали методом ЕПР спинового зонду (Межидов, Моисеев, 1987; Межидов, Нардид, Моисеев, 1995). Дослідження проведені на приладі ЕПР "Bruker ER-100D" (ФРН) із стандартною температурною приставкою. Розподіл речовин між клітинами та оточуючим їх середовищем вивчали методом 1Н-ЯМР на приладі ЯМР "Tesla BS 567A" з робочою частотою 100 Мгц. Дослідження гемоглобіну в еритроцитах, в тінях та в надосаді проводили на спектрофотометрі "SPECORD PAY UNICAM SP-8000" (Англія) або "SPECORD UV VIS" (ФРН). Розрахунок форм гемоглобіну проводили по відомій методиці (Розанова, Стусь, 1992).
HbO2 = 0,17А(577) - 0,13 А(569) - 0,015 А(500) (1)
Hb = -0,16 А(577) + 0,25 А(569) - 0,033 А(500) (2)
Hi = -0,02 А(577) - 0,04 А(569) + 0,13 А(500) (3),
де HbO2, Hb, Hi - окси-, дезоки- і метгемоглобін відповідно; А(577), А(569), А(500) - інтенсивності спектру гемоглобіну в відн. од. на довжинах хвиль 577,569,500 нм відповідно. За 0 прийнята опт.густ. зразка при 700 нм.
Кількість пошкоджених еритроцитів визначали по кількості гемоглобіну в надосаді, який визначали на колориметрі ФК-56М (СРСР). Заморожування зразків крові виконували на програмному заморожувачі УОП-8 (виробництво ІПКіК НАН України), або в спеціальному контейнері. Великі об`єми крові заморожували за методом, запропонованим раніше (Воротілін, 1987). Збереження морфо-функціональних властивостей еритроцитів після кріоконсервування оцінювали за збереженням форми клітин, нарощуваню гемолізу в ресуспендуючому середовищі після відмивання, утворенню монетних стовпчиків в плазмі крові.
Для дослідження проникності мембран та розподілу речовин еритромаса змішувалась з 20 та 30% розчинами кріопротекторів 1:1 у всіх віпадках. При дослідженні мікров`язкості цитоплазми еритроцитів, їх пошкодження в розчинах натрію хлориду і при його поєднанні з кріопротекторами співвідношення еритромаса:розчин було 1:20 та 1:50 відповідно. Розрахунок коефіцієнту проникності проводили за формулою, одержаною на підставі рівнянь нерівноважної термодинаміки (Гордиенко, 1994), з урахуванням особливостей нашого методу
 (4),
де gо = 0,5, α = 0,35, h∞ = hi при t = ∞, γ = S/Vo; h∞, hi - інтенсивності центральної компоненти ППСП ЕПР зонду ТЕМПОН при t = ∞ і у поточному
часі відповідно; площа поверхні еритроциту S = 109 мкм2, а об`єм V = 63 мкм3. Для порівняння розраховували Р також на підставі рівнянь дифузії Фіка.
Коефіцієнт розподілу (Q) визначали за формулою
Q=Iic/Iis:Iiw/Iis : Ioc/Ios:Iow/Ios (5),
де  ,  ,  - інтегральна інтенсивність спектру кріопротектора, стандарту та води в еритромасі відповідно;  ,  ,  - інтегральна інтенсивність спектру кріопротектора, стандарту та води в надосаді відповідно.
Розрахунок часу кореляції (τо(-1)) та несферичності (ε) обертальної дифузії зонду ТЕМПОН проводили за відомими формулами (Лихтенштейн, 1974; Кузнецов и др., 1975)
 (6),
де τо(-1) υ(-1) - час кореляції та частота обертальної дифузії спинового зонду відповідно, розраховані з використанням центральної (hо) та високопольної (h-1) компонент спектру ЕПР зонду, відн.од.; ΔНо - півширина hо, Гс.
  (7),
де h(+1) - інтенсивність низькопольної компоненти ППСП ЕПР.
Результати всіх експериментів піддавали статистичній обробці з урахуванням коефіцієнтів Стьюдента при надійній імовірності 95%.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив температури і концентрації внутрішньоклітинного
білка на проникність еритроцитів.
Нами досліджена проникність мембран еритроцитів до 1,2-ПД (1,2-пропандіолу), ДМСО (діметилсульфоксиду), ЕГ (етиленгліколю), ГЛ (гліцерину) при 0,5 та 10 оС, а до ГЛ ще й при 20 оС. З рис.1 видно, що кінетика проникання ЕГ, ДМСО, 1,2-ПД при 10оС реєструється достатньо добре. На підставі цих даних розраховані Р, енергії активації процесу їх проникання і час їх напівпроникнення(t1/2). Результати розрахунків Р подані в табл.1, з якої видно, що збільшення температури на 10 оС призводить до збільшення Р до 1,2-ПД, ДМСО, ЕГ, ГЛ в 7, 4, 1.8, 1.8 рази відповідно. Результати експериментів по
Рис. 1. Кінетика проникання кріопротекторів (20%) до еритроцитів
при 10оС: 1 - ЕГ, 2 - ДМСО, 3 - 1,2-ПД.
Таблиця 1. Залежність коефіцієнту проникності мембран еритроцитів
(Р⋅10-5 см/хв) від температури та виду кріопротектора (20%)
Гліцерин* - 30%.
визначенню Р до ГЛ при 20 оС співпадають з даними літеритури (3÷40)⋅10-5 см/хв (Mazur, Miller, 1976), а значення енергії активації 9,3 ккал/моль близька до значення, отриманого тими ж дослідниками (7,2 ккал/моль). Різниця в
Р до ГЛ обумовлена методикою розрахунку.Так, наші дані в 2,5 рази менші, ніж ті, що одержували раніше на підставі рівнянь дифузії Фіка.
Таким чином, за величиною Р мембран еритроцитів при температурі 10 оС кріопротектори можна розмістити у низку 1,2-ПД > ЕГ >ДМСО >ГЛ. Ця низка не узгоджується з низкою, котру вони утворюють за ліотропними, діелектричними властивостями, а також по розмірам їх молекул, кількості зв`язаної води і т.і. Отже, Р кріопротектора визначається комплексом всіх його фізико-хімічних властивостей.
Вплив концентрації внутрішньоклітинного гемоглобіну на проникність мембран вивчали на еритроцитах та їх червоних тінях. Кінетика проникання 20% ГЛ при 0 оС в червоні тіні еритроцитів подана на рис. 2. Видно, що процес проникання ГЛ завершується впродовж 4-5 хвилин, в той час, як для інтактних еритроцитів цей час більш, ніж 30 хвилин (Р = 0,67⋅10-5 см/хв). Для червоних тіней Р дорівнював 9,7⋅10-5 см/хв.
При підвищенні концентрації гемоглобіну шляхом дегідратації розчином натрію хлориду( NaCl ) 0,4 моль/л кінетика проникання ГЛ не реєструвалась (рис.2). Аналогічні експерименти на червоних тінях еритроцитів, як і з інтактними еритроцитами, з додаванням до них 0,4 моль/л NaCl показали, що кінетика проникання ГЛ спостерігається достатньо добре (рис.2). Видимо, причиною різкої зміни швидкості проникання ГЛ в еритроцити є зміна характеру взаємодії внутрішньоклітинного гемоглобіну з мембраною та цитоскелетними білками через зміни його концентрації .
Таким чином, зменшення концентрації гемоглобіну в еритроцитах призводить до збільшення Р до ГЛ більш, ніж в 10 разів в порівнянні з інтактними еритроцитами, а збільшення його концентрації - до різкого зменшення швидкості проникнення ГЛ.
В зв`язку з цим досліджено вплив концентрації внутрішньоклітинного білка на розподіл речовин між клітиною і оточуючим її середовищем. При проведенні досліджень до еритромаси 1:1 додавали розчини, що містили кріопротектор 30%, натрій-фосфатний буфер - 15 ммоль/л (рН 7,4), NaCl - 0,122 моль/л. Зразки утримували в термостаті при 37 оС до встановлення рівноваги в системі, центрифугували, відбирали надосад і записували спектри 1Н-ЯМР кріопротектора в надосаді і в еритромасі (або в суспензії). Еталоном слугував тетраметилсилан (ТМС), вміщений в тонкий капіляр. Час встановлення рівноваги між поза- та внутрішньоклітинним середовищами визначали
методом ЕПР.
На рис. 3 подані спектри 1Н-ЯМР ПЕГ-1500 та води в надосаді і в суспензії еритроцитів, з яких видно, що в надосаді ці спектри добре розв`язані і
не перекриваються, в той час як в суспензії еритроцитів має місце перекривання
Рис.2. Кінетика проникання 20%-гліцерину при 0оС: 1 - до червоних
тіней еритроцитів; 2 - до червоних тіней еритроцитів в присутності
0,4 моль/л NaCI; 3 - до еритроцитів в присутності 0,4 моль/л NaCI.
Рис. 3. Спектри 1Н-ЯМР ПЕГ-1500, води та ТМС в суспензії
еритроцитів (І) у надосаді (ІІ). 1- води, 2 - ПЕГ-1500, 3 - ТМС,
4 - інтеграл спектрів.
спектрів, яке є ще виразнішим в еритромасі. Аналогічно перекривались спектри в еритромасі і для ПЕГ-400. В зразках з червоними тінями еритроцитів спектри 1Н-ЯМР ПЕГ-400 і води були добре розв`язані і не перекривались. Аналогічний вигляд мали спектри в надосадах і в червоних тінях еритроцитів для інших кріопротекторів. З вищевикладеного витікає, що розширення спектрів води та кріопротекторів в цитоплазмі еритроцитів, видимо, зв`язано не тільки з гетерогенністю системи, але і з особливостями стану води та кріопротекторів в цитоплазмі клітини. Можливо, це пов`язано з високою мікро`язкістю внутрішньоклітинного середовища, що витікає з даних ЕПР.
В таблиці 2 подані результати проведених досліджень, з яких видно, що Q ГЛ, 1,2-ПД вірогідно не відрізняються від даних літератури (Зинченко, 1994), якщо урахувати, що вони розраховували на весь об`єм еритромаси, а ми - по відношенню до води в еритроцитах (для порівняння наші дані необхідно помножити на 0,6).
Значення Q для ПЕГ-1500 значно більше 1 для еритроцитів, в той час як для тіней - воно близьке до 1. Для ПЕГ-400 Q було 1,77±0,53 у випадку тіней для одного із донорів. Пояснити значення коефіцієнта розподілу, яке є біль-шим 1 для ПЕГ-1500, з точки зору наявності в еритроцитах низькомолекулярних компонентів не вдається, оскільки в клітинах знаходиться близько 50% від загальної маси кріопротектора. Крім того, слід відмітити, що вода, яка знаходиться в міжклітинному просторі займає біля 10% від загального об`єму еритромаси. Тому, якщо в клітинах не було б кріопротектора, то коефіцієнт розподілу був би в межах 0,1 - 0,2, позаяк кількість кріопротектора
в міжклітинному просторі розраховувалась би по відношенню до всієї води в еритромасі. Ці результати не вдається пояснити з погляду мембранної теорії.
Причинами таких змін коефіцієнту розподілу можуть бути адсорбція кріопротекторів внутрішньоклітинними компонентами, залежність їх розчинності від присутності у внутрішньоклітинному середовищі білка гемоглобіна.
Таблиця 2. Вплив концентрації внутрішньоклітинного гемоглобіну
еритроцитів на коефіцієнт розподілу різних кріопротекторів. Розчини містили: кріопротектор - 30%; натрій-фосфатний буфер - 15 ммоль/л; NaCl - 0,122 моль/л.
КП - кріопротектор;
* - дані літератури [Зинченко,1994];
** - дані літератури [Кирошка,1997].
| 
