|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА
ЯНЧІЙ Оксана Романівна
УДК 577.164.11:577.112
ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ТІАМІНЗВ'ЯЗУЮЧИХ БІЛКІВ МОЗКУ, ПЕЧІНКИ ТА НИРОК ЩУРІВ
03.00.04 – Біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник – доктор біологічних наук, член-кор. НАН України
ДОНЧЕНКО Георгій Вікторович,
завідувач відділу біохімії коферментів
Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
ВИНОГРАДОВА Руфіна Петрівна,
Інститут біохімії НАН України;
доктор біологічних наук, професор
КІБІРЄВ Володимир Костянтинович,
завідувач відділу хімії білка
Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.
Провідна установа – Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.
Захист відбудеться “20” вересня 2004 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розісланий “19” серпня 2004 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. На сьогоднішній день експериментально доведено, що ефективне функціонування вітамінів в організмі неможливе без участі специфічних вітамінзв'язуючих білків. Наявність подібних білків показана для більшості вітамінів, зокрема, ретинолу, α-токоферолу, холекальциферолу, піридоксину, фолієвої кислоти, кобаламіну, біотину, рибофлавіну, нікотинаміду, тіаміну та ін. [Халмурадов та ін., 1982]. Вітамінзв'язуючі білки необхідні на всьому шляху метаболізму вітамінів – від процесів всмоктування в шлунково-кишковому тракті до проявлення їх коферментних та некоферментних функцій. Сюди слід віднести білки, які транспортують вітаміни та коферменти, білки-ферменти, в результаті взаємодії з котрими проявляється коферментна дія вітамінів, а також мембранні і внутрішньоклітинні білки, що беруть участь в реалізації некоферментних функцій вітамінів та їхніх природних метаболітів в організмі людини і тварин [Донченко та ін., 1992]. Дослідження подібних білків є важливим та перспективним напрямком в сучасній біохімії вітамінів, оскільки вивчення структури, властивостей та функцій цих білків є одним з методологічних підходів до з'ясування молекулярних механізмів дії та біологічної ролі вітамінів у внутрішньоклітинному метаболізмі.
В аспекті розшифрування молекулярних процесів, що лежать в основі некоферментних функцій вітаміну В1 (тіаміну), велике значення має дослідження властивостей тіамінзв'язуючих білків ссавців (ТЗБ). Проте до цього часу відомості щодо структури і функціональної активності цих білків надзвичайно обмежені та фрагментарні. У відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України вперше ізольовано та частково досліджено властивості тіамінзв'язуючого білка мозку щурів [Постоєнко, 1987]. Звичайно, виникає питання, чи є подібні білки в інших тканинах, і якщо так, то яку роль вони відіграють в реалізації коферментних і некоферментних функцій тіаміну в організмі?
На сьогоднішній день, завдяки успіхам генетичних досліджень, достовірно з'ясовано, що саме вроджені дефекти у синтезі одного із білків, які зв'язують тіамін, а саме, тіамінтранспортуючого білка, є первинною причиною тіамінзалежної мегалобластичної анемії [Neufeld, 2001]. Це тільки одне із захворювань, пов'язаних з порушенням обміну тіаміну. Не виключено, що можуть відбуватися порушення функції тіамінтранспортуючого білка і не генетичного характеру. Все це настійно диктує необхідність дослідження структурних та функціональних властивостей тіамінзв'язуючих білків.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему дисертаційної роботи було затверджено на засіданні вченої ради Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, протокол №1 від 17.01.1997 р. Дисертаційна робота безпосередньо зв'язана з плановими дослідженнями відділу біохімії коферментів за бюджетними темами: "Дослідження механізмів реалізації біологічної дії вітамінів, коферментів та їх специфічних білків-акцепторів в регуляції метаболізму спеціалізованих клітин" (1997-2001), № ДР 0197U004372, шифр 2.2.1.4; "Дослідження молекулярних механізмів взаємодії вітамінів, коферментів та їх білків-акцепторів в регуляції внутрішньоклітинного метаболізму в нормі та патології" (2002-2006), № ДР 0102U000628, шифр 2.2.1.4; та темою Державного фонду фундаментальних досліджень Міністерства освіти і науки НАН України "З'ясування функціональної ролі специфічних білків-акцепторів вітамінів в клітинному метаболізмі" (2001-2003), Ф7/441-2001.
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було виділити, ідентифікувати та охарактеризувати властивості специфічних тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:
1) виділити гомогенні препарати тіамінзв'язуючих білків з мозку, печінки та нирок щурів;
2) визначити молекулярну масу, субодиничний та амінокислотний склад цих білків;
3) дослідити кінетичні параметри реакції взаємодії [14С]тіаміну з тіамінзв'язуючими білками печінки, нирок та мозку щурів;
4) з'ясувати, чи властиві тіамінзв'язуючим білкам печінки та нирок ферментативні властивості, які характерні для тіамінзв'язуючого білка мозку;
5) встановити субклітинну локалізацію тіамінзв'язуючих білків в досліджуваних тканинах щурів.
Об'єкт дослідження. Тіамінзв'язуючі білки, які виділені з печінки, нирок та мозку щурів.
Предмет дослідження. Фізико-хімічні властивості та біологічна роль тіамінзв'язуючих білків печінки, нирок і мозку щурів.
Методи дослідження. У роботі застосовані методи білкової хімії, електрофоретичний та амінокислотний аналіз. Ферментативну активність визначали спектрофотометрично. Зв'язування білків з тіаміном досліджували радіолігандним методом. Для обчислення отриманих результатів застосовували методи статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виділені та охарактеризовані тіамінзв'язуючі білки з печінки та нирок щурів. Проведено подальше дослідження виявленого раніше тіамінзв'язуючого білка мозку щурів та порівняння його властивостей і функцій з вперше виділеними білками печінки та нирок.
З'ясовано, що всі досліджувані тіамінзв'язуючі білки однакові за молекулярною масою, яка дорівнює близько 100 кДа, містять у своєму складі дві субодиниці – більшу, з молекулярною масою 63 кДа і меншу – 35 кДа. Показано, що тіамінзв'язуючі білки мозку, печінки та нирок подібні за амінокислотним складом.
Встановлено, що тіамінзв'язуючі білки специфічно взаємодіють з тіаміном, мають дві тіамінзв'язуючі ділянки з більш високою та низькою спорідненістю до тіаміну.
Доведена участь білків в обміні тіамінфосфатів. Вони з різною швидкістю гідролізують фосфорні ефіри тіаміну (тіамінмоно-, тіамінди- та тіамінтрифосфат), а найбільш активно – тіамінтрифосфат. Показано, що тіамінзв'язуючі білки не гідролізують нуклеозидтрифосфати (ATP, GTP, CTP) та не мають тіамінкіназної активності.
З'ясовано, що тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок локалізовані переважно у плазматичній мембрані клітин, а мозку – у синаптичних везикулах та плазматичних мембранах синаптосом.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поглиблюють уявлення про білки, які специфічно зв'язують вітаміни, зокрема тіамінзв'язуючі білки. Нові дані щодо універсального розповсюдження в плазматичній мембрані клітин високомолекулярного біфункціонального тіамінзв'язуючого білка підводять методологічну базу до розуміння молекулярних механізмів реалізації некоферментних функцій вітаміну В1 у клітинах різних тканин.
Метод отримання гомогенних препаратів тіамінзв'язуючих білків є основою для подальшого дослідження первинної структури цього білка з метою ідентифікації його на генетичному рівні та дає перспективу розробки імунохімічної тест-системи для моніторингу стану ТЗБ в тканинах при різних патологіях, зокрема спадкових, пов'язаних з дефектами синтезу тіамінзв'язуючих білків.
Окремі положення роботи ввійшли до курсу лекцій з біохімії вітамінів, що читаються на кафедрі біотехнології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та на кафедрі біології природничого факультету Національного університету "Києво-Могилянська академія".
Особистий внесок здобувача. Вся експериментальна частина роботи, підбір та опрацювання літератури виконані безпосередньо автором. Аналіз отриманих даних та їхнє обговорення проведено спільно з науковим керівником член-кор. НАН України Донченком Г.В. та д.б.н. Пархоменко Ю.М. Друковані роботи підготовлено за безпосередньої участі автора.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на конкурсі молодих вчених (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2000 р.), міжнародній науковій конференції “Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза” (Гродно, 2000 р.), 5й конференції молодих вчених “Биология – наука 21го века” (Пущино, 2001 р.), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002 р.). Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях відділу біохімії коферментів та науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 3 статті в періодичних наукових спеціалізованих виданнях України, що включено в перелік, затверджений ВАК України, та 5 тез доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури (2 розділи), експериментальної частини (4 розділи), узагальнення, висновків та списку використаних літературних джерел (200 найменувань). Робота викладена на 134 сторінках друкованого тексту та містить 34 рисунки і 9 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури висвітлені сучасні дані щодо властивостей, функціонального значення тіаміну і його похідних, а також механізмів транспорту тіаміну. Детально представлено інформацію про структуру, властивості та роль тіамінзв'язуючих білків мікроорганізмів, рослин і тварин.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для експериментальних досліджень використано щурів лінії Вiстаp, масою 150–200 г. Тварин утримували на звичайному pацiонi віварію. Всі процедури з тваринами проводили згідно з міжнародними правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.
Методи виділення і очищення тіамінзв'язуючих білків. В дослідах використовували мозок, печінку та нирки щурів, які гомогенізували в 5 мМ трис-НCl буфері, pH 7,4, що містив 0,25 М сахарозу, після чого центрифугували при 1000 g протягом 10 хв. Супернатант центрифугували 90 хв. при 100000 g, отриманий осад обробляли охолодженим до -10°С ацетоном. Ацетоновий порошок екстрагували в 10 мМ трис-НСl буфері, pH 7,4 і наносили на колонку з афінним сорбентом. Білки, що зв'язувались з сорбентом, елюювали, використовуючи сходинковий сольовий градієнт: 1 М NaCl, 2 М та 4 М сечовину [Постоєнко, 1987]. Від солей білки звільняли гель-фiльтpацiєю на колонці з сефадексом G-25 та діалізом, після чого лiофiлiзували. Додаткову очистку проводили на колонці з сефадексом G-150. Всі операції здійснювали при температурі 0–4°С з обов'язковим додаванням в буфер інгібітору протеаз – фенілметилсульфонілфториду.
Синтез афінного сорбенту. Афінний сорбент, тіамін-N-4-азобензоїл-ε-амінокапроїлгідразидосефарозу 4В, синтезовано в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України за методом Кляшицького [1980]. Для синтезу сорбенту використовували гідразид N-4-амінобензоїл-ε-амінокапронової кислоти, який приєднували до BrCN-активованої сефарози 4В в оцтовій кислоті. Гідразид N-4-амінобензоїл-ε-амінокапронової кислоти одержаний шляхом взаємодії метилового ефіру N-4-нітробензоїл-ε-амінокапронової кислоти з гідразингідратом.
Метод вивчення зв'язування [14С]тіаміну з тіамінзв'язуючими білками. Взаємодію тіаміну з ТЗБ досліджували радіолігандним методом [Cuatrecasas, 1972]. Визначення тіамінзв'язуючої здатності (ТЗЗ) проводили з використанням [тіазол-214C]тіаміну в 0,05 М бікарбонатному буфері Кребс-Рінгера, рН 7,4. Ліганд, що не зв'язався, відділяли фільтрацією на мембранних фільтрах Whatman GF/C з діаметром пор 0,45 мкм, після введення в інкубаційне середовище 0,1% γ-глобуліну G та 25% полiетиленглiколя. Радіоактивність вимірювали на рідинному сцинтиляційному лічильнику SL-20 "Intertechnique" (Франція). Специфічне зв'язування визначали за різницею між загальним зв'язуванням (інкубація лише з міченим тіаміном) і неспецифічним (в присутності 100-кpатного надлишку неміченого тіаміну). ТЗЗ виражали кількістю нмоль тіаміну, зв'язаного 1 мг білка.
Визначення молекулярної маси тіамінзв'язуючих білків. Молекулярну масу ТЗБ визначали двома методами – гель-фільтрацією на колонці з сефадексом G-150 та електрофорезом в ПААГ. В першому випадку для побудови калібрувального графіка залежності логарифму молекулярної маси від об'єму виходу стандартних білків були використані білки-маркери: гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа м'язів кролика (144 кДа), гексокіназа дріжджів (100 кДа), альбумін сироватки людини (68 кДа), овальбумін (45 кДа), соєвий інгібітор трипсину (20 кДа), цитохром с (13 кДа). Електрофорез в 10% ПААГ з DS-Nа проводили за методом Laemmli [1970]. Як маркери використовували суміш білків ("Sigma", USA) з молекулярною масою: міозин – 205 кДа, β-галактозидаза – 116 кДа, фосфорилаза В – 97,4 кДа, альбумін сироватки бика – 66 кДа, овальбумін – 45 кДа, карбоангідраза – 29 кДа. Для розрахунку молекулярної маси ТЗБ будували калібрувальні графіки залежності логарифму молекулярної маси білків-маркерів від їх електрофоретичної рухливості.
Амінокислотний аналіз тіамінзв'язуючих білків. Амінокислотний склад гідролізатів ТЗБ визначали в лабораторії хроматографії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України на автоматичному амінокислотному аналізаторі Т 339 "Mikrotechna" (Чехія).
Методи визначення ферментативних активностей. Тіамінтрифосфатазну активність визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 630 нм за накопиченням Pi після інкубації тіамінтрифосфату (ТТФ) з тіамінзв'язуючим білком [Chan, 1986]. Інкубаційна суміш містила: 50 мМ тpис-НСl буфер (рН 7,4), 5 мМ МgCl2, 0,15 мМ ТТФ, кількість ТЗБ в пробі 10-50 мкг. Ферментативну активність виражали в нмолях Pi за 1 хв. у перерахунку на 1 мг білка.
При дослідженні впливу рН середовища на ТТФ-азну активність білків використовували 50 мМ трис-малеат-NaOH буфер, (рН 5,2-8,6) і 50 мМ трис-НСl буфер (рН 7,4 та 9,0).
ТТФ-азну активність визначали також за концентрацією утвореного в реакції тіаміндифосфату [Чернікевич, 1990]. Інкубаційна суміш містила: 50 мМ трис-НCl буфер, pН 7,4, 10 мМ МgCl2, 10-4 М ТТФ. Кількість тіаміндифосфату визначали ферментативним методом. Для цього відбирали аліквоти, які інкубували з апопіруватдекарбоксилазою 30 хв. при 25ºС, далі вносили 0,2 М піровинограднокислий натрій та алкогольдегідрогеназу. Реакцію запускали 0,5 М NADH і вимірювали зміни оптичної густини розчину у перші три хвилини при довжині хвилі 340 нм. Кількість тіаміндифосфату розраховували за калібрувальним графіком, який будували, використовуючи певні концентрації хроматографічно чистого тіаміндифосфату.
Тіаміндифосфатазну, тіамінмонофосфатазну та нуклеотидтрифосфатазні активності визначали за накопиченням неорганічного фосфору [Chan, 1986].
Синтез тіамінтрифосфату. Тіамінтрифосфат синтезували, нагріваючи суміш тіамінгідрохлориду з фосфорним ангідридом в ортофосфорній кислоті [Penttinen, 1979]. Очистку ТТФ проводили на катіонообмінній колонці Dоwex 50-W Х.8, в Н+ формі [Пархоменко, 1982] та на сефадексі G-10.
Електрофорез на ацетат-целюлозі. Електрофорез фосфорних ефірів тіаміну на ацетат-целюлозі проводили в електрофоретичній камері з 0,025 М лимоннокислим буфером рН 3,8 дві години при 500 V [Пархоменко, 1979]. Хроматограми висушували і проявляли окислюючою сумішшю, що складалася з 5 частин 10% NaOH, 5 частин 55% етанолу, 1 частини 2,5% К3Fe(CN)6. В цих умовах всі ефіри перетворюються в тіохром. Флюоресценцію визначали в ультрафіолетовому спектрі.
Методи виділення субклітинних структур. Ядра та мітохондрії виділяли методом диференційного центрифугування [Widnell, Tata, 1964; Johnson, Lardy, 1967], мікросомальні фракції методом [Schenkman, Cinti, 1978], синаптосоми – [Abita, 1977], плазматичні мембрани та мембрани ендоплазматичного ретикулуму – [Давидова, 1968]. Контроль чистоти субклітинних фракцій здійснювали за активністю маркерних ферментів та електронною мікроскопією.
Кількісне визначення білка. Концентрацію білка визначали за методом Bradford [1976], Lowry [1951] та спектрофотометрично при 280 нм.
Математична обробка даних експериментів. Математичну обробку та аналіз отриманих результатів проводили використовуючи комп'ютерні програми Origin 5.1, Sigma Plot V 1.0 та Excel 2000 з урахуванням критерію Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
ВИДІЛЕННЯ, ОЧИСТКА ТА ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТІАМІНЗВ'ЯЗУЮЧИХ БІЛКІВ РІЗНИХ ОРГАНІВ ЩУРІВ
Для з'ясування наявності тіамінзв'язуючих білків в печінці та нирках щурів ми визначали розподіл специфічної тіамінзв'язуючої здатності в субклітинних фракціях, виділених з цих тканин.
В субклітинних структурах обох органів виявлено значну тіамінзв'язуючу здатність (рис. 1). Найвища ТЗЗ зафіксована для мікросомальної фракції, значно нижча – для мітохондріальної, та слабо виражена – для ядерної і цитоплазматичної фракцій.
Таким чином, експериментальні дані засвідчують, що в умовах in vitro саме мікросомальні фракції найбільш активно зв'язують [14С]тіамін, що вказує на присутність та ймовірну локалізацію в цих клітинних структурах тіамінзв'язуючих білків. Тому наступне завдання нашої роботи полягало у виділенні та очищенні цих білків.
Для виділення тіамінзв'язуючих білків з тканин печінки, нирок та мозку щурів застосовано афінну хроматографію. З білкових екстрактів кожного органу отримано по чотири основних білкових фракцій. На рис. 2, А як приклад показано профіль елюції з афінної колонки білкових екстрактів з печінки щурів. Перший пік – це баластні білки,
Рис. 1. Специфічне зв'язування [14С]тіаміну
з субклітинними фракціями, одержаними з
печінки (a) та нирок (b) щурів (М±m, n=5):
1 – гомогенат;
2 – ядра;
3 – мітохондрії;
4 – мікросомальна фракція;
5 – цитозоль.
які зв'язуються з афінним сорбентом внаслідок неспецифічної взаємодії, оскільки в цій білковій фракції не виявлено ТЗЗ, і десорбуються вихідним буфером. Тіамінзв'язуюча здатність всіх трьох досліджуваних органів властива лише другому білковому піку (2), який елюювали 1 М NaCl, тому подальші дослідження проводили з цією білковою фракцією. Методом електрофорезу в ПААГ з DS–Na у цій фракції виявлені низькомолекулярні домішки, для видалення котрих був застосований додатковий етап очистки – гель-фільтрація на сефадексі G–150 (рис. 2, Б). Від солей білки звільняли хроматографією на сефадексі G–25 та діалізом, після чого їх ліофілізували.
Рис. 2. А – профіль елюції білкового екстракту з печінки щурів з афінного сорбенту.
Умови елюції: 1– 10 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4; 2 – 1 М NaCl; 3 – 2 М сечовина; 4 – 4 М сечовина.
── профіль елюції білка, - - - тіамінзв'язуюча здатність білка.
Б – профіль елюції тіамінзв'язуючого білка печінки щурів з колонки Sephadex G–150.
Завдяки використаним методичним підходам ми отримали препарати тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів з тіамінзв'язуючою здатністю: 3,3 нмоль/мг білка, 2,5 нмоль/мг білка, 3,6 нмоль/мг білка, ступенем очистки – 702, 658, 679 разів, відповідно (табл. 1,2,3).
Вихід білків, розрахований за загальною тіамінзв'язуючою здатністю, становив 46,8% для ТЗБ мозку, 39,5% для ТЗБ печінки та 45,5% для ТЗБ нирок.
Таблиця 1
Очистка тіамінзв'язуючого білка мозку щурів
Таблиця 2
Очистка тіамінзв'язуючого білка печінки щурів
Таблиця 3
Очистка тіамінзв'язуючого білка нирок щурів
Слід зазначити, що аналогічні білкові препарати мікроорганізмів мали вищу тіамінзв'язуючу здатність (від 10,3 до 25,9 нмоль/мг білка), проте вихід білків та ступінь їх очистки був менший, хоча автори застосовували по 5-6 трудоємких етапів очистки [Халмуpадов, 1982]. Вищу тіамінзв'язуючу здатність у порівнянні з досліджуваними нами білками виявляв і ТЗБ, виділений з еритроцитів щурів – 13,7 нмоль/мг білка [Воскобоєв, 1987]. Ймовірно, всі ці відмінності обумовлені різницею у функціях даних білків.
Молекулярна маса ТЗБ мозку, печінки та нирок, визначена гель-фільтрацією на колонці з сефадексом G–150, була однаковою і дорівнювала ~100 кДа.
Згідно з даними електрофорезу, який проводили в 10% ПААГ в присутності DS–Na (рис. 3), досліджувані білки складаються з двох субодиниць. Молекулярну масу білків
Рис. 3. Електрофореграми тіамінзв'язуючих білків в 10% ПААГ в присутності DS-Na:
А,2, Б,1,В,2 – тіамінзв'язуючі білки мозку, печінки, нирок щурів;
А,1, Б,2, В,1 – білки-маркери.
| 
