|
НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ВИХОВАНЕЦЬ ВІКТОРІЯ ІВАНІВНА
УДК 577.121:591.543.42:636.92+599.23
ПОКАЗНИКИ ЕНЕРГЕТИЧНОГО ОБМІНУ В ОРГАНІЗМІ ТВАРИН ЗА УМОВ ШТУЧНОГО ГІПОБІОЗУ
03.00.04 – біохімія
А в т о р е ф е р а т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції Національного аграрного університету Кабінету Міністрів України
Науковий керівник - доктор біологічних наук, доцент
Мельничук Сергій Дмитрович,
Національний аграрний університет,
професор кафедри біохімії тварин,
якості і безпеки сільськогосподарської продукції,
проректор з навчальних та науково-виробничих
питань якості, стандартизації і сертифікації продукції АПК,
директор Української лабораторії
якості та безпеки продукції АПК
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Тугай Василь Андрійович,
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,
провідний науковий співробітник відділу біохімії м’язів
доктор біологічних наук, професор
Войціцький Володимир Михайлович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
професор кафедри біохімії
Провідна установа - Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця,
кафедра біологічної, біоорганічної та фармацевтичної хімії
Міністерство охорони здоров’я України, м. Київ
Захист відбудеться “ 26 ” ___жовтня___ 2005 р. о __10__годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус №3, ауд. 65
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус №4, кімн. 41
Автореферат розісланий “_21_” ___вересня____ 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Калінін І.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За несприятливих умов навколишнього середовища більшість живих організмів виробили механізми пристосування до них. Мікроорганізми утворюють цисти, комахи впадають у стан діапаузи, а деякі види тварин, наприклад ховрахи, впадають у сплячку. Під час зимового періоду гібернуючі тварини, пристосовуючись до змін оточуючого середовища, легко переносять значні зниження температури та концентрації кисню в навколишньому середовищі (П.Ю. Шмидт, 1948; Н.И. Калабухов, 1956; Г.Ф. Жегунов, 1995).
Перспектива створення стану зниженої життєдіяльності з метою його використання манила науковців. Біологи почали розробляти методи введення тварин у стан штучного гіпобіозу (Н.Н. Тимофеев, 1983; Ю.С. Алюхин, 1998; В.И. Загнойко, 1998). Однією з основних проблем у цьому сенсі є розроблення методів введення теплокровних тварин у стан штучного гіпобіозу, який за біологічним статусом подібний до зимової сплячки. Наукові дослідження показали, що у стані гіпобіозу тварини без шкоди для власного здоров’я переносять радіоактивне опромінення, підвищені дози отрут, не гинуть і не хворіють від штучного зараження мікробами, вірусами та ін. (П.Ю. Шмидт, 1948, Н.И. Калабухов, 1956), а також значно краще переносять складні оперативні втручання в організм порівняно із загальною анестезією (С.Д. Мельничук, 1998, 2001). Це показує на більш високий рівень адаптаційно – компенсаторних можливостей організму при такому варіанті існування живої матерії.
Існують різні уявлення про чинники, які переводять організм у стан штучного гіпобіозу. У проблемній науковій лабораторії “Біохімії гіпобіозу тварин” Національного аграрного університету перевагу надають вуглекислоті, як фактору, який забезпечує регуляцію стану штучного гіпобіозу (Мельничук Д.О., 1974, 2000). Характерним для цього стану є зниження частоти пульсу і дихання, температури тіла, втрата рефлексів рухомості та реакції на больовий подразник (Е.В. Майстрах, 1971; С.Д. Мельничук, 1995, 2001).
На даний час одержано багаточисельні дані, які характеризують біохімічні показники стану штучного гіпобіозу. У якості дослідних тварин було вибрано класично щурів, а також нову модель - кролів. Відомо, що метаболізм кролів у деяких аспектах відрізняється від метаболізму щурів і є більш схожим на процеси обміну у людини (Косенко Е.А., 1983). Тому з метою подальшого впровадження в практику стану штучного гіпобіозу, у тому числі як засобу знеболення, співробітниками кафедри за участю автора і була розроблена нова модель введення теплокровної тварини – кроля в стан штучного гіпобіозу. При цьому, біохімічні зміни, що відбуваються в організмі тварин потребували подальшого детального дослідження.
При вирішенні багатьох актуальних питань досліджень виникла необхідність визначення показників енергетичного обміну за умов штучного гіпобіозу. Обумовленість останнього визначається і тим, що даних, які накопиченні на сьогоднішній день є недостатньо для повної характеристики обмінних процесів, що відбуваються в організмі за умов штучного гіпобіозу. У зв’язку з цим з’явилась актуальність визначення вмісту аденілових нуклеотидів та їхнього співвідношення, креатинфосфату, неорганічного фосфору та циклічного аденозинмонофосфату, що дозволять розширити існуючі уявлення про особливості енергетичного обміну у щурів та кролів за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота є складовою частиною дослідження в рамках планової науково-дослідної теми: „Вивчення впливу різних форм вуглекислоти на розвиток стану штучного гіпобіозу та розробка технологій переведення організму тварин, тканин та клітин в стан штучного гіпобіозу” (№ державної реєстрації 0103U005378) і виконана в проблемній науковій лабораторії „Біохімії гіпобіозу тварин” на базі кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції Національного аграрного університету. Задана частина науково-дослідного завдання автором виконана в повному обсязі самостійно.
Мета і завдання дослідження. Мета дисертації полягала у дослідженні показників енергетичного обміну в крові та печінці теплокровних тварин (щурів та кролів) за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу.
Для досягнення мети були поставленні наступні завдання:
1. Дослідити показники енергетичного обміну в крові щурів у процесі входження, перебування і виходу тварин зі стану штучного гіпобіозу.
2. Вивчити вміст аденілових нуклеотидів, креатинфосфату, неорганічного фосфору, циклічного аденозинмонофосфату у печінці щурів за дії гіпобіотичних чинників.
3. Дослідити показники енергетичного обміну в стані гіпотермії та штучного гіпобіозу у крові кролів.
4. Вивчити вміст аденілових нуклеотидів, креатинфосфату, неорганічного фосфору в печінці кролів за умов гіпотермії та у стані штучного гіпобіозу.
Об’єкт дослідження: щури та кролі за умов штучного гіпобіозу, кров, печінка.
Предмет дослідження: показники енергетичного обміну у крові та печінці щурів та кролів, стан штучного гіпобіозу.
Методи дослідження: колориметричні, спектрофотометричні, імуноферменті, хроматографічні.
Наукова новизна одержаних результатів. Автором вперше отримано результати досліджень показників енергетичного обміну за умов штучного гіпобіозу (певні співвідношення концентрацій вуглекислоти та кисню при зниженній температурі середовища перебування) у теплокровних тварин на класичній моделі щурів і на новій моделі кролів.
Визначено показники енергетичного обміну у крові та печінці щурів у процесі входження, перебування і виходу тварин зі стану штучного гіпобіозу. Встановлено, що в крові та печінці щурів за умов гіпобіозу відбувається вірогідне зниження вмісту АТФ, цАМФ та суми аденілових нуклеотидів, підвищення вмісту АДФ та неорганічного фосфору, а при виході з цього стану вірогідне підвищення вмісту АТФ, цАМФ, суми аденілових нуклеотидів з досягненням через добу всіх досліджуваних показників рівня контрольних величин.
Досліджено показники енергетичного обміну в стані гіпотермії та штучного гіпобіозу у крові та печінці кролів. Виявлено, що за умов штучного гіпобіозу у крові кролів вірогідно знижується вміст АТФ, відношення АТФ/АДФ і показник аденілатного енергетичного заряду та підвищується вміст АДФ, АМФ, неорганічного фосфору та глюкози. У печінці кролів за умов штучного гіпобіозу вірогідно підвищується вміст АДФ і креатинфосфату.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дозволили істотно розширити існуючі уявлення про особливості енергетичного обміну в організмі тварин за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу. Стан штучного гіпобіозу є перспективною та зручною моделлю для дослідження адаптаційних можливостей організму. Застосування вуглекислого газу, як одного з факторів, що забезпечує переведення тварин в стан гіпобіозу має важливе значення для розуміння його ролі в регуляції процесів метаболізму. Показники енергетичного обміну в тканинах тварин за умов гіпобіозу можуть бути використані, як показники реакції організму на змінені умови зовнішнього середовища. Запропонована модель дає підстави для створення в майбутньому універсальних методик для досягнення стану штучного гіпобіозу у вищих тварин з метою впровадження в клінічну практику та для проведення оперативних втручань в організмі без використання медикаментів та полегшення реабілітації, а також в областях кріобіології та кріомедицини, для консервування клітин і тканин.
Одержані результати проведених досліджень можуть бути використані у навчальному процесі в закладах біологічного, медичного та ветеринарного профілів.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи особисто здійснений підбір та оброблення літературних даних, розроблена методологія досліджень, виконані експериментальні дослідження. Самостійно проведенні лабораторні дослідження біохімічних показників тканин крові та печінки тварин з вивченням показників енергетичного обміну за умов штучного гіпобіозу. Автором виконані розрахунки та статистична обробка даних, проведено аналіз одержаних результатів та формулювання основних положень і висновків. Програма наукових досліджень розроблена разом із науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи апробовані на: Міжнародній науково-практичній конференції: „Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної біохімії”, Тернопіль, 2004; Міжнародній науково-практичній конференції: „Ветеринарна медицина – 2004: сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів”, Феодосія, АР Крим, 2004; IX Міжнародній науково-практичній конференції: „Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин”, Київ, 2004; 2-й, 3-й та 4-й конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК, Київ, 2003, 2004, 2005.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт. З них 6 статей у наукових фахових виданнях та 2 тези доповідей на наукових конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 143 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 4 таблицями і 24 малюнками, складається із вступу, трьох розділів (огляду літератури; матеріалів та методів досліджень; результатів роботи та їх обговорення, аналізу й узагальнення результатів досліджень), висновків та списку використаної літератури. Список включає 244 джерела.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Для більш повного розкриття проблеми гіпобіозу в даному розділі наведена термінологія станів зниженої життєдіяльності; обговорено питання стосовно чинників, які призводять до розвитку стану гіпобіозу; описано біохімічні особливості за умов гіпобіозу з виділенням основного акценту показникам енергетичного обміну; показано зміни показників енергетичного метаболізму за дії окремо взятих факторів гіпотермії, гіперкапнії та гіпоксії.
Матеріали і методи досліджень. Для виконання поставлених задач було проведено дві серії досліджень при яких штучно створювали умови для переведення теплокровних тварин у стан гіпобіозу. Для дослідження були використані щурі та кролі, яким не властивий стан гіпобіозу.
Першу серію досліджень проведено на самцях білих щурів лінії Вістар з масою тіла 180 – 200 г. Тварин утримували за стандартним раціоном у віварії кафедри біохімії тварин якості і безпеки сільськогосподарської продукції Національного аграрного університету.
Тварин було поділено на 5 груп. Перша група – контрольна, в якій використовували інтактних тварин. Дослідні групи: друга – входження в гіпобіоз (0-1,5 год); третя – стан штучного гіпобіозу (0-3 год); четверта – вихід щурів зі стану гіпобіозу (3-3 год); п’ята – вихід тварин зі стану гіпобіозу (3-24 год).
Стан штучного гіпобіозу створювали за методикою Бахметьєва-Джайя-Анжуса, яка детально описана в роботах (Мельничука С.Д., 1995, 2001). Під час виконання дослідження тварин поміщали у герметично закриту камеру об’ємом 3 дм3 і перенесенням їх в гіпобіотичну камеру з температурою 3 – 4 0С. Протягом перебування тварин у камері за таких умов змінюється як температура, так і склад газового середовища: зростає вміст вуглекислоти та поступово зменшується рівень кисню (Мельничук С.Д., 1995). У тварин спостерігалося зниження температури тіла з 37 0С до 16 0С, зменшення частоти серцевих скорочень з 380 до 80 ударів за хвилину, тварини повністю втрачали рухомість, реакцію на больовий подразник та зникав рефлекс на положення, що свідчило про розвиток стану штучного гіпобіозу. Вихід тварин зі стану штучного гіпобіозу проходив самостійно при кімнатній температурі та звичайному складі повітря. Тварин в певний час декапітували. Для проведення біохімічного аналізу відбирали проби крові та печінки.
Другу серію досліджень проведено на кролях самцях віком 4 місяці масою тіла 2,5-3 кг, яких утримували у віварії Національного аграрного університету. Тварини були поділені на три групи: контрольна та дві дослідні.
В якості контрольних слугували інтактні тварини - перша група. Тварин другої (дослідної) групи охолоджували у гіпобіотичній камері ГК-01, спеціально розробленої для цих цілей при температурі 2 – 4 0С протягом 3-х годин. При цьому суттєвих змін фізіологічних показників виявлено не було. У тварин третьої (дослідної) групи стан штучного гіпобіозу викликали поміщаючи їх у гіпобіотичну камеру ГК-01 при температурі 2 - 40С і подачею газової суміші за допомогою змішувача газів 122СГ-01 з певним співвідношенням двоокису вуглецю та кисню протягом трьох годин. Про розвиток стану штучного гіпобіозу свідчило зниження температури тіла з 37 0С до 28 0С, частоти серцевих скорочень з 195 до 133 скорочень за хвилину, частоти дихальних рухів з 156 до 47 рухів за хвилину. За таких показників у тварин значно знижувалась рухомість та реакція на больовий подразник, що є характерно для стану штучного гіпобіозу. Відбір проб крові та печінки у дослідних тварин проводили через три години після початку досліду.
Визначення аденіннуклеотидів в еритроцитах крові проводили методом тонкошарової хроматографії за методикою Н.Б. Захарової та В.І. Рубіна (1980), у печінці – згідно методики І.В. Зарубіної та Б.І. Криворучко (1982). Після визначення концентрації кожної фракції аденіннуклеотидів проводили розрахунок суми аденілових нуклеотидів (АТФ + АДФ + АМФ); відношення АТФ/АДФ; показник аденілатного енергетичного заряду (ЄЗ) розраховували за формулою (Аткінсон Д.Є., 1968): ЄЗ = 1/2 * (2 (АТФ) + (АДФ))/ (АТФ) + (АДФ) + (АМФ).
Неорганічний фосфор у сироватці крові визначали фотометрично у складі комплексу фосфорномолібденової кислоти в ультрафіолетовому світлі. Вимірювання проводили на автоматичному аналізаторі MiсroLab-200 (Нідерланди). Неорганічний фосфор у печінці визначали за методикою М.Н. Кондрашової і співавт. (1965), креатинфосфат - за вмістом креатиніну згідно методики А.М. Алексєєвої (1950, 1956). Глюкозу досліджували в сироватці крові колориметрично глюкозоксидазним методом. Вміст 3´,5ґ-циклічного аденозинмонофосфату визначали за допомогою імуноферментного методу з використанням набору цАМФ “Biotrak Amersham Biosciences”, Англія.
Цифровий матеріал оброблено статистично за допомогою персонального комп’ютера в програмі МS Exсel. Вірогідність різниці середніх значень визначали за критерієм Стьюдента (td).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Дослідження показників енергетичного обміну у крові щурів за умов штучного гіпобіозу
За результатами дослідження вмісту аденілових нуклеотидів у крові щурів в умовах штучного гіпобіозу можна відзначити, що під час входження тварин у стан штучного гіпобіозу вміст АТФ має тенденцію до зниження, в стані гіпобіозу він вірогідно знижується на 18 %. На третю годину у процесі виходу зі стану гіпобіозу вміст АТФ має тенденцію до підвищення, а через 24 год знаходиться в межах цього показника у контрольної групи тварин (табл.1).
Вміст АДФ під час входження щурів у стан гіпобіозу має лише тенденцію до підвищення, у стані гіпобіозу спостерігається вірогідне зростання його вмісту на 18 %, через 3 год виходу зі стану гіпобіозу - збільшується на 19 %, через 24 год - стабілізується.
Вміст АМФ через 1,5 год перебування щурів в умовах гіпобіозу вірогідно зменшується на 28 %, а через 3 год з розвитком стану гіпобіозу збільшується на 15 %. Вихід тварин зі стану гіпобіозу супроводжується деяким зниженням вмісту АМФ, але не досягає рівня контрольної групи. Через 24 год даний показник стабілізується.
Відомо, що рівень вмісту АТФ та співвідношення компонентів аденілових нуклеотидів визначає характер, інтенсивність та шляхи ресинтезу АТФ і метаболізм організму в цілому. Тому необхідним є визначення співвідношення аденілових нуклеотидів.
Таблиця 1
Вміст аденіннуклеотидів в еритроцитах крові щурів за умов штучного гіпобіозу, мкмоль/л (М+m, n=5)
Тут і далі в таблицях і рисунках * дані достовірні відносно контролю, p ≤ 0,05 , ** p < 0,005
Сумарний вміст аденілових нуклеотидів під час входження щурів у стан гіпобіозу зменшується на 11 %. Розвиток стану гіпобіозу не супроводжується достовірною зміною сумарного вмісту аденілових нуклеотидів. На третю годину виходу тварин зі стану гіпобіозу даний показник вірогідно підвищується, а через 24 год спостерігається його стабілізація (рис. 1).
Показник аденілатного енергетичного заряду в період входження в гіпобіоз не змінюється, а за умов гіпобіозу вірогідно знижується. На 3 та 24 год виходу тварин зі стану гіпобіозу даний показник підвищується до рівня контрольних величин (рис. 2).
Аналізуючи дані вмісту аденіннуклеотидів та їх співвідношення слід відзначити, що період входження тварин у стан гіпобіозу супроводжується поступовим зниженням обмінних процесів, що співпадає із даними досліджень в роботі (Мельничук С.Д., 2001), тобто є характерним для такого стану тварин.
Відомо, що для збереження рівноваги у підтриманні постійного рівня АТФ у живих організмів вмикається система стабілізації енергетичного заряду, а саме при зниженні концентрації АТФ зростають відносні концентрації АДФ та АМФ. Підвищення вмісту АДФ та АМФ за таких умов дає можливість припустити, що дані сполуки можливо компенсують зниження АТФ за рахунок аденілаткіназної реакції.
Вихід щурів зі стану гіпобіозу настає поступово і вже навіть через 3 год відмічається відновлення функціональної діяльності тварин. Досить швидке підвищення рівня АТФ можливо пов’язане з підвищенням інтенсивності аеробного гліколізу. Стабілізація аденілатного енергетичного заряду свідчить про те, що досягається баланс між споживанням і витратою енергії.
Рис. 1. Сумарний вміст аденіннуклеотидів в Рис. 2. Показник аденілатного
еритроцитах крові щурів за умов енергетичного заряду
гіпобіозу, мкмоль/л, (М+m, n=5) в еритроцитах крові щурів
за умов гіпобіозу, (М+m, n=5)
Аналізуючи наявні дані з вмісту неорганічного фосфору (рис. 3) спостерігається тенденція до збільшення його вмісту через 1,5 год входження в гіпобіоз, у стані гіпобіозу – зростає в 2,5 рази. Вихід зі стану штучного гіпобіозу (3 год) супроводжується деяким зниженням вмісту неорганічного фосфору порівняно зі станом гіпобіозу, але є ще на досить високому рівні, порівняно з даними контрольної групи тварин, а саме більшим у 1,7 разів, а через 24 год стабілізується.
Рис. 3. Вміст неорганічного фосфору Рис. 4. Вміст глюкози в сироватці крові щурів
в сироватці крові щурів за умов за умов штучного гіпобіозу,
гіпобіозу, ммоль/л, (М+m, n=5) ммоль/л, (М+m, n=5)
Рівень глюкози в період входження щурів у стан гіпобіозу вірогідно знижується в 1,5 рази (рис. 4), з розвитком гіпобіозу підвищується в 3,2 рази. Відомо, що за умов штучного гіпобіозу спостерігається підвищення лактату (Мельничук С.Д., 2001), очевидно, дані зміни сприяють переходу обмінних процесів на низькоенергетичний рівень - посилюється анаеробний гліколіз. Через 3 год виходу тварин зі стану гіпобіозу рівень глюкози залишається ще достатньо високим, а саме вищим за контрольну величину в 2,5 рази. На 24-у годину цей показник стабілізується.
Результати дослідження вмісту цАМФ у плазмі крові щурів (рис. 5) свідчать, що за входження їх у стан штучного гіпобіозу значно (у 14,5 раза) зменшується вміст цАМФ, у стані гіпобіозу - в 3,1 рази. Через три години після виходу тварин зі стану штучного гіпобіозу спостерігається підвищення вмісту цАМФ у 1,7 раза, а через 24 год він стабілізується.
Рис. 5. Вміст цАМФ в плазмі крові
щурів в умовах досліду та контролю,
пмоль/мл, (M±m, n=5)
Дані результати дослідження вмісту цАМФ можуть вказувати на те, що вони відбулися під дією певного стимула. Цим стимулом можуть виступати гормони (адреналін, глюкагон). Адже відомо, що ці гормони активують аденілатциклазу, збільшують синтез цАМФ, активують фосфорилазу печінки, глікогеноліз і вихід глюкози із печінки в кров’яне русло. Останнє призводить до утворення великої кількості вільної глюкози. За науковими даними за умов штучного гіпобіозу настає пригнічення виходу катехоламінів у кров, таким чином, здійснюючи вплив на процеси обміну. Очевидно, під час виходу тварин зі стану гіпобіозу рівень катехоламінів підвищується, що активізує процеси енергетичного обміну.
Всі виявлені зазначені вище зміни за умов штучного гіпобіозу є наслідком адаптивного пристосування організму до змінених умов. Для його підтримання значну роль відіграє вуглекислота, яка має регуляторний вплив на процеси обміну в організмі тварин (Мельничук Д.О., 1974; Гулий М.Ф., 1978). Досліджено, що в стані штучного гіпобіозу настають зміни кислотно-лужного стану, що призводять до підвищення концентрації вуглекислоти в крові та посилення процесів карбоксилювання в тому числі АТФ-залежних, які можуть бути причиною того, що змінюється концентрація аденіннуклеотидів (Гулий М.Ф., 1978). Ймовірно, виявлені зміни вмісту аденілових нуклеотидів відбулися під дією вищевказаного регуляторного фактору – вуглекислоти, в поєднанні з гіпотермією. Під впливом даних механізмів регуляторного впливу (гіпотермії та гіперкапнії) обмінні процеси за умов штучного гіпобіозу підтримуються на низькоенергетичному рівні життєдіяльності таким чином зберігаючи постійність внутрішнього середовища.
Дослідження вмісту аденілових нуклеотидів, креатинфосфату, неорганічного фосфору, циклічного аденозинмонофосфату в печінці щурів за умов штучного гіпобіозу
У табл. 2 наведено результати дослідження вмісту аденілових нуклеотидів у печінці щурів за умов входження у стан штучного гіпобіозу, перебування та виходу тварин із нього. Згідно з цими даними під час входження щурів у стан гіпобіозу настає вірогідне зниження вмісту АТФ на 25 %, з розвитком такого стану він знижується на 29 %. Через три години виходу тварин зі стану гіпобіозу спостерігається зростання вмісту АТФ на 27 %, а через добу він залишається ще на досить підвищеному рівні, саме є збільшеним на 22 %. Вміст АДФ за умов входження щурів у стан гіпобіозу має лише тенденцію до зниження, а під час виходу з нього - до підвищення. Вміст АМФ під час входження тварин у стан гіпобіозу достовірно не змінюється, у стані гіпобіозу знижується на 42 %, вихід із цього стану не призводить до зміни його вмісту. Концентрація аденіннуклеотидів можливо змінюється внаслідок посилення процесів карбоксилювання за умов гіпобіозу (Мельничук Д.О., 2000).
Таблиця 2
Вміст аденіннуклеотидів та їх співвідношення в печінці щурів за умов штучного гіпобіозу, (М+m, n=5)
Для стану штучного гіпобіозу характерним є значне пригнічення обмінних процесів, яке відбувається не тільки на рівні цілого організму, але і на клітинному рівні. Відомо, що зниження інтенсивності дихання мітохондрій призводить до зниження концентрації АТФ у клітинах (Скулачев В.П., 1989). Підтримання гомеостатичного рівня АТФ у клітині здійснюється шляхом алостеричної регуляції швидкості окисного фосфорилювання в мітохондріях. Якщо швидкість витрати АТФ є вище максимальної швидкості ресинтеза АТФ, що відбувається у внутрішній мітохондріальній мембрані, то активізується анаеробний гліколіз. Проте гліколітичне фосфорилювання не може повною мірою компенсувати недостатність окисного фосфорилювання завдяки його низької ефективності (Скулачев В.П., 1989). Про посилення анаеробного гліколізу в умовах штучного гіпобіозу також може свідчити підвищений вміст лактату (Мельничук С.Д., 2001).
Щодо сумарного вмісту аденілових нуклеотидів, то у період входження щурів у стан штучного гіпобіозу у печінці спостерігається вірогідне зниження даного показника на 17 %, яке відбувається переважно за рахунок зниження вмісту АТФ. Із розвитком гіпобіозу сумарний вміст аденілових нуклеотидів продовжує знижуватись вже за рахунок зміни концентрації АТФ та АМФ і стає меншою на 23 %. Вихід щурів зі стану гіпобіозу супроводжується зростанням сумарного вмісту аденіннуклеотидів на 18 %, через добу він підтримується ще на досить високому рівні і є вищим на 13 % від таких показників у контрольних тварин переважно за рахунок підвищеного вмісту АТФ. При входженні та перебуванні тварин у стані гіпобіозу відношення АТФ/АДФ має тенденцію до зниження, а при виході - до підвищення. За цих умов показник аденілатного енергетичного заряду не змінюється.
Одержані результати можуть свідчити, що в період входження і перебування щурів у стані гіпобіозу у клітинах печінки створюється новий рівень стійкого стану систем фосфорилювання - дефосфорилювання аденіннуклеотидів. Тобто, система практично знаходиться у стаціонарному стані, але на більш низькому рівні ніж у активних тварин. Підтримання показника аденілатного енергетичного заряду на рівні контрольної групи свідчить про те, що у печінці відбувається достатній ресинтез макроергів, і цей процес проходить не за рахунок окисного фосфорилювання, який може забезпечити необхідну кількість АТФ, а за рахунок посилення гліколітичного шляху перетворення вуглеводів.
Вміст неорганічного фосфору в печінці щурів через 1,5 год перебування їх в умовах гіпобіозу достовірно не змінюється (рис.6), а з розвитком цього стану він збільшується на 49 %.
Рис. 6. Вміст неорганічного фосфору в Рис. 7. Вміст креатинфосфату в
печінці щурів за умов гіпобіозу, печінці щурів за умов гіпобіозу,
мкмоль/г тканини, (М+m, n=5) мкмоль/г тканини, (М+m, n=5)
Через 3 год виходу із стану гіпобіозу цей показник знижується на 11 %, а через 24 год починає повертатися до вихідного рівня. Очевидно, збільшення концентрації неорганічного фосфору за умови розвитку стану гіпобіозу пов’язано з дефосфорилюванням АТФ і вивільненням неорганічного фосфору, тоді як вихід тварин зі стану гіпобіозу, навпаки, супроводжується збільшенням потреби в неорганічному фосфорі для фосфорилювання АДФ з утворенням АТФ.
Концентрація креатинфосфату після 1,5 год перебування щурів за умов гіпобіозу має тенденцію до зниження (рис. 7), а у стані гіпобіозу достовірно знижується на 30 %. Через 3 та 24 год виходу тварин з цього стану вміст креатинфосфату достовірно не змінюється, хоча його рівень є дещо вищим відносно контрольної величини. Загальний характер змін креатинфосфату в печінці щурів аналогічний до зміни вмісту АТФ: зниження за умов гіпобіозу і підвищення в період виходу з цього стану.
Аналізуючи одержані результати щодо визначення вмісту цАМФ у печінці щурів, слід відзначити зменшення вмісту цАМФ у 1,2 раза через 1,5 год після входження щурів у стан штучного гіпобіозу (рис. 8). Очевидно, що це пов’язано з активацією ферменту фосфодіестерази цАМФ, який гідролізує цАМФ до АМФ. У печінці діестераза індукується інсуліном, який не перешкоджає дії адреналіну і глюкагону (Кольман Я., 2004). У стані штучного гіпобіозу спостерігається тенденція до підвищення вмісту цАМФ. Вихід щурів з гіпобіозу супроводжується зростанням вмісту цАМФ у 1,1 раза, а через 24 год він досягає рівня контрольної величини.
Можливо, що підвищений вміст цАМФ через три години після виходу тварин зі стану штучного гіпобіозу обумовлений зв’язуванням гормонів (адреналіну, глюкагону) з рецептором, активацією аденілатциклази та синтезу цАМФ із АТФ. Тим самим збільшений рівень цАМФ активує протеїнкіназу А, яка сприяє збільшенню швидкості фосфорилювання за використання АТФ і таким чином впливає на метаболізм і фізіологічні функції тварин.
Рис. 8. Вміст цАМФ в печінці щурів
за умов штучного гіпобіозу,
пмоль/г тканини, (M±m, n=5)
Показники енергетичного обміну за умов гіпотермії та у стані штучного гіпобіозу у крові кролів
У табл. 3 викладено результати дослідження вмісту аденіннуклеотидів у еритроцитах крові кролів за умов гіпотермії та штучного гіпобіозу. Згідно якої за умов гіпотермії вміст АТФ зменшується на 14 %, а за умов гіпобіозу - на 19 %. Можливо, що такі зміни пов’язані зі збільшеням витрат АТФ на підтримання функціонального стану еритроцита. При гіпотермії вміст АДФ суттєво не змінюється, а за умов гіпобіозу - зростає на 15 %. Концентрація АМФ при гіпотермії підвищується на 44 %, а за умов гіпобіозу на 62 %. Подібні зміни дають можливість зробити припущення, що ресинтез АТФ відбувається за допомогою аденілаткіназної реакції. Сумарний вміст аденілових нуклеотидів в еритроцитах крові кролів у стані гіпотермії та штучного гіпобіозу має тенденцію до збільшення.
Таблиця 3
Кількість еритроцитів, вміст аденіннуклеотидів у еритроцитах крові кролів за умов гіпотермії та штучного гіпобіозу, (М+m, n=5)
Відношення АТФ/АДФ у стані гіпотермії має тенденцію до зменшення, а за умов штучного гіпобіозу зменшується на 29 %, що свідчить про зменшення енергоємкості клітин та зниження рівня активності реакцій ресинтезу АТФ (рис. 9). Показник аденілатного енергетичного заряду за умов гіпотермії зменшується на 11 %, а за умов гіпобіозу на 16 % переважно за рахунок значного зниження концентрації АТФ (рис. 10).
Одержані результати свідчать про значне пригнічення обмінних процесів у кролів за умов дії гіпобіотичних чинників, порівняно з результатами для кролів, на яких діяли лише холодовим чинником. Зниження вмісту АТФ певно пов’язано зі збільшеною витратою АТФ, а не зі зменшенням його синтезу по анаеробному шляху перетворення. Такі цікаві зміни процесів обміну не призводять до загибелі тварин, а є лише адаптивною перебудовою метаболізму на інший рівень існування.
Рис. 9. Відношення АТФ/АДФ у Рис. 10. Показник аденілатного
еритроцитах крові кролів, (М+m, n=5) енергетичного заряду в еритроцитах
крові кролів, (М+m, n=5)
Дослідження вмісту неорганічного фосфору в сироватці крові кролів показує, що за умов гіпотермії його концентрація збільшується на 20 %, а за умов гіпобіозу на 40 %, порівняно з контрольною групою тварин (рис. 11). Очевидно, що значне збільшення концентрації неорганічного фосфору пов’язано з процесами дефосфорилювання АТФ, при якому вивільняється неорганічний фосфор і АДФ.
Вміст глюкози в сироватці крові кролів при гіпотермії збільшується на 35 % (рис.12), що є характерним при зниженні температури для різних видів тварин (Львова С.П., 1976). Підвищений рівень глюкози в стані гіпотермії показує на використання її в якості основного субстрата для підтримання терморегуляторної активності та інтенсивного перебігу анаеробних процесів.
Рис. 11. Вміст неорганічного фосфору в Рис. 12. Вміст глюкози в сироватці
сироватці крові кролів, ммоль/л, (М+m, n=5) крові кролів, ммоль/л, (М+m, n=5)
За умов штучного гіпобіозу вміст глюкози значно підвищився, на 63 %. Ймовірно, це пов’язано з посиленням процесу розпаду глікогену, в результаті якого відбувається значне збільшення вмісту глюкози у крові, як джерела підтримання енергетичних процесів організму. Зміна концентрації глюкози може знаходитись під впливом регуляторних механізмів, які переключають один метаболічний шлях на інший. Таке переключення можуть здійснювати гормони в залежності від фізіологічного стану організму і таким чином змінювати рівень глюкози.
Отримані результати свідчать, що вміст досліджуваних макроергічних сполук у еритроцитах крові кролів у стані гіпотермії та при штучному гіпобіозі є різним, що пов’язано з відмінністю адаптації тварин. Підвищений вміст вуглекислоти в крові регулює механізми метаболічної адаптації переходу і знаходження тварин у стані штучного гіпобіозу (Мельничук С.Д., 1995; Мельничук Д.О., 2000). Внаслідок цього вуглекислота безпосередньо пов’язана з процесами енергетичного обміну. За умов стану штучного гіпобіозу розвиваються захисні реакції організму, що потребують посилення функціональної активності всіх клітинних структур, які активують енергоспоживаючі процеси і знижують клітинні запаси макроергічних сполук.
| 
