|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
КОВАЛЕНКО EMMA ОЛЕКСАНДРІВНА
УДК 577.1+579.8
ПОЗАКЛІТИННІ ЛЕКТИНИ БАКТЕРІЙ РОДУ Bacillus
03.00.07 - мікробіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ – 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
Hауковий консультант: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, заслужений діяч науки України Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, заступник директора по науці, завідувач відділом фізіології промислових мікроорганізмів
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Луцик Максим Дмитрович, Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник
доктор біологічних наук, професор Руденко Ада Віктopівнa, Інcтитут урології тa нефрології АМН Укpaїни, зaвідувaч лабораторією мікробіології та вірусології
доктор біологічних наук, професор
Радавський Юрій Леонідович,
Інcтитут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,
зaвідувaч відділом структури та функції білків та пептидів
Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Захист відбудеться “ 26 ” травня 1999 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченоі ради Д 26.233.01 в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 252143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.
Автореферат розісланий “ 22 ” квітня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Останнім часом підвищений інтерес вчених ви-кликають вуглеводзв’язуючі білки – лектини, які відіграють провідну роль у процесах біологічного впізнавання, знаходяться в будь-якій біологічній системі та мають широкий спектр біологічної активності. Вони забезпечують внутрі- та міжклітинні взаємодії, виявляють мітогенні й протипухлинні властивості, виступають імуномодуляторами і тригерами, широко використовуються в різних галузях хімії, біології та медицини. Поглиблене вивчення лектинів необхідне як для пізнання регуляторних механізмів, які відбуваються в живій природі, так і для використання цих поліфункціональних речовин як ефективних медичних засобів. Сфери застосування лектинів часто обмежуються доступністю та вартістю джерел виділення; великим є також дефіцит лектинів з рідкісною вуглеводною специфічністю, а саме: до фукози, сіалових та уронових кислот, олігосахаридів, тощо; тому пошук та використання нетрадиційних джерел одержання препаратів лектинів з унікальною специфічністю є вельми необхідним.
Серед лектинів різного походження найменш вивченими є мікробні, й більшою мірою – бактерійні лектини. Серед цієї групи найбільш дослідженими є лектини, які знаходяться на поверхні клітини і беруть безпосередню участь у процесах адгезії та формування мікробних асоціацій (Косенко Л.В., Ковалевская Т.М., 1989; Buchanan T.M., Pearce W.A., 1976; Kameyama N., Oishi K., 1983; Sharon N. 1984; Wadstrцm T., 1983). Позаклітинна локалізація виявляється у невеликої кількості бактерій, в основному, в патогенних штамів, для яких ці метаболіти є факторами вірулентності при різноманітних патологічних процесах та мають токсичні властивості (Draper R.K. et al., 1978; Dufrйne Y.F. et al., 1996; Kameyama K. et al., 1987; Richards R.L. et al., 1979; Wadsdrцm T., 1989). Дані щодо лектинів caпрофітних бактерій практично відсутні, тому ця група лектинів становить надзвичайно багатий матеріал для досліджень.
У зв’язку з цим, дослідження, спрямовані на поглиблений пошук позаклітинних лектинів серед зовсім не вивченої у цьому плані групи мікроорганізмів – спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus, одержання лектинів зі специфічністю, що рідко зустрічається, визначення їхніх властивостей та аспектів застосування, стають актуальними.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно планів наукових досліджень Інституту мікробіології і вірусологіі НАН України (ІМВ), а також галузевими і державними науково-технічними програмами: “Програма боротьби зі СНІДом”, “Імунопрофілактика населення на 1993-2000 роки”, “Здоров’я людини”, “Захист генофонду, та імунної системи населення України”, “Біотехнологія”.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи: встановити фізіологічні особливості спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus – cинтетиків позаклітинних лектинів, виділити та очистити лектини зі специфічністю, що рідко зустрічається, визначити їхні гемаглютинуючі, фізико-хімічні та медико-біологічні властивості та можливі сфери застосування.
Виходячи з мети роботи, було сформульовано такі основні задачі:
1. Провести поглиблений пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед представників роду Bacillus, виділених із різних екологічних ніш.
2. Вивчити особливості біосинтезу позаклітинних лектинів у процесі росту бактерій.
3. Розробити методи виділення та очищення позаклітинних сіалоспецифічних лектинів.
4. Визначити їх вуглеводзв’язуючі та фізико-хімічні властивості.
5. Установити тонку вуглеводну специфічність лектинів бацил.
6. Виявити стійкість лектинів бацил до різних факторів зовнішнього середовища.
7. Дослідити медико-біологічні властивості позаклітинних лектинів Bacillus: гостру токсичність, протипухлинну активність, дію на імуногенез, імунну відповідь макроорганізму та інтерфероногенез.
Наукова новизна роботи. При виконанні експериментальних досліджень одержано нові результати, на основі яких було вперше:
– проведено розширений пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus і встановлено їхню здатність синтезувати та виділяти у середовище росту лектини з унікальною специфічністю до сіалових та уронових кислот;
– виявлено особливості біосинтезу позаклітинних сіалоспецифічних лектинів сапрофітними бактеріями, показано вплив на цей процес різних факторів зовнішнього середовища; встановлено залежність процесу лектиноутворення від умов росту при періодичному і безперервному культивуванні; здійснено спрямований біосинтез цих метаболітів;
– одержано очищені препарати сіалоспецифічних лектинів, вивчено їхні властивості та показано, що представники роду Bacillus продукують два позаклітинні лектини, які відрізняються між собою за гемаглютинуючими, вуглеводзв’язуючими та фізико-хімічними властивостями;
– визначено тонку вуглеводну специфічність позаклітинних лектинів бацил у відношенні різних типів сіалових кислот, їх ацетильованих форм та зв’язків з термінальними вуглеводами;
– установлено здатність позаклітинних сіалоспецифічних лектинів Bacillus чинити диференційовану та імуностимулюючу дію на окремі етапи імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, здійснювати вибірковий протипухлинний ефект та індукувати утворення гама-інтерферону.
Положення і висновки дисертаційної роботи утворюють новий напрям у мікробіології: вивчення фізико-хімічних властивостей та біологічної активності позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій та визначення сфер їх використання в різних галузях біології та медицини.
Практичне значення роботи. Дані щодо лектинпродукуючої здатності спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus мають значення для вирішення таких завдань сучасної мікробіології, як: визначення здатності сапрофітних бактерій утворювати сіалоспецифічні лектини, зв’язок цієї властивості з функціонуванням цих мікроорганізмів у природних умовах і використаннях її як додаткової ідентифікаційної ознаки при розробці сучасної таксономії бацил.
Встановлення особливостей утворення позаклітинних бактерійних лектинів дозволяє проводити спрямований біосинтез цих біополімерів.
Розроблена технологія одержання препаратів позаклітинних сіалоспецифічних лектинів сапрофітних бактерій з різними критеріями очищення та ступенем спорідненості до специфічних вуглеводів для різноманітних напрямків використання цих біологічно активних речовин.
Унікальна специфічність очищених лектинів бацил до різних типів сіалових кислот, їх О-ацетильованих форм та зв’язків з термінальними вуглеводами дозволяє використовувати ці речовини як високочутливі і специфічні аналітичні та діагностичні реагенти, які конкурують за тонкою вуглеводною специфічністю з моноклональними антитілами.
3а результатами проведених медико-біологічних досліджень створено умови для конструювання на основі сіалоспецифічних лектинів сапрофітних бактерій принципово нових медикаментозних препаратів направленої дії як імуномодулюючих і протипухлинних засобів.
Розроблено: Лабораторний регламент на отримання позаклітинного сіалоспецифічного лектину (штамм B.subtilis 668 ІМВ) для потреб біології, медицини та ветеринарної медицини та Технічні умови на виробництво g-інтерферонів свиней і великої рогатої худоби, в яких як індуктор інтерфероногенезу використовується бактерійний лектин.
Особистий внесок пошукача. Автору належить ідея поглибленого вивчення позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій для розуміння фізіологічних особливостей утворення цих біополімерів і проведення керованого процесу їхнього біосинтезу, а також з метою пошуку нових біологічно активних речовин, які внаслідок своїх різноманітних біоефекторних властивостей можуть знайти практичне застосування в різних галузях біології та медицини. Ця ідея знайшла eкcпepимeнтальне підтвердження в дисертаційній роботі. Автором розроблено і здійснено комплекс різнопланових досліджень експериментальної частини роботи, проведено аналіз і теоретичну обробку отриманого фактичного матеріалу, зроблено висновки та узагальнення, сформульовано наукові положення, які є значними досягненнями в лектинології. Основний експериментальний матеріал одержано автором особисто та разом із співробітниками дослідницької групи під керівництвом дисертанта (інж. І кат. К.І. Гетьман, к.б.н. І.А. Симоненко). В окремих дослідах брали участь науковці ІМВ: к.б.н. В.А. В’юницька і к.б.н. В.Є. Козирицька (пошук продуцентів позаклітинних лектинів бацил і стрептоміцетів, відпо-відно). чл.-кор. НАНУ, д.б.н., проф. І.Г. Скрипаль (розробка методу воденьзв’язуючої та гідрофобної хроматографії), к.б.н. С.К. Воцелко (визначення молекулярно-масових характеристик), акад. АТНУ, д.б.н., проф. Я.Г. Кішко (вивчення інтерфероногенної активності лектинів). Одержання сіалоспецифічних лектинів методом гідрофобної хроматографії виконано спільно з к.б.н. Л.С. Жигіс в Інституті біоорганічної хімії РАН, Москва; дослідження медико-біологічних властивостей лектинів проведено за участю д.м.н., проф. Н.І. Шарикіної та к.б.н. І.Г. Кудрявцевої (Інститут фармакологіі та токсикологіі АМНУ).
Апробація роботи. Основні положення дисертаціі та наукові результати доповідались на VII з’їзді Всесоюзного мікробіологічного товариства (Алма-Ата, 1985), 10th Congress of the Hungarian society of microbiology (Szeged, Hungary, 1987), I Pеспубліканської конференції “Изучение и применение лектинов” (Таллін-Тарту, 1988), VII і VIII з’їздах Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989; Одеса, 1993), VII International Congress of Virology (Berlin, 1990), Всесоюзної конференції “Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодуляторов” (Москва, 1990). Науково-практичної конференції “Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней” (Харьков, 1993); 10th (Tartu, Estony,1989), 15th (Szeged, Hungary, 1993) та 17th (Wьrzburg, Germany, 1997) International Lectin Conferences; 2nd International Conference “AIDS, Cancer and Human Retroviruses” (St. Petersburg, Russia, 1997), а також конференціях, семінарах і засіданнях вченої ради ІМВ.
Публікації. 3а матеріалами дисертації опубліковано 65 наукових робіт, у тому числі: 1 монографія, 20 робіт (8 з них у зарубіжних виданнях), 35 тезах вітчизняних та зарубіжних конференцій, 8 авторських свідоцтв і патентів на винаходи (на 3 із них одержано позитивні рішення) і 1 раціоналізаторська пропозиція. Розроблена технічна документація: “Лабораторный регламент на производство внеклеточного сиалоспецифичного лектина микроорганизма Bacillus subtilis штамм 668 ИМB” і Технічні умови: “Гамма-бовиферон” і “Гамма-суиферон”.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація виконана в одному томі і містить вступ, огляд літератури (3 розділи), матеріали і методи досліджень, результати експериментальних досліджень (5 розділів), обговорення результатів і висновки, список літератури (311 джерел) та дoдаток. Робота викладена на 292 сторінках, ілюстрована 53 таблицями та 41 рисунком.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктом досліджень були спороутворюючі аеробні бактерії роду Bacillus: В.subtilis 316М – штам селекційований в ІМВ і депонований в Центральному музеї промислових культур мікроорганізмів за № ЦМИ 2466; дві культури B.mucilaginosus spp. – одержані з Інституту мінеральних ресурсів (Сімферополь) та Всесоюзного інституту сільськогосподарської мікробіології (Санкт-Петербург); 306 культур бацил – з музею відділу антибіотиків ІМВ; штам B.subtilis 668 ІMB депонований в Депозитарії ІMВ за № В-7014.
Культивування бактерій здійснювали періодичним способом на качалках (n-160 об/хв) в колбах Ерленмейера з об’ємом 100 мл та безперервним засобом у ферментерах типу “Анкум” (робочий об'єм 3 л, витрата повітря на аерацію 0,5 л/л/хв). Вихідними були: середовище 25 для B.subtilis 316М (Васківнюк В.Т. та інші, 1977); вирощування B.mucilaginosus spp. проводили на середовищі зі складом, г/л: глюкоза – 0,9; MgSO4·7H2O – 1,3; Na2HPO4 – 0,7; KNO3 – 0,9; FeCl3 – 0,05; інші штами бацил вирощували на середовищі Гаузе (Коваленко Э.А. и др., 1987). Дослідні середовища містили один з оптимальних для накопичення лектинів вуглевод: середовище 25 – мальтозу, галактозу та рамнозу. середовище Гаузе – галактозу, лактозу, фруктозу і ксилозу. Культури вирощували при 30, 37 та 42°С.
Бактерійні клітини відділяли центрифугуванням при 5000-6000 g на протязі 20 хв. Культуральний фільтрат використовували для одержання лектинів, а клітини – для визначення кількості біомаси ваговим методом і розрахунку значень питомої швидкості росту і питомої швидкості утворення лектинів (Перт, 1987).
Препарати лектинів одержували з культурального фільтрату осаджуванням етанолом (2 об’ємами), ацетоном (2 об’ємами) або висолюванням сірчанокислим амонієм у градієнті насичення від 0 до 80 %.
Для очищення лектинів використовували різні методи: афінну хроматографію на муцин-сефарозі 4В у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР), рН 7,3; лектин-афінну хроматографію на конканавалін А-глюкозил-сфероні в ЗФР з наступною елюцією a-метил-D-глюкозидом в концентрації від 10 до 100 мМ; іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ – целюлозі у фосфатному буфері, рН 8,0; гель-хроматографію на сефадексі G-50 в ЗФР та сефарозах CL-6В, 6В і 4В в трис-НСІ буфері з 0,1М NaСІ, рH 8,2; воденьзв’язуючу і гідрофобну хроматографію на гелях типу “ТSК Gel Toyoреrl” марки HW-40; HW-55 і HW-60 в трис-НСІ буфері, рН 8,0; ізоелектрофокусування в борат-поліольній системі в градієнті рН 2,0-9,5.
Гемаглютинуючі властивості лектинів перевіряли на нативних і оброблених ферментами різних типів еритроцитах: кроля, миші, гвінейської свинки і людини. Наявність гемаглютинуючої (ГАА) або лектинової (ЛА) активності визначали реакцією гемаглютиції (РГА) і виражали як титр-1 РГА або lg2 титра-1РГА; питому лектинову активність (ЛАпит) – як титр-1 PГA на 1 мг білка в 1 мл (ГАО) культуральної рідини/препарату (Луцик М.Д. та ін., 1980). Вуглеводзв’язуючу здатність досліджували реакцією інгібування гемаглютинації, для чого використовували 73 вуглевода та вуглеводвмісних полімера.
Для виявлення стійкості лектинів до різних факторів зовнішнього середовища ставили РГА з трипсинизованими та обробленими глутаровим альдегідом еритроцитами кроля в різних буферних системах при рН від 2,8 до 10,0 в присутності або відсутності ЕДТА і Са2+; при визначенні термостабільності лектини інкубували на водяній бані при температурі від 40 до 100°С на протязі 5-20 хв.
Кількість білків визначали з використанням реактиву Фоліна (Lowry O.H. et al., 1951), методом Bradford M.M. (1976) або безпосередньо на електрофотометрі СФ-26 при 280 нм; вміст амінокислот вивчали на аналізаторі амінокислот КLА.
3агальні вуглеводи досліджували реакцією з фенолом і сірчаною кислотою (Dubois M. et al., 1956); якісний моносахаридний склад аналізували методом газорідинної хроматографії на хроматографі “Сrom-5” (Albershein P. et al., 1976).
Загальну протеолітичну активність визначали з використанням казеїну як субстрату (Бондарчук А.А., Ажицкий Г.Ю., 1982).
Молекулярну масу лектинів вивчали методами гель-фільтрації на сефарозі 6В (Andrews P., 1965) і методом ультрацентрифугування. Гідродинамічні характеристики лектинів аналізували за методом швидкісної седиментації на аналітичних центрифугах МОМ-31~70В та Spinko E; молекулярно-масовий розподіл проводили на препаративних ультрацентрифугах AC-601, K-32 і “Вес” L-6 (Boцелко С.К. и др., 1992).
Електрофоретичний розподіл лектинів проводили за методом диск-електрофорезу в 10 %-ному поліакріламідному гелі на приладі “Reanal” в присутності 0,1 % додецилсульфату натрію.
Для визначення гострої токсичності лектинів використовували експрес-метод Прозоровського В.Б. (1978), протипухлинної активності – рекомендації Онкологічного центру АМН Росії, імунотропних властивостей – схему експериментів, запропонованих Петровим Р.В. і Хаїтовим Р.М. (1972, 1974, 1976).
Інтерфероногенні властивості лектинів вивчали in vitro на спленоцитах миш, свиней та великої рогатої худоби; в дослідах in viro лектини вводили мишам внутрішньом’язово; тип інтерферону визначали за його чутливістю до температури та кислотостійкості (Kirhner H. et al., 1982)
Статистичну обробку експериментального матеріалу проводили за параметричними критеріями нормального розподілу варіант (Вознесенский В.Л., 1969; Урбах В.Ю.,1975); статистичні показники: середнє арифметичне, середня квадратична похибка, стандартна похибка та довірчий інтервал при рівнянні значимості 0,05 наведено в таблицях і враховано при виконанні рисунків.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Механізм біосинтезу позаклітинних лектинів Bacillus
Пошук продуцентів позаклітинних лектинів. При постійному розширенні сфер застосування лектинів потреба в цих речовинах незмінно зростає, і пошук нових нетрадиційних джерел сировини та одержання препаратів з різноманітною специфічністю і біологічною активністю є вельми актуальними задачами. Нами був проведений попередній пошук позаклітинних лектинів серед різних груп мікроорганізмів: стрептоміцетів (Валагурова Е.В. и др., 1994), молочно-кислих, коріне- і нокардіоподібних бактерій, дріжджів та бацил (Подгорский В.С. и др., 1992), всього було досліджено біля 750 культур. Найбільша кількість лектинсинтезуючих культур була виявлена в останній групі бактерій. Поглиблений пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед 309 бактерійних культур, які належать до 15 видів бацил, ізольованих із різних екологічних ніш, дозволили виявити біля 30 % штамів, здатних синтезувати ці речовини (табл. 1, 2).
Таблиця 1
Синтез позаклітинних лектинів Bacillus
Таблиця 2
Здатність до продукування позаклітинних лектинів спороутворюючими
аеробними бактеріями, ізольованими з різних eкoлогічниx ніш
У більшій мірі були досліджені штами Bacillus subtilis, які значно частіше, ніж всі останні, виділялись із шлунково-кишкового тракту людини і тварин та інших джерел; біля третини з них були продуцентами позаклітинних лектинів. Серед інших видів лектинпродукуючі культури були виявлені в B.licheniformis, B.cereus, B.polymyxa, B.megaterium, B.mucilaginosus, B.coagulans, B.firmus, B.pumilus. В окремих штамах, які належать до видів, що рідко зустрічаються, ця здатність поки не була визначена. Найбільш активними були штами, ізольовані від людей (63 %), сільськогосподарських тварин (29 %), лікувальних грязей (36 %) і грунту (20 %). Лектинова активність була виявлена саме у тих видів Bacillus, які входять до складу мікробіоценозу людини і тварин, а також сімбіотичних асоціацій грунту, що може свідчити про можливу роль позаклітинних лектинів у ряді функцій мікроорганізмів, які обумовлюються нормальною мікрофлорою: доставці поживних речовин, нейтралізації токсинів, захисту від патогенів тощо.
Для подальших досліджень були відібрані найбільш активні сапрофітні культури бацил, які супроводжують людину та тварин на протязі всього життя, і організм адаптований не тільки до цілісних клітин, але й до їх метаболітів, одними з яких є позаклітинні лектини, чия нешкідливість для людини і тварин є їхньою природною властивістю.
Динаміка утворення позаклітинних лектинів. У літературі є достатньо даних щодо вуглеводзв’язуючих властивостей позаклітинних лектинів бактерій, зустрічаються відомості щодо їх фізико-хімічних характеристик, але вивченню фізіологічних особливостей утворення лектинів присвячені одиничні дослідження (Коваленко Э.А., 1990; Подгорский В.С. и др., 1992). Вивчення цих процесів надзвичайно важливе для розуміння ролі позаклітинних лектинів у метаболізмі бактерій.
При вивченні фізіологічних особливостей росту сапрофітних штамів бацил і біосинтезу ними позаклітинних лектинів було встановлено, що динаміка проявлення лектинової активності та її рівень і тривалість були індивідуальними для кожного штаму (рис. 1). Для деяких культур на протязі такого ж часу вирощування була встановлена здатність до утворювання двох рівнів підвищення та зниження лектинової активності в культуральній рідині (рис. 1, 2.Б). Перший, максимальний екстремум активності, був відмічений у фазі гальмування росту клітин (наприкінці лог-фази); другий, менш активний – у фазі відмирання клітин (рис. 2).
Рис. 1. Динаміка виявлення лектинової активності в культуральній рідині представників Bacillus на середовищі Гаузе; культури: 1 – B.polymyxa 102 КДУ, 2 – B.subtilis 668 ІМВ, 3 – B.subtilis 684 ІМВ, 4 – B.cereus, 5 – B.subtilis 605 ІМВ, 6 – B.subtilis 685 ІМВ.
Рис. 2. Динаміка виявлення лектинової (ГАА) і протеолітичної (ПА) активностей в культуральній рідині B.subtilis 316М з автолізатом із хлібопекарних (А) або пивних (Б) дріжджів: 1 – біомасса (АСБ), 2 – ГАА, 3 – ПА.
Зниження лектинової активності в ранній стаціонарній фазі росту, можливо, пояснюєються зв’язуванням позаклітинних лектинів вуглеводних рецепторів їхніх власних клітин, що підтверджується мікроскопічними дослідженнями культур, через те що саме в цей період відмічається агрегація клітин в результаті аглютинації, яка визвана присутністю лектинів у середовищі росту. Повторне підвищення лектинової активності в культуральній рідині спричинено не активною секрецією лектинів, а виходом у середовище внутріклітинних лектинів за рахунок автоліза клітин і процесу спроутворення, який проходить у цей час росту культур.
Достовірно встановлений нами факт максимального синтезу позаклітинних лектинів бацил саме наприкінці лог-фази росту клітин свідчить про те, що ці метаболіти слід розглядати як вторинні, у зв’язку з чим подальша робота потребувала рішення таких завдань, як: проведення регуляції процесу лектиноутворювання, одержання активних препаратів лектинів бацил, вивчення їх властивостей і можливостей застосування.
Вплив температури культивування на біосинтез лектинів. На здатність бактерійних культур до синтезу вторинних метаболітів, у тому числі й лектинів, суттєво впливають різні фактори зовнішнього середовища і насамперед температура вирощування (Old D.C. et al., 1985). При культивуванні досліджуваних штамів бацил при 30, 37 та 42°С було встановлено, що температура чинить індивідуальний ефект на їх лектинсинтезуючу здатність і у всіх випадках залежно від температури змінюється кількісний вміст лектинів у середовищі росту. Оптимальною температурою для росту продуцентів і біосинтезу ними позаклітинних лектинів є температура 37°С, при якій відмічається двофазний характер накопичення лектинової активності в культуральній рідині.
Залежність лектинпродукуючої здатності бактерій від компонентів поживного середовища. При дослідженні динаміки утворювання позаклітинних лектинів бацил було встановлено, що процес лектинутворення тісно пов’язаний з ростом культур та їх функцією. У зв’язку з цим компоненти поживного середовища, які активно впливають на ріст бактерій, можуть чинити дію і на синтез лектинів.
Використання різних біостимуляторів, наприклад у випадку B.subtilis 316М, заміна автолізату з хлібопекарних дріждів на автолізат з пивних дріжджів дозволяє інтенсифікувати життєдіяльність бактерій (швидкість росту, АСБ), виявити другий екстремум активності і значно скоротити час виходу лектинів у середовище росту, що є дуже важливим для суттєвого здешевлення процесу одержання лектинів (рис. 2).
Нами встановлено, що для біосинтезу позаклітинних лектинів надзвичайно важливі концентрація і співвідношення джерел вуглецю та азоту в середовищі. Так, при вирощуванні B.mucilaginosus sp. на середовищі з глюкозою (джерело вуглецю) і КNО3 (джерело азоту) у співвідношенні 1:1 спостерігається утворення лектинів вільної і зв’язаної форм, яке закінчується до кінця першої доби (рис. 3). При культивуванні цього ж штаму на середовищах із підвищеним вмістом глюкози відзначається певна періодичність накопичення лектинів на протязі 12 діб! Такого явища до цього часу не було зареєстровано у жодних мікроорганізмів, але одержані результати свідчить про те, що процес лектинутворення може бути керованим.
Рис. 3. Біосинтез лектинів B.mucilaginosus sp.; лектинова активність: 1 – на клітинах, 2 – в культуральній рідині; 3– біомаса (АСБ); співвідношення азоту і вуглеводу в середовищі = 1:1; температура вирощування 28-30°С.
При вивченні впливу різних вуглеводів на лектинову активність культуральної рідини продуцентів встановлено, що вона постійно визначається тільки при наявності у середовищі глюкози, галактози, а також їх дисахаридів: лактози і в меншій мірі мальтози. Інші досліджувані вуглеводи мали індивідуальну дію на цей процес, а рафіноза його інгібувала (табл. 3).
Таблиця 3
Вплив джерел вуглецю на утворення
позаклітинних лектинів представниками Bacillus
Примітка: “+” – наявність, “–” – відсутність гемаглютинуючої активності; підкреслені вуглеводи (тут і надалі) – основне джерело вуглеводу в контрольних середовищах для кожного штаму.
Виявлення двох екстремумів активності в культуральній рідині бацил поставило питання щодо можливості продукування ними двох лектинів у різні фази росту, яке можна було вирішити тільки при порівнянні їх вуглеводзв’язуючих властивостей. Використання більш, ніж 70 моно-, ди- і трисахаридів для реакції інгібування гемаглютинації показало, що для всіх лектинів, незалежно від фази росту та присутності того чи іншого вуглеводу у середовищі, характерна спорідненість до N-ацетилнейрамінової та D-глюкуронової кислот, фруктозо-1,6-дифосфату, обох аміносахарів. Здатність досліджуваних лектинів зв’язувати деякі інші сахара (D-галактуронову, фосфоглюконову та глюкозо-6-фосфорну кислоти) була індивідуальною для кожної культури (табл. 4).
Таблиця 4
Мінімальні дози вуглеводів, які інгібують реакцію гемаглютинації лектинів,
синтезованих Bacillus у фазі затримання росту на середовищах з різними вуглеводами
углеводзв’язуючі властивості лектинів, що продукуються як на ранніх, так і пізніх стадіях розвитку культур, проявлялись до однієї й тієї ж групи вуглеводів і були ідентичними. Різниця полягала тільки в інгібуючих дозах специфічних вуглеводів, до яких лектини І-го екстремуму активності проявляли більш високий ступінь спорідненості, ніж лектини ІІ-го екстремуму активності. Максимальна чутливість до вуглеводів була виявлена у лектинів, синтезованих на середовищах з максимальним індуктором їх синтезу; тобто синтез лектинів зростає, стає більш спрямованим, а їх вуглеводзв’язуючі властивості проявляються чіткіше.
У доступній нам літературі ми таких відомостей не знайшли. На нашу думку, різницю в ступені спорідненості до вуглеводів лектинів, синтезованих бактеріями на середовищах з різними джерелами вуглецю, можна пояснити утворенням різних ізоформ лектинів.
Дія рН середовища на утворення лектинів. При вивченні впливу рН середовища на продукування лектинів були використані вуглеводи, які здійснювали максимальний стимулюючий вплив на синтез позаклітинних лектинів бацилами; початкові значення рН середовищ коливались в межах від 5,0 до 8,0; результати цих досліджень подані на pиc. 4. Як правило, оптимальним для процесу лектиноутворення було рН середовища, яке є найкращим для росту клітин; однак закисленням середовища до рН 5,0 або залуженням його до рН 8,0 з одночасним внесенням індукуючого цей процес вуглеводу можна також підвищити рівень лектинів конкретно для кожного продуцента.
Характер росту і лектиноутворення в умовах періодичного і безперервного культивування бактеріій. Порівняльне вивчення питомої швидкості росту бактерій і утворення ними лектинів від початку культивування до фази відмирання дозволило встановити, що у всіх випадках стадія росту бактерій випереджає стадію синтезу лектинів (рис. 5). При заміні основного джерела вуглеводу в середовищі на вуглевод, який максимально індукує синтез лектинів, відмічено збіль-шення питомої швидкості росту бактерій і в більшій мірі – питомої швидкості синтезу лектинів.
Найвища лектинова активність культуральної рідини була відзначена у фазі затримання росту бактерій, що стало основою для використання методу хемостатного культивування в широкому розподілі розбавлення середовищ. Безперервне культивування при підібраних умовах дозволило підвищити гемаглютинуючу активність в середовищі в 4-16 разів і зменшити їхню здатність до біосинтезу інших біологічно активних речовин (наприклад, протеїназ В.subtilis 316М).
Одержані результати свідчать про можливу ефективну фізіологічну регуляцію метаболізму позаклітинних лектинів бацил та проведення процесу спрямованого біосинтезу цих метаболітів.
Рис. 4. Вплив рН середовища на утворення позаклітинних лектинів Bacillus; культури: A – B.subtilis 605 ІМВ, Б – B.subtilis 684 ІМВ, В – B.subtilis 685 ІМВ, Г – B.cereus,
Д – B.subtilis 316 M, E – B.subtilis 668 ІМВ, Ж – B.polymyxa 102 КДУ; вуглеводи в середовищі: 1 – глюкоза, 2 – галактоза, 3 – лактоза, 4 – фруктоза, 5 – мальтоза,
6 – рамноза, 7 – ксилоза.
Рис. 5. Питома швидкість росту бактерій – mх (1) і питома швидкість накопичення лектинів – mр (2)) B.subtilis 668 ІМВ на середовищі Гаузе з глюкозою (А) та середовищі Гаузе з галактозою (Б).
Таким чином, встановлена здатність бактерій роду Bacillus синтезувати позаклітинні лектини зі специфічністю до сіалових і уронових кислот, вивчення фізіологічних особливостей росту бактерій дозволило виявити три факти: індиві-дуальність процесу лектиноутворення для кожної культури, обмеженість у часі проявлення лектинової активності в культуральній рідині, а також наявність у ній двох екстремумів активності; найбільш висока лектинова активність відмічена в стадії затримання росту бактерїй; стадія росту бактерій випереджає стадію синтезу лектинів; на лектинсинтезуючі властивості бацил впливають різні фактори зовнішнього середовища: температура та час вирощування, склад і рН поживного середовища, наявність у ньому певного вуглеводу й біостимуляторів; підбір оптимальних умов культивування бактерій дозволили здійснити керований синтез позаклітинних лектинів.
| 
