|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ
РУШКОВСЬКИЙ Станіслав Ричардович
УДК 575.224.23:576.345.61
ОСОБЛИВОСТІ ПРОЯВУ ХРОМОСОМНОЇ НЕСТАБІЛЬНОСТІ ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРІЙНОЇ КРОВІ ЛЮДИНИ.
03.00.15 — генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка
Науковий керівник доктор медичних наук, професор Бариляк Ігор Романович,
Український науковий центр медичної генетики, Інститут
гігієни та медичної екології АМН України ім. О.М.Марзєєва
Офіційні опоненти: професор, доктор біологічних наук Кунах Віктор Анатолійович,
завідуючий відділом генетики клітинних популяцій Інституту
молекулярної біології та генетики НАН України, м. Київ
кандидат біологічних наук Зерова-Любимова Тетяна Едуардівна,
провідний науковий співробітник кафедри медичної генетики
Київської медичної академії післядипломної освіти
ім. П. Л. Шупика, МОЗ України, м. Київ
Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна,
кафедра генетики і цитології
Захист дисертації відбудеться “26” квітня 2001 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01. в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.
Автореферат розісланий “25”березня 2001 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук В.Д. Науменко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Здатність геному до стабільного функціонування у змінних умовах є однією з його фундаментальних властивостей, що забезпечує відтворення та передачу генетичної інформації в ряді поколінь практично без помилок. Сучасна екологічна ситуація характеризується забрудненням довкілля внаслідок все більш інтенсивних та масштабних антропогенних впливів (Нац. допов., 1993; Бариляк та ін., 1993; Дуган, 1998). Умови середовища відхиляються від оптимальних значень, кількість помилок в роботі генетичного апарату збільшується. Це призводить до підвищення рівня нестабільності генетичного матеріалу, результатом чого є зростання онкологічних захворювань та спадкових патологій (Бариляк и др., 1989; Strauss, 1998).
Одним із суттєвих показників стійкості геному до дії зовнішніх чи внутрішніх пошкоджуючих факторів є каріотипічна нестабільність, проявом якої є структурні та кількісні аномалії хромосом (ВОЗ, 1989). Рівень каріотипічної нестабільності залежить від точності роботи різних систем репарації та відтворення генетичного матеріалу і, значною мірою, обумовлений особливостями генотипу конкретної особини (Тарасов, 1982; Howell, Taylor, 1991; Yu et al. 1999). В залежності від того, спостерігаються морфологічні чи кількісні зміни хромосом, різноманітні прояви каріотипічної нестабільності відображають дію різних систем (Heіm et al., 1989; Lіmolі et al., 1997). В зв'язку з цим, важливого значення набуває розробка підходів, які дозволяють виділити та охарактеризувати групи людей з різним рівнем каріотипічної нестабільності за різними параметрами нестабільності каріотипу. Актуальним на сьогодні є вивчення явища мутагенної післядії, зокрема затриманої хромосомної нестабільності, яка проявляється в підвищенні рівня хромосомних аберацій в клітинах через декілька поколінь після мутагенного впливу (Дубинин, 1966; Kronenberg, 1994; Morgan et al., 1998). Особливого значення дослідженню даного явища надає його можлива роль в процесах канцерогенезу (Tlsty, 1995; Jackson, Loeb, 1998).
Крім реєстрації різноманітних проявів генетичної нестабільності, важливими є роботи щодо вивчення можливостей запобігання генетичним наслідкам забруднення довкілля (Алекперов, 1984; Ковальчук та інш., 1996; Бариляк, 1998). Одним з можливих шляхів є пошук та використання біологічно активних речовин, які підвищують стійкість генетичного апарату та активують захисні системи організму (Дурнев, Середенко, 1993).
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках двох програм ДКНТ: "Вивчення антимутагенних та генопротекторних властивостей біологічно активних речовин природнього походження" (№ державної реєстрації 0194U031070, шифр 01.01.01/021 /005К-95) та "Розробка наукових основ та рекомендацій застосування індукторів та пролонгаторів дії інтерферону з метою використання його як антимутагену" (№ державної реєстрації 0194U031071, шифр 01.01.05/005 /005К-95), які входили до комплексної державної програми "Захист генофонду та імунної системи населення України"
Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у вивченні особливостей прояву спонтанної та індукованої хромосомної нестабільності при культивуванні лімфоцитів периферійної крові (ЛПК) людини в залежності від тривалості культивування (52 та 144 години) та дії біологічно активної речовини (тимогену).
Відповідно до мети вирішувалися такі задачі:
1. Провести порівняння та аналіз спонтанної нестабільності каріотипу в ЛПК при короткочасному (52 години) та тривалому (144 години) культивуванні.
2. Дослідити залежність рівня аберацій хромосом в лімфоцитах людини від тривалості культивування при опроміненні ультрафіолетом-С (УФ-С, 100 — 280 нм).
3. Дослідити варіації прицентромерного гетерохроматину хромосом 1, 9, 16 та Y при двох термінах культивування ЛПК.
4. Вивчити вплив тимогену на рівень хромосомних аберацій в культурі ЛПК людини.
Об'єктом дослідження було явище нестабільності геному. Предметом дослідження — хромосомна нестабільність в культивованих лімфоцитах периферійної крові людини. Для досягнення мети та вирішення поставлених завдань використовувалися цитогенетичні (приготування та аналіз препаратів хромосом людини) та статистичні методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексну оцінку каріотипічної нестабільності при двох термінах культивування лімфоцитів за декількома цитогенетичними параметрами. Встановлено, що тривале культивування дає змогу зареєструвати додаткові прояви нестабільності каріотипу, в порівнянні з короткочасним.
Показано, що пiсля тривалого культивування бiльш чiтко виявляються iндивiдуальнi вiдмiнності за параметрами нестабiльності кариотипу. На підставі індивідуальних відмінностей за рівнем каріотипічної нестабільності при двох термінах культивування було виділено чотири групи донорів.
Вперше виявлено, що при тривалому культивуванні опромінених УФ-С лімфоцитів, реєструється дозозалежна затримана хромосомна нестабільність.
Вперше показано, що при тривалому культивуванні ЛПК спостерігається нестабільність сегментів прицентромерного гетерохроматину, якої не було виявлено при короткочасному культивуванні.
Відмічено, що порівняльний аналіз нестабільності каріотипу при двотерміновому культивуванні дозволяє отримати більше інформації про стабільність геному людини, ніж використання кожного терміну культивування окремо.
Вперше досліджено вплив імуностимулятора тимогену на рівень спонтанної та індукованої хромосомної нестабільності в ЛПК. Показано, що тимоген в досліджених умовах має генопротекторні властивості.
Практичне значення одержаних результатів. Цитогенетичний аналіз при тривалому культивуванні може бути використаний як тест для визначення затриманої хромосомної нестабільності при вивченні дії мутагенних факторів. Порівняльний аналіз рівнів каріотипічної нестабільності при короткочасному та тривалому культивуванні лімфоцитів периферійної крові можна рекомендувати як підхід до оцінки індивідуальних особливостей нестабільності каріотипу. Результати дослідження дії тимогену можуть бути підставою для рекомендації щодо використання тимогену як генопротектора.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно було зроблено аналіз літератури, розроблені напрямки та завдання дослідження, сплановані та виконані всі основні експерименти. В проведенні деяких експериментів приймали участь Чегринець С.Є. та Приходько Т.Л. Результати досліджень, викладені в дисертації, одержані особисто автором, обговорення результатів проводилося разом із співавторами статей.
Апробація роботи. Результати досліджень були оприлюднені на науково-практичній конференції "Стан медичної генетики в Україні" (Київ, 1999), науковій конференції "Навколишнє середовище і генетика раку" (Київ, 1999), п'ятому міжнародному симпозіумі "Environmental contamination in Central and Eastern Europe" (Prague, 2000), засіданнях кафедри загальної та молекулярної генетики Київського національного університету імені Тараса Шевченка та вченої ради Українського наукового центру медичної генетики МОЗ і НАН України.
Публікації: За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з них 7 у фахових наукових журналах та збірниках наукових праць.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступної частини, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень та їх обговорення, висновків і списку літератури, що містить 213 посилань, в тому числі 136 іноземних. Дисертація викладена на 140 сторінках машинописного тексту і містить 9 таблиць і 26 рисунків.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Цільну кров (1 мл) п'ятдесяти клінічно здорових донорів віком від 22 до 35 років культивували в 5 мл середовища RPMІ-1640 з 10% ембріональної телячої сироватки. Мітоген (мітоген лімфоцитарний, Мінськ, ДІАЛЕК) додавали в кількості 25 мкл на 1 мл культурального середовища. Термін культивування (52 та 144 години) обирали виходячи з результатів власних експериментів та літературних джерел (Двалишвили, 1984, Двалишвили 1989). Препарати готували згідно загальноприйнятих методик (Дарлингтон, Ла Кур, 1980).
Опромінення УФ-С (лампа БУВ-15, фільтр УФС-1) проводили протягом 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 та 32 хв., що відповідає дозам опромінення 51,6; 103,2; 206,4; 412,8; 825,6; 1_
| 
