|
ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА
Худа Лідія Вікторівна
УДК 577.352.3+616.006
Особливості окиснювальної модифікації білків хроматину клітин печінки і карциноми Герена попередньо опромінених тварин-пухлиноносіїв
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Чернівці – 2002
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Чернівецькому національному університеті імені Юрія
Федьковича Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор
Марченко Михайло Маркович,
Чернівецький національний університет
імені Юрія Федьковича, завідувач кафедри
біохімії, декан біологічного факультету
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Цудзевич Борис Олександрович,
Київський національний університ
імені Тараса Шевченка,
професор кафедри біохімії
доктор біологічних наук, професор
Виноградова Руфіна Петрівна,
Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАНУ,
провідний науковий співробітник лабораторії
технології біопрепаратів
Провідна установа: Львівський національний університет імені І.Я. Франка.
Захист відбудеться “18” вересня 2002р. о 1400 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 при
Чернівецькому національному університеті імені
Юрія Федьковича (58002, м. Чернівці, вул.
Коцюбинського, 2).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Чернівецького національного
університету імені Юрія Федьковича (58002, м.
Чернівці, вул. Л.Українки, 23).
Автореферат розісланий “ 3 ” серпня 2002р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. Згідно сучасних уявлень, радіобіологічні ефекти, процеси злоякісної трансформації клітин та росту пухлини реалізуються за механізмом вільнорадикального пошкодження клітинних структур (Менщикова Е.Б.,1993; Cerutti P.A.,1985). Особлива увага приділяється впливу активних форм кисню (АФК) на компоненти хроматину, окиснення яких відображається на особливостях перебігу основних геномзалежних процесів (Левицкий Е.Л., 1994). Однак, якщо роль АФК-залежного окиснення ДНК у функціонуванні геному з?ясована доволі повно, то процеси окиснювальної модифікації білків хроматину, особливо за умов онкозахворювання, вивчені вкрай недостатньо.
Враховуючи зміну фізико-хімічних, функціональних особливостей протеїнів та можливість їх посиленого протеолізу після окиснення (Davies K.J.A., 1987; Levine R.L., 2001, Linton S., 2001), даний процес для білків хроматину може зумовлювати порушення їх зв'язку з ДНК та перебудову функціональної активності хроматину (Wondrac G.T., 2000). Дискусійним залишається питання щодо напрямку такої перебудови. З одного боку, припускається, що за умов посиленого окиснення білків хроматину ДНК безперешкодно атакується вільними радикалами з наступною індукцією генетичної програми апоптозу (Калуев А.В., 1998). З іншого – вважають, що окиснення ДНК-зв'язаних білків може служити сигналом для посилення репараційних процесів та компенсаторної інтенсифікації матричної активності (Пескин А.В.,1997).
Отже, актуальними є дослідження, спрямовані на визначення ролі окиснювальної модифікації білків хроматину клітини печінки (як основного гомеостатичного органу) та клітин новоутворення в процесі розвитку онкозахворювання за умов попереднього опромінення пухлиноносіїв малими дозами.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 1999 до 2002 року на кафедрі біохімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича і є частиною наукових тематик кафедри „Дослідження захисних систем організмів в нормі та вражених карциномою Герена при дії опромінення та різних видів хімічних агентів”, № держреєстрації 0197U014415, „Пошук, розробка та рекомендації комплексних природних радіопротекторних та протипухлинних засобів для корекції захисних систем організмів, вражених низькими дозами радіації та при канцерогенезі”, № держреєстрації 0100U005500.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у з'ясуванні особливостей перебігу окиснювальної модифікації білків хроматину та білків постнуклеарної фракції, процесів Ca2+-Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК та інтенсивності включення міченого радіоактивного попередника у РНК печінки та карциноми Герена тварин-пухлиноносіїв на фоні їх попереднього рентгенівського опромінення в малих дозах та за дії модуляторів вільнорадикального окиснення.
Об'єкт дослідження – онкогенез за умов передуючого трансплантації фракціонованого рентгенівського опромінення в сумарній дозі 25,3 мКл/кг
Предмет дослідження – окиснювальна модифікація білків хроматину та білків постнуклеарної фракції, Ca2+-Mg2+-залежний ендонуклеоліз ДНК, включення міченого радіоактивного попередника у РНК печінки та карциноми Герена тварин-пухлиноносіїв.
Для досягнення поставленої мети ставились наступні завдання:
1. Дослідити в тканинах печінки та карциноми Герена пухлиноносіїв та пухлиноносіїв, яким трансплантація здійснювалась після семиденного рентгенівського опромінення в сумарній дозі 25,3 мКл/кг зміни наступних показників:
· рівень карбонілювання та вміст вільних SH-груп гістонових та негістонових білків хроматину;
· вміст полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) та інтенсивність Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК;
· вміст кальцію, а також металів змінної валентності (залізо, мідь) в ядрах клітин;
· співвідношення фракцій транскрипційно активного та репресованого хроматину;
· включення 3[Н]-уридину в РНК ядер;
· рівень карбонілювання та окиснення вільних SH-груп білків, а також вміст заліза та міді в постнуклеарної фракції;
2. Визначити специфіку впливу та порівняти ефективність дії природного (комплексний фітопрепарат) та хімічно синтезованого (5,6-бензкумарин-5-урацил) препаратів на досліджувані процеси в опромінених та неопромінених щурів-пухлиноносіїв.
Новизна роботи. У роботi вперше вивчено вплив фракціонованого рентгенівського опромінення малими дозами (сумарна доза 25,3 мКл/кг), що передувало трансплантації карциноми Герена, на процеси окиснювальної модифікації білків хроматину та білків постнуклеарної фракції, інтенсивність Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК та включення міченого попередника в РНК клітин печінки та карциноми Герена тварин-пухлиноносіїв.
Встановлено, що дія даної дози опромінення на печінку здорових щурів в найбільшій мірі проявляється у підвищенні інтенсивності окиснювальної модифікації як білків хроматину, так і білків постнуклеарної фракції та збільшенні вмісту ПДН в клітинних ядрах протягом тижня після припинення дії радіації. Відмінності між групами опромінених та неопромінених пухлиноносіїв в печінці проявляються у початковий період росту карциноми Герена, причому найістотніші зміни відбуваються у ядерному компартменті клітин: підвищення вмісту ПДН, посилення окиснення SH-груп гістонів та зниження інтенсивності включення міченого попередника в РНК у опромінених тварин. Найсуттєвіших змін в клітинах карциноми Герена опромінених щурів зазнає процес карбонілювання гістонів, інтенсивність якого підвищена в період першого тижня після трансплантації. На подальших етапах росту новоутворення (14-а, 21-а доби після перещеплення) відбувається зниження рівня окиснювальної модифікації білків хроматину пухлинних клітин. В період перших двох тижнів росту карциноми опромінених пухлиноносіїв спостерігається зростання частки активного хроматину, посилення включення міченого попередника в РНК та сповільнення Ca2+-Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК її клітин.
Показано, що застосування фітопрепарату призводить до стабілізаціїї процесів карбонілювання білків клітин печінки тварин-пухлиноносіїв, причому в хроматині такі зміни відбуваються при його тривалому (14-денному) використанні. Введення тваринам з карциномою Герена 5,6-бензкумарину-5-урацилу змінює процеси окиснювальної модифікації як білків хроматину, так і білків постнуклеарної фракції, а також пригнічує включення 3[Н]-уридину в РНК ядер пухлинних клітин.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати та їх узагальнення доповнюють i поглиблюють існуючі уявлення про вплив малих доз іонізуючого опромінення на ріст новоутворень у тварин, біохімічні процеси в ядрах клітин пухлини та організму пухлиноносія, а також дають змогу з'ясувати особливості функціонування хроматину за даних умов. Результати досліджень можуть послужити теоретичною основою для розробки нових підходів у скринінгу та створенні сучасних комплексних протипухлинних препаратів на основі біологічно активних речовин рослин (кумаринів, флавоноїдів, глікозидів) та їх синтетичних аналогів.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел. Дисертантка оволоділа методами біохімічних досліджень і самостійно провела експериментальну частину роботи та обробку фактичного матеріалу з використанням статистичних методів.
Аналіз, обговорення та підготовка до друку матеріалів, що відображають основні результати дисертації проведено спільно з науковим керівником та доцентом кафедри біохімії Копильчук Г.П.
Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були викладенi на міжнародному симпозіумі „Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems” (Київ, 9-14 вересня 2001 р.), міжнародних конференціях „Проблеми сучасної екології” (Запоріжжя, 20-22 вересня 2000р.), „Biorad-2001. Biological effects of low dose ionizing radiation and radioactive pollution on environment” (Сиктивкар, 20-24 березня 2001р.), науковій конференції „Научное наследие академика И.Н.Буланкина и его развитие в современной биохимии” (Харків, 16-17 січня 2001р.).
Публікації. За матеріалами виконаної роботи опубліковано 4 статті і 4 тез доповідей конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури (4 розділи), опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення (4 розділи), узагальнення, висновків та списку використаних джерел (254 найменування). Робота викладена на 144 сторінках машинописного тексту, проілюстрована 12 таблицями і 23 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді літератури висвітлюються особливості організації та функціонування хроматину в еукаріотичних клітинах, охарактеризовано біохімічні особливості онкогенезу, подані сучасні погляди на процеси окиснювальної модифікації білків та ролі малих доз радіаціїї в ініціації вільнорадикального окислення макромолекул та онкогенезу.
Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводили на білих безпородних щурах-самцях масою 120-150г та віком 2,5-3 місяці. Трансплантацію карциноми Герена здійснювали методом підшкірного введення в ділянку стегна задньої кінцівки 0,5 мл 30% суспензії пухлинних клітин у фізіологічному розчині. На 7-у добу після трансплантації пухлиноносіїв було поділено на групи: 1-ша – щурі-носії карциноми Герена (П); 2-га – пухлиноносії, яким вводили фітопрепарат з лікарських трав, що проростають на Буковині (П+ФП); 3-я – пухлиноносії, яким вводили 5,6-бензкумарин-5-урацил (П+БКУ). Препарати вводились per os протягом 14 днів (ФП – в розрахунку 0,3 мл, БКУ – 0,5 мл на 100 г маси тварини щодоби). Фітопрепарат являє собою суміш екстрактів з календули лікарської Calendula officinalis L. (суцвіття), тирличу жовтого Gentiana lutea L. (корені), скорцонери низької Scorzonera humilis L. (корені), ехінацеї пурпурової Echinacea purpurea L. (кореневища), аконіту молдавського Aconitum moldavicum Hogl. (корені), виготовлених способом мацерації на 40% етиловому спирті (Марченко М.М. і співавт., 2000). БКУ вводився тваринам у вигляді суспензії у фізіологічному розчині (Марченко М.М. і співавт., 2000; Ягодинец П.В. и соавт., 1996). Контролем вважали здорових тварин. Евтаназію здійснювали на 7-му, 14-у, 21-у доби після трансплантації карциноми Герена під легким ефірним наркозом.
Опромінення проводили протягом 7-ми днів (сумарна доза – 25,3мКл/кг) на рентгенівській діагностичній установці 12П6 („Lachema”, Чехія) при напрузі 80 кВ, силі струму 40мА, шкірно-фокусній віддалі 40 см, потужності дози 1Р/сек. (2,58Ч10-4 Кл/кг) з використанням фільтрів 0,5 мм Cu. Через одну добу після припинення опромінення щурі були поділені на дві групи: опромінені щурі (Р); опромінені щурі, яким на 1-у добу після припинення опромінення трансплантували карциному Герена (Р+П). Через тиждень після трансплантації частина опромінених пухлиноносіїв почала отримувати фітопрепарат (група Р+П+ФП), інша - 5,6-бензкумарин-5-урацил (Р+П+БКУ) за вищевказаними методикою та дозах. Евтаназію опромінених щурів здійснювали під легким ефірним наркозом на 1-у, 7-у, 14-у, 21-у доби після припинення опромінення, опромінених пухлиноносіїв – на 7-у, 14-у, 21-у доби.
Ядра виділяли з гомогенату печінки та пухлини методом диференційного центрифугування в середовищі STMK, очистку здійснювали із застосуванням неіонного детергенту тритону Х-100 з наступною промивкою STMK (Горюхина О.А., 1979). Постнуклеарною фракцією вважали супернатант, отриманий після осадження ядер. Хроматин виділяли за загально прийнятою методикою (Уманский С.Р. и соавт., 1975). Екстракцію гістонів з хроматину проводили 0,25н Н2SO4 (Бойков П.Я.,1983), лабільно зв'язаних з хроматином негістонових білків – 0,35М NaCl (Караванов А.А.,1983). Рівень карбонілювання білків оцінювали з використанням 2,4-динітрофенілгідразину (Oliver C.N.,1987), вміст білкових SH-груп – реагенту Елмана (Murphy M.E.,1989). Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry O.H. et all, 1951). Вміст полідезоксирибонуклеотидів розраховували за кількістю ДНК, що екстрагується в їх складі розчином з низькою іонною силою - 0,01ЧSSC (Мозжухина Т.Г.,1996). Вміст ДНК визначали спектрофотометрично (Спирин А.С.,1960). Інтенсивність Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК визначали за кількістю ПДН в умовах активування Ca2+,Mg2+-залежної ендонуклеази (Мозжухина Т.Г.,1996). Фракціонування хроматину здійснювали за загально прийнятим методом (Чихиржина Г.И.,1976). Відносний вміст фракцій визначали за кількістю в них ДНК в процентах від загальної ДНК. Визначення вмісту металів проводили методом атомно-адсорбційної полум'яної спектрофотометрії (Шамгунов А.П.,1989). Виділення РНК проводили за методом Шмідта і Тангаузера у модифікації (Трудолюбова М.Г., 1977). Визначення вмісту РНК проводили спектрофотометрично (Спирин А.С.,1960). Рівень біосинтезу РНК визначали за включенням міченого попередника [5,6- 3H]-уридину (питома активність 1,55 ТБк/ммоль). Загальну радіоактивність в дослідних пробах вимірювали рідинно-сцинтиляційним методом на лічильнику Бета-1 (Остерман М.А., 1983). Вірогідність різниці між групами тварин оцінювали з використанням критерію Стьюдента (Ойвин И.А.,1960).
Результати дослідження та їх обговорення
1. Окиснювальна модифікація білків хроматину клітин печінки і карциноми Герена щурів. Результати проведених досліджень показали, що ріст в організмі карциноми Герена супроводжується значною зміною вільнорадикального окислення білків хроматину в печінці, причому найістотніші відхилення відбуваються на початковому (7-а доба від перещеплення) та термінальному (21-а доба) етапах росту новоутворення. Так, рівень окиснення негістонових білків хроматину в ці періоди підвищений, про що свідчать обидва маркери окиснювальної модифікації (рис.1,2). Стосовно гістонів, то початковий етап росту карциноми супроводжується посиленням їх карбонілювання, а термінальний – збільшенням окиснення сульфгідрильних груп (рис.3,4).
Фракціоноване рентгенівське опромінення в сумарній дозі 25,3 мКл/кг призводить до зростання рівня окиснювальної модифікації білків хроматину клітин печінки в період 1-го тижня після припинення опромінення (рис. 1-4).
Рис. 1,2. Рівень карбонілювання (1) та вміст SH-груп (2) негістонових білків хроматину клітин печінки щурів
Трансплантація за умов попереднього опромінення карциноми Герена викликає інтенсифікацію процесів карбонілювання та окиснення SH-груп як гістонів, так і негістонових білків хроматину клітин печінки у порівнянні з неопроміненими пухлиноносіями, яке, однак, відмічається лише на 7-у добу росту новоутворення опромінених пухлиноносіїв.
Рис. 3,4. Рівень карбонілювання (3) та вміст SH- груп (4) гістонів хроматину клітин печінки щурів
Ріст карциноми супроводжується підвищенням рівня окиснення гістонів хроматину в її клітинах на усіх етапах експерименту (рис.5-6). Зростання вмісту карбонільних похідних негістонових білків протягом перших двох тижнів росту новоутворення змінюється сповільненням їх накопичення на третій тиждень (рис.7,8) що, з огляду на посилення окиснення тіолових груп негістонових білків, найімовірніше, зумовлено інтенсифікацією протеолізу.
Рис. 5,6. Рівень карбонілювання (5) та вміст SH- груп (6) гістонів хроматину клітин карциноми Герена щурів
У опромінених щурів початковий етап росту карциноми супроводжується підвищеним рівнем карбонілювання гістонів (на 37%) при збереженні однакового з неопроміненими тваринами рівня їх тіолових груп (рис.5,6). Щодо негістонових білків, то нами не виявлено достовірної зміни їх окиснювальної модифікації на 7-у добу росту новоутворення (рис.7,8). На противагу цьому, подальші етапи росту карциноми попередньо опромінених щурів супроводжуються зниженням кількості карбонільних похідних як гістонів, так і негістонових білків хроматину, підвищенням вмісту SH-груп негістонових білків у порівнянні з неопроміненими пухлиноносіями.
Рис 7,8. Рівень карбонілювання (7) та вміст SH-груп (8) негістонових білків хроматину клітин карциноми Герена щурів
Введення пухлиноносіям фітопрепарату викликає наближення ступеня окиснювальної модифікації білків хроматину в клітинах печінки до рівня контролю. На відміну від нормалізуючої дії фітозасобу на печінку пухлиноносіїв, двотижневе введення 5,6-бензкумарин-5-урацилу призводить до значного підвищення рівня окиснювальної деструкції білків хроматину печінки, що проявляється у зростанні кількості карбонільних похідних як гістонів (у 2,1 рази), так і негістонових білків (в 1,3 рази порівняно із пухлиноносіями, яким препарат не вводився), а також зниженні кількості їх тіолових груп. Дослідження впливу БКУ на АФК-залежне окиснення білків карциноми показало, що двотижневе введення даного засобу призводить до зменшення кількості сульфгідрильних груп білків хроматину.
Відомо, що окиснені білки хроматину, внаслідок зміни своєї конформації, стають доступною мішенню для дії ядерних протеіназ. Це призводить до порушення їх зв'язку з ДНК та зміну функціональної активності хроматину. Припускається, що за умов посиленого окиснення білків хроматину ДНК стає чутливіша до дії АФК та піддається руйнуванню з наступним гідролізом нуклеазами. Для перевірки цього припущення нами було проведено дослідження процесів ендонуклеолізу ДНК в ядрах печінки та карциноми Герена щурів-пухлиноносіїв.
2. Вміст полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) та інтенсивність Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК клітин печінки і карциноми Герена щурів. Одним із підходів до визначення ступеня фрагментації ДНК хроматину є дослідження інтенсивності Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК, адже саме цьому процесу належить провідна роль в міжнуклеосомній деградації ДНК, накопиченні ПДН та активації апоптозу (Уманский С.Р., 1996). Встановлено, що полінуклеотидний ланцюг ДНК клітин печінки на початковому етапі росту новоутворення залишається цілісним, тоді як на термінальному спостерігається накопичення ПДН поряд з незмінною інтенсивністю Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу (рис.9).
Рис. 9,10. Вміст ПДН (9) та динаміка виходу ПДН з ядер клітин печінки опромінених пухлиноносіїв в умовах активації Ca2+,Mg2+-залежної ендонуклеази (10).
Примітка: К – контроль, 1, 2, 3 – 7-а, 14-а, 21-а доби після трансплантації відповідно, *– статистично вірогідна відмінність у порівнянні з контролем.
Важливе значення в ініціації процесів окиснення ДНК та білків мають метали змінної валентності. На 21-у добу росту карциноми, поряд із підвищенням вмісту ПДН та окиснених білків, нами встановлено зростання вмісту заліза та міді в клітинних ядрах печінки (табл.1).
Таблиця 1
Вміст заліза та міді в клітинних ядрах печінки щурів, нмоль/мг білка; M±m, n=8
Показник Група Період експерименту, доба
1 7 14 21
Fe Контроль 27,2±2,3
П – 31,1±2,9 28,2±2,7 41,1±3,1*
Р 36,2±3,7* 37,4±3,3* 25,3±2,1 29,4±2,7
Р+П 36,9±3,3*,*** 31,4±2,8 37,3±3,7*,**
Р+П+ФП 22,7±1,9**** 34,9±3,2
Р+П+БКУ 31,9±3,1 70,3±5,6****
Cu Контроль 1,06±0,12
П – 1,65±0,12* 1,23±0,11 1,78±0,23*
Р 1,20±0,09 1,16±0,10 0,93±0,09 1,26±0,11
Р+П 1,60±0,14* 1,17±0,09 1,89±0,15*,**
Р+П+ФП 1,26±0,11 1,35±0,13****
Р+П+БКУ 1,60±0,13* 1,76±0,16*
Примітка: * - достовірна різниця порівняно з контролем, ** - достовірна різниця порівняно з Р, *** - достовірна різниця порівняно з П, **** - достовірна різниця порівняно з Р+П, Р?0,05.
Тижневе рентгенівське опромінення призводить до посилення Ca2+, Mg2+-залежного гідролізу хроматину клітин печінки здорових щурів, що супроводжується зростанням кількості ПДН, в період першого тижня після припинення опромінення (рис.9).
Дослідження даних показників в ядрах клітин печінки опромінених перед трансплантацією пухлиноносіїв та порівняння одержаних значень з показниками неопромінених пухлиноносіїв показало, що достовірна різниця між цими групами спостерігається лише для вмісту ПДН на початковому етапі росту новоутворення (першому тижні після трансплантації) та проявляється у зростанні даного показника в опромінених пухлиноносіїв (рис.9) Враховуючи те, що швидкість ендонуклеолізу у цих двох групах тварин не відрізняється (рис.10), імовірно, що ріст кількості ПДН за даних умов зумовлений не підвищенням ендонуклеазної активності хроматину, а пошкодженням ДНК активними формами кисню, дія яких може призводити до появи одно- та двониткових розривів полінуклеотидного ланцюга.
Вільнорадикальному пошкодженню ДНК та підвищенню вмісту ПДН може сприяти відмічене нами зростання карбонілювання білків хроматину клітин печінки на 7-у добу росту карциноми Герена опромінених щурів та зростання вмісту заліза, яке, через реакцію Фентона, забезпечує утворення гідроксильних радикалів. Імовірно, що посилення окиснювальної модифікації білків хроматину призводить до зміни їх конфігурації, що відображається на послабленні зв'язку з ДНК та може спричинити безперешкодну атаку полінуклеотидного ланцюга активними формами кисню.
Рис.11,12. Вміст ПДН (11) та динаміка виходу ПДН з ядер клітин карциноми Герена опромінених пухлиноносіїв в умовах активації Ca2+,Mg2+-залежної ендонуклеази (12).
Примітка: К – контроль, 1, 2, 3 – 7-а, 14-а, 21-а доби після трансплантації відповідно, * - статистично вірогідна відмінність у порівнянні з неопроміненими пухлиноносіями, Р?0,05.
Вміст ПДН та інтенсивність Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК ядер клітин карциноми Герена щурів залишається постійними протягом перших двох тижнів її росту. Третій тиждень після перещеплення характеризується підвищенням кількості продуктів гідролізу ДНК (рис.11). Вміст заліза в ядрах клітин карциноми є сталим протягом її розвитку, вміст міді поступово знижується (табл.2).
Таблиця 2
Вміст заліза та міді в клітинних ядрах карциноми Герена щурів, нмоль/мг білка;
M±m, n=8
Показник Група Період експерименту, доба
7 14 21
Fe П 34,1±3,2 35,1±3,4 38,6±3,7
Р+П 24,1±2,3* 20,5±2,1* 34,8±3,5
Р+П+ФП 21,2±1,8 29,4±2,3
Р+П+БКУ 47,1±4,4*,** 44,0±3,9*,**
Cu П 1,74±0,15 1,29±0,09 1,11±0,12
Р+П 1,24±0,10* 1,47±0,13 0,86±0,09*
Р+П+ФП 1,30±0,12 1,03±0,11
Р+П+БКУ 1,86±0,14 1,68±0,15**
Примітка: * - достовірна різниця порівняно з групою П, ** - достовірна різниця порівняно з групою Р+П, (Р?0,05)
Фракціоноване рентгенівське опромінення викликає сповільнення гідролізу ДНК пухлинних клітин в період активного їх росту, що проявляється в зниженні рівня ПДН та інтенсивності Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК, та зменшенню вмісту досліджуваних металів (рис.11,12, табл.2).
Введення пухлиноносіям фітопрепарату супроводжується зниженням вмісту ПДН, заліза та міді в ядрах печінки щурів-пухлиноносіїв. Однак, його застосування не впливає на процеси накопичення ПДН та інтенсивність Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу ДНК карциноми Герена. На відміну від цього, 5,6-бензкумарин-5-урацил викликає зростання швидкості Ca2+,Mg2+-залежного ендонуклеолізу та збільшення виходу ПДН, підвищення вмісту заліза та міді в ядрах клітин карциноми щурів (рис.9-12, табл.1-2).
3. Функціональна активність хроматину клітин печінки та карциноми Герена щурів-пухлиноносіїв. Припущення, що окиснення ДНК-зв'язаних білків може служити сигналом для компенсаторної інтенсифікації матричної активності через покращений доступ до ДНК ферментів реплікації та транскрипції, спонукало нас до визначення функціональної активності хроматину клітин печінки. Дослідження частки транскрипційно активного хроматину та інтенсивності синтезу РНК показало посилення функціональної активності хроматину клітин печінки на початковому етапі росту новоутворення (що проявлялось у зростанні цих показників), і зниження – на термінальному (рис.13,14).
Рис.13,14. Співвідношення вмісту фракцій хроматину (13) та включення 3[H]-уридину в РНК ядер (14) клітин печінки щурів
Отже, збільшення карбонільних похідних білків хроматину клітин печінки на початковому етапі росту новоутворення не призводить до руйнування ланцюга ДНК, а є сигналом для усунення білкового дисбалансу, викликаного трансплантацією та ростом пухлини. Найімовірніше, що вагому роль тут відіграє окиснення лінкерного гістону Н1, який, в силу свого амінокислотного складу та розташування в структурі хроматину, є найчутливішим до карбонілювання. Однак, треба наголосити на необхідності збереження структури корових гістонів, адже окиснення сульфгідрильних груп гістонових білків на термінальному етапі росту карциноми супроводжується гідролізом ДНК та зниженням функціональної активності хроматину клітин печінки нижче контрольного значення.
В групі попередньо опромінених пухлиноносіїв частка транскрипційно активного хроматину в період активного росту новоутворення не відрізняється від контролю, однак значно знижена у порівнянні з неопроміненими пухлиноносіями. Про пригнічення активності хроматину також свідчать результати дослідження включення міченого попередника 3[H]-уридину в РНК ядер печінки опромінених щурів-пухлиноносіїв – на початковому етапі росту карциноми Герена синтез РНК знижений у порівнянні з неопроміненим варіантом та не відрізняється від даного показника в групі опромінених здорових щурів (рис.14). Очевидно, що саме опромінення в дозі 25,3 мКл/кг викликає це зниження.
Отже, якщо у неопромінених пухлиноносіїв ми спостерігали компенсаторне посилення функціональної активності хроматину клітин печінки, то в групі попередньо опромінених щурів відмічається значне зниження синтезу РНК та зменшення частки транскрипційно активного хроматину клітин печінки на початковому етапі росту новоутворення. Треба зазначити, що відмінності для показників печінки груп опромінених та неопромінених пухлиноносіїв спостерігаються лише на початковому етапі росту карциноми. На подальших етапах експерименту динаміка досліджуваних процесів в клітинах печінки цілком зумовлена ростом новоутворення.
В клітинах карциноми Герена зміни досліджуваних показників функціонального стану хроматину спостерігаються лише на 21-у добу після трансплантації. В даний період відбувається зниження синтезу РНК (рис.16) та зменшення відносного вмісту білка у фракціях хроматину.
Попереднє опромінення призводить до зростання частки активного хроматину та підвищення включення міченого попередника в період перших двох тижнів росту карциноми (рис.15,16).
| 
