|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ
ім. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО
КІСТЕНЬ Олександр Григорович
УДК 579.841.42
Особливості взаємодії чистих і змішаних культур метанотрофних бактерій
з твердими матеріалами
03. 00. 07 — мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі мікробіологічних процесів на твердих
поверхнях Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України
Науковий керівник: доктор біологічних наук
КУРДИШ Іван Кирилович,
Інститут мікробіології і вірусології
НАН України, завідувач відділом
Офіційні опоненти:
Малашенко Юрій Романович, д. б. н., проф., чл.-корр. НАНУ, завідувач відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України
Ніковська Галина Миколаївна, к. б. н., ст. н. с. Інституту біоколоїдної хімії НАН України, м. Київ
Провідна установа:
Інститут колоїдної хімії і хімії води ім. А. В. Думанського НАН України, м. Київ
Захист відбудеться “ 17 “ лютого 1999 р. о 10 год на засіданні
спеціалізованої Вченої ради Д 26. 233. 01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України (252143, Київ – 143, вул. Заболотного 154, Інститут мікробіології і вірусології НАН України, зал засідань).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту
мікробіології і вірусології НАН України за адресою: 252143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.
Автореферат розісланий “ 15 “ січня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої Вченої ради
кандидат біологічних наук Л. М. Пуріш
Актуальність теми. Метанотрофні бактерії є важливою ланкою трофічного ланцюга у ряді екосистем [Курдиш и др., 1992; Курдиш и др., 1998а; Романовская и др., 1991;] і відіграють глобальну роль у циклі вуглецю в біосфері. Ці мікроорганізми мають унікальні біохімічні і фізіологічні властивості, що дозволяють їм утилізувати метан, а також розкладати ряд токсичних сполук: алкани [Strand et al., 1988], ароматичні спирти [Mountfort et al., 1990], трансформувати галогенпохідні вуглеводнів [Fitch et al., 1996; Hanson et al., 1995; Hashimoto et al., 1996; Okada et al., 1995], синтезувати цінні метаболіти [Proenca, Collaco, 1987]. Тому вивчення даної групи мікроорганізмів має не тільки фундаментальне, але й практичне значення, оскільки вони можуть стати основою ряду біотехнологій в галузі охорони довкілля від різних забруднень [Зобнина и др., 1993; Кадырова и др., 1994]. Перспективним є використання даних бактерій для зниження концентрації метану у вугільних шахтах [Курдиш и др., 1980 а]. Це дозволяє підвищити безпеку проведення гірських робіт [Мякенький, Курдиш, 1991; Мякенький и др., 1992].
В природних умовах більшість мікроорганізмів перебувають у закріпленому стані, що підвищує їх фізіологічну активність і надає клітинам певні переваги [Beveridge et al., 1997]. Тому в біотехнологічних процесах широко використовуються іммобілізовані мікроорганізми. Їх застосування дозволяє найбільш повно реалізувати біотехнологічний потенціал мікробних популяцій у безперервному режимі культивування, надає ряд переваг в управлінні процесом, а також дозволяє спростити виділення цільового продукту. Одним з найбільш ефективних і дешевих способів іммобілізації є закріплення клітин на різних носіях шляхом адгезії [Никовская, 1989;
Козляк и др., 1991].
Функціонування бактерій, в тому числі, метанотрофів в природних умовах або в штучних системах пов’язане з їх взаємодією з мікроорганізмами інших фізіологічних груп. Про вплив останніх на адгезію метанотрофних бактерій та колонізацію ними твердих матеріалів в літературі відомостей немає. Отримання даних про особливості такого співіснування, його вплив на процеси адгезії, колонізації твердих матеріалів і фізіологічну активність метанотрофів, безперечно є цікавим як з наукової точки зору, так і для застосування в практиці.
При розробці біотехнологій з використанням метанокислюючих мікроорганізмів, зокрема для зниження виділення метану у вугільних шахтах, необхідно враховувати вплив різних зовнішніх чинників на інтенсивність колонізації ними твердих матеріалів та фізіологічну активність цих мікроорганізмів. До таких чинників, насамперед, належать доступність метану і кисню та вологість довкілля. Проведення досліджень в цьому напрямку дозволило б розширити уявлення про функціонування метанотрофних бактерій на твердих поверхнях в природних і в штучних умовах, і виробити підходи для їх ефективного використання.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, викладені в дисертації, проводились в 1993 – 1997 рр. згідно робочого плану відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях по бюджетній темі № 21 / 163 “Закономірності іммобілізації чистих та змішаних культур мікроорганізмів на твердих матеріалах та принципи управління їх фізіологічною активністю”.
Мета і задачі дослідження. Мета дисертаційної роботи полягала у встановленні закономірностей адгезії метанотрофних бактерій до твердих поверхонь при їх функціонуванні в змішаних культурах з мікроорганізмами інших фізіологічних груп та колонізації ними цих матеріалів.
В роботі вирішувались такі задачі:
— дослідити особливості функціонування змішаних культур метанотрофів з мікроорганізмами інших фізіологічних груп;
— встановити закономірності адгезії метанотрофних бактерій в сумішах культур з представниками мікроорганізмів інших фізіологічних груп до гідрофільних і гідрофобних матеріалів;
— дослідити особливості колонізації твердих поверхонь чистими і змішаними культурами метанотрофів та визначити вплив умов функціонування мікроорганізмів на цей процес.
Наукова новизна отриманих результатів. На захист виносяться наступні нові результати.
Функціонування метанотрофних бактерій в змішаних культурах з представниками роду Bacillus супроводжується зростанням ростової активності метанотрофів та інтенсивності споживання ними метану. В змішаних культурах метанотрофів з бактеріями роду Pseudomonas дані показники знижуються.
Визначальними факторами адгезії досліджених мікроорганізмів до твердих матеріалів є гідрофобні властивості клітин, що чітко показано на прикладі метанотрофних бактерій, а також електрокінетичні властивості мікроорганізмів, які відігравали провідну роль в адгезії бактерій роду Bacillus. Мікроорганізми практично в однакових кількостях прикріплювались до гідрофільних (скло) та гідрофобних (полістирол) матеріалів. На адгезію окремих видів мікроорганізмів, що, поряд з метанотрофами, входять до складу суміші культур, як правило, впливає кожен з компонентів цих культур.
Метанотрофні бактерії в чистих і змішаних культурах інтенсивніше колонізують гідрофільні поверхні порівняно з гідрофобними. Найбільш активно цей процес протікає в живильному середовищі на відстані до 15 мм від границі поділу газоподібної і рідкої фази. Крім того, вони утворюють на твердих поверхнях мікроколонії. В присутності Bacillus megaterium інтенсивність колонізації твердих матеріалів Methylococcus capsulatus суттєво не змінювалась, трохи підвищувалась для Methylocystis parvus, а в присутності Pseudomonas putida у змішаних культурах вона уповільнювалась.
При незначних концентраціях метану (2 – 9 %) і високих, понад 29 % кисню у газовій фазі досліджені метанотрофні бактерії слабко колонізують як гідрофільні, так і гідрофобні матеріали. Підвищення вмісту першого компоненту у в газовій суміші до 17 – 29 %, як і наявність у ній кисню в концентраціях 5 – 29 % призводить до інтенсифікації процесу колонізації твердих поверхонь дослідженими метанотрофами.
Фізіологічна активність чистих та змішаних культур метанотрофних бактерій на твердих поверхнях досягає максимальних значень на 2 — 8 добу їх колонізації та при наявності на носії візуально видимої плівкової вологи. При підсиханні носія споживання метану мікроорганізмами суттєво зменшується.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено культиватор для тривалого вирощування чистих культур метанотрофних бактерій при використанні газової суміші у напівзамкнутому контурі.
Встановлені особливості функціонування метанотрофних бактерій в змішаних культурах з представниками мікроорганізмів інших фізіологічних груп. Це дозволяє прогнозувати особливості функціонування даних бактерій на твердих поверхнях при їх біотехнологічному застосуванні. Визначені оптимальні параметри ряду факторів навколишнього середовища, що забезпечують інтенсивну колонізацію твердих матеріалів метанотрофними бактеріями та їх високу фізіологічну активність.
Отримані результати досліджень можуть бути використані у біотехнологіях, що розробляються на основі іммобілізованих метанотрофних бактерій і направлені на отримання цінних метаболітів, знешкодження токсичних похідних метану і його гомологів, зниження вмісту метану в газових середовищах, зокрема у вироблених просторах вугільних шахт.
Особистий внесок здобувача. Досліження фізіологічної активності метанотрофів у змішаних культурах з типовими представниками мікрофлори вугільних шахт, гідрофобних властивостей мікроорганізмів, частина досліджень по адгезії і колонізації чистими і змішаними культурами виконані у співавторстві з с. н. с., к. б. н. А. О. Рой. Електроповерхневі властивості мікроорганізмів визначені сумісно з с. н. с., к. т. н. А. С. Гордіенко. Решта досліджень виконані особисто автором. Автор висловлює подяку всім, хто допомагав у виконанні його дисертаційної роботи.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на I (VIII) Установчому з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993р.), на звітних конференціях-конкурсах наукових робіт Інституту мікробіології і вірусології НАН України (1994, 1996 рр.).
Публікації. По темі дисертації опубліковані 6 статей і 1 теза.
Структура та об’єм дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (2 розділи), експериментальної частини з 4 розділів власних досліджень, заключення, висновків і списку використаної літератури, що містить 310 джерел. Робота викладена на 113 сторінках машинопису, ілюстрована 6 таблицями, 22 рисунками (в т. ч. 3 фотографіями).
ЗМІСТ РОБОТИ
Розділ 1. Поширення та фізіологічні властивості метанотрофних
бактерій
В розділі представлені літературні дані про розповсюдження метанотрофних бактерій в природі, їх морфолого-культуральні властивості та трофічні потреби.
Розділ 2. Властивості поверхні мікроорганізмів та колонізація
ними твердих матеріалів
Розглянуті особливості будови клітинної поверхні мікроорганізмів з позицій формування електрокінетичного заряду та гідрофобно-гідрофільних властивостей. Проаналізовано літературні відомості щодо впливу цих чинників на процес адгезії мікроорганізмів до поверхонь твердих матеріалів. Розкриті особливості колонізації таких матеріалів, її значення з екологічної та практичної точки зору. Показані відмінності функціонування між іммобілізованими та вільноживучими клітинами.
Розділ 3. Матеріали і методи
Дослідження проводили на двох видах метанотрофних бактерій, що суттєво відрізнялися за властивостями клітинної поверхні [Гордиенко и др., 1997]: Methylococcus capsulatus ВСБ-874 і Methylocystis parvus OBBP; двох видах спороутворюючих бактерій: протеолітично активному Bacillus megaterium ІМВ-475 [Смирнов и др., 1980] і штамі Bacillus subtilis 9, що характеризувався низькою протеолітичною активністю та одному штамі роду Pseudomonas [Рой и др., 1990]. Культивування метанотрофів здійснювали у відйомно-доливному культиваторі [Кистень, Курдиш, 1998].
Електрокінетичний потенціал бактерій визначали методом мікроелектрофорезу [Глоба, Гордиенко, 1980].
Гідрофобні властивості мікроорганізмів оцінювали за їх розподілом у біфазній системі “суспензія мікроорганізмів — н-гексадекан” [Rosenberg et al., 1980].
В дослідженнях фізіологічної активності метанотрофів у змішаних культурах з типовими представниками мікрофлори вугільних шахт використовували відмиті від метаболітів суспензії чистих культур метанотрофів та інших видів бактерій в об’ємних співвідношеннях 1 : 1, 10 : 1 і 100 : 1. Єдиним джерелом вуглецевого живлення та енергії для мікроорганізмів був метан.
Фізіологічну активність метанотрофних бактерій оцінювали по споживанню метану і кисню методом газохроматографічного аналізу [Курдиш и др., 1993], а також по прирісту чисельності бактерій у суспензії.
Для іммобілізації мікроорганізмів використовували частинки скла чи гірської породи вугільних шахт, або скляні і полістиролові пластини.
Адгезію бактерій до поверхні даних матеріалів оцінювали за різницею вмісту клітин у суспензії до і після її взаємодії з твердим матеріалом, або за кількістю клітин, адгезованих до скляних і полістиролових пластин методом прямого підрахунку.
При вивченні процесу колонізації чистими і змішаними культурами метанотрофних бактерій з іншими мікроорганізмами зразки з адгезованими клітинами інкубували в умовах, елективних для метанотрофів. Вплив компонентного складу газової суміші на процес колонізації твердих матеріалів метанотрофними бактеріями досліджували, варіюючи початковою концентрацією метану при сталій концентрації кисню, або навпаки.
Вплив вологості на споживання метану іммобілізованими метанотрофними бактеріями вивчали, використовуючи частинки гірської породи з різною початковою вологістю.
Фізіологічну активність чистих і змішаних культур метанотрофних бактерій і інших мікроорганізмів при колонізації ними твердих поверхонь досліджували на розробленій стендовій установці, періодично визначаючи в колонках з мікроорганізмами інтенсивність споживання метану і кисню в процесі тривалого експерименту.
Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали відповідними методами варіаційної статистики [Лакин, 1968].
Розділ 4. Фізіологічна активність метанотрофних бактерій у чистих і
змішаних культурах
Встановлені взаємовідносини в змішаних культурах, що представлені типовою мікрофлорою вугільних шахт. До їх складу, поряд з метанотрофами, входили бацили і псевдомонади. Вивчено вплив двох штамів роду Bacillus — протеолітично активного B. megaterium та B. subtilis, який характеризувався слабкими літичними властивостями, на ростову активність і споживання метану метанотрофами. Показано, що присутність цих гетеротрофів спричиняла стимулюючий вплив на дані показники. В таких умовах кількість бацил майже не змінювалась.
Інша картина спостерігалась у змішаних культурах метанотрофів з
P. putida. В даному випадку відбувалось зниження ростової активності
M. capsulatus і M. parvus, а також зменшення кількості спожитого ними метану. Одержані результати дозволяють прогнозувати особливості функціонування даних бактерій на твердих поверхнях при їх біотехнологічному застосуванні.
Розділ 5. Адгезивні властивості чистих метанотрофних культур і їх
сумішей з іншими мікроорганізмами
Вивчені особливості адгезії чистих культур до гідрофільних і гідрофобних матеріалів. Найбільшою здатністю до адгезії характеризувався
M. parvus (рис. 1).
Рис. 1. Залежність адгезії (а) мікроорганізмів до частинок скла розміром
1–2 мм від терміну їх взаємодії (t):
1 — M. parvus, 2 — M. capsulatus, 3 —
B. megaterium, 4 — P. putida, 5 —
B. subtilis. Умови досліду: дисперсійне середовище — фосфатний буфер (0,15 M, pH – 7,0), t — 20 °C
При взаємодії цих мікроорганізмів з поверхнею скла за 1 годину прикріплювалось 65 % клітин. В значно менших кількостях адгезувались до даного матеріалу M. capsulatus і B. megaterium — 40,9 і 35,0 % за 1 годину відповідно.
Встановлено, що виявлені відмінності в адгезії досліджених мікроорганізмів обумовлені різницею у властивостях поверхні їхніх клітин. Як відомо [Козляк и др., 1991; Busscher, Weerkamp, 1987; Hermansson et al.,
1982 ], найбільш істотно на адгезію впливають гідрофобні і електроповерхневі властивості взаємодіючих поверхонь. Особливо помітним в адгезії бактерій M. parvus був внесок гідрофобності поверхні їх клітин (табл. 1). Не дивлячись на високий негативний заряд (– 28 мВ), ці мікроорганізми завдяки їх високій гідрофобності найбільш інтенсивно прикріплювалися до твердого матеріалу. Бактерії M. capsulatus характеризувались гідрофільною поверхнею. Не зважаючи на значно менший негативний заряд (– 14 мВ), ці мікроорганізми прикріплювались до скла в значно менших кількостях. Такі результати свідчать про суттєву роль фактору гідрофобності в процесі адгезії метанотрофів до твердих поверхонь.
Таблиця 1
Характеристика деяких властивостей поверхні мікроорганізмів
Примітки: 1. дисперсійне середовище фосфатний буфер (0,15 M, pH 7,0)
2. “0”— при даних умовах більшість клітин заряду не мають.
Інші бактерії — B. megaterium, B. subtilis і P. putida також характеризувались гідрофільною поверхнею. На прикладі цих мікроорганізмів чітко проглядалась роль електрокінетичного потенціалу в прикріпленні клітин до твердих поверхонь: бактерії, що мали менший заряд клітин, в більших кількостях адгезувались до твердих матеріалів.
Таким чином, висока адгезійна здатність досліджених мікроорганізмів, насамперед, обумовлена гідрофобністю поверхні, а при низьких значеннях цього показника прикріплення клітин визначається величиною їхнього заряду. В умовах експериментів гідрофобність твердих матеріалів практично не впливала на адгезію різних видів бактерій: майже всі вони практично в однакових кількостях прикріплювались як до гідрофобних, так і до гідрофільних матеріалів.
Вивчені закономірності адгезії метанотрофних бактерій при їх функціонуванні у присутності інших мікроорганізмів (табл. 2). Так, не дивлячись на те, що у сумішах культур M. capsulatus і B. megaterium кількість метанотрофів задавали на порядок більше, ніж бацил, чисельність адгезованих до твердих матеріалів клітин цих двох видів відрізнялась незначно. Подібна картина спостерігалась і в сумішах культур M. capsulatus і B. subtilis. В даному випадку, можливо, має місце модифікація поверхні клітин бацил метаболітами мікроорганізмів, зокрема, метанотрофа. Це призводить до зміни її властивостей та сприяє підвищенню адгезії бацил.
Таблиця 2
Кількість метанотрофів (чисельник, клітин / мм2) та інших мікроорганізмів (знаменник, клітин / мм2), адгезованих до твердих матеріалів із сумішей
суспензій культур
Примітки: 1. Оптична густина суспензії M. parvus складала 0,05 од; інших мікроорганізмів — 0,8 од.
2. Умови досліду: живильне середовище для метанотрофів, t — 20° C, 3 год.
У сумішах культур M. capsulatus і P. putida навпаки, чисельність клітин останньої культури, прикріплених до скла і полістиролу була значно нижчою у порівнянні з такою для M. capsulatus. В той же час, останній краще адгезувався до цих матеріалів, особливо, полістиролу. Оскільки в чистій культурі M. capsulatus в більших кількостях прикріплювався до гідрофільної поверхні, таке явище може бути викликане сорбцією метаболітів псевдомонади на поверхні полістиролу та сприяти підвищенню його гідрофільності, і, як наслідок, обумовлювати зростання адгезії M. capsulatus до нього.
Значні відмінності спостерігали в адгезії M. parvus і B. megaterium в сумішах їх культур. Так, кількість клітин M. parvus, адгезованих до твердих матеріалів, перевищувала майже на 2 порядки чисельність клітин гетеротрофа. Можливо, це обумовлено високою спорідненістю M. parvus до твердих поверхонь, що в першу чергу займав більш доступні для адгезії ділянки на поверхні твердих матеріалів, погіршуючи можливості для прикріплення інших мікроорганізмів, у даному випадку, для B. megaterium.
Таким чином, на адгезію мікроорганізмів в змішаних культурах, як правило, впливає кожен з компонентів цих культур.
Розділ 6. Колонізація твердих матеріалів чистими та змішаними
культурами метанотрофних бактерій
Показано, що чисті культури метанотрофних бактерій у відповідних умовах активно колонізують тверді матеріали з різною гідрофобністю. Після 6 діб інкубування на твердих матеріалах дані мікроорганізми утворюють крупні агрегати і мікроколонії. Чисельність M. capsulatus при цьому досягає десятків тисяч (рис. 2, а), а M. parvus — сотень тисяч клітин на мм2 поверхні зразків.
В той же час при інкубуванні B. megaterium (рис. 2, б) і P. putida в умовах, елективних для метанотрофних бактерій, відмічали зниження їх чисельності як на поверхні зразків, так і в живильному середовищі, що пояснюється відсутністю джерел живлення в таких умовах для гетеротрофів.
Процес колонізації скла бактеріями M. capsulatus в змішаних культурах з B. megaterium вповільнювався, в той же час інтенсивність колонізації полістирола цим метанотрофом не змінювалась порівнянно з чистою культурою (рис. 3, а). M. parvus у змішаних культурах з даним гетеротрофом дещо краще колонізував тверді матеріали, особливо полістирол. В той же час чисельність прикріплених клітин B. megaterium швидко знижувалась і в кінці терміну інкубування вони мікроскопічно не виявлялись. Це пов’язано, на нашу думку, з нестачею необхідної кількості метаболітів метанотрофів, необхідних для підтримання життєдіяльності бацил. Функціонування
P. putida у змішаних культурах з метанотрофами, навпаки, вповільнювало процес колонізації поверхонь цими бактеріями (рис. 3,б). Однак кількість клітин даного гетеротрофа поступово зростала, що може свідчити про споживання ним метаболітів, що синтезуються в процесі метаболізму метану метанотрофними бактеріями.
Рис. 2. Чисельність чистих культур бактерій M. capsulatus (а) і
B. megaterium (б) (N1) на поверхні скла (1) і полістиролу (2), а також в суспензії (N2), (3) в залежності від часу інкубування. Умови досліду: метано-повітряна суміш (3 : 7), t – 37 °C
Рис. 3. Чисельність бактерій M. capsulatus (1–3) і B. megaterium (4–6) (а), та M. parvus (1–3) і P. putida (4–6), (б) в залежності від часу інкубування: на твердих матеріалах (N1) – склі (1,4) і полістиролі (2,5); а також в суспензії (N2) – (3,6). Співвідношення об’ємів взятих суспензій 10 : 1. Умови досліду: метано-повітряна суміш (3 : 7), t – 37 °C (а) і 30 °C (б)
Вивчені закономірності колонізації метанотрофними бактеріями твердих матеріалів в залежності від компонентного складу газової суміші. Встановлено, що процес колонізації дослідженими метанотрофами як гідрофільних, так і гідрофобних субстратів інтенсивно протікав у широкому діапазоні концентрацій метану і кисню (рис. 4, 5). При вмісті в газовій
Рис. 4. Колонізація поверхні скла (1) і полістиролу (2) бактеріями
M. parvus у газовій та рідкій фазі в залежності від концентрації CH4 в газовій суміші і відстані (h), у мм, до границі поділу “рідина – газ” (0), “+” — над рівнем рідини, “–” — занурена частина. Умови досліду: початкова концентрація кисню — 14 %, t – 30 °C
суміші незначних (2 – 5 %) концентрацій метану і кисню колонізація твердих матеріалів метанотрофними бактеріями відбувалась порівнянно слабко. Це, ймовірно, обумовлено лімітуванням процесу даними субстратами. Підвищення їх вмісту понад 9 % супроводжується більш інтенсивною колонізацією твердих матеріалів метанотрофами. Однак, при концентраціях кисню, які перевищували 28 %, спостерігали інгібування даного процесу.
Встановлено, що колонізація твердих матеріалів метанотрофними бактеріями протікає як на поверхнях, що занурені в живильне середовище, так частково і на тих, що знаходяться в газовій фазі. Суттєвої різниці в колонізації скла і полістиролу цими мікроорганізмами не спостерігалось. Найбільш інтенсивно цей процес протікав на частині зразків, зануреній у живильне середовище на відстані не більше 15 мм від границі поділу “рідина – газ”.
При застосуванні іммобілізованих метанотрофних бактерій у біотехнологічних процесах одним з найважливіших факторів, що визначатимуть фізіологічну активність цих мікроорганізмів, є вологість оточуючого середовища. Нами встановлено, що найбільш інтенсивно цей процес відбувався
| 
