|
Київський національний університет
Імені Тараса Шевченка
Трохименко Ганна Григорівна
УДК 577.3:636.4
Осмотичні властивості ооцитів
та яйцеклітин свині
03.00.02 - біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Харківському біотехнологічному центрі УААН.
Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук,
старший науковий співробітник
Безуглий Микола Дмитрович,
науковий директор
Інституту тваринництва УААН
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник,
Костерін Сергій Олексійович,
заступник директора з наукової роботи
та завідувач відділу біохімії м'язів
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна
НАН України,
доктор біологічних наук, професор
Кнігавко Володимир Гілярієвич,
завідувач кафедри біофізики, інформатики
та медичної апаратури Харківського державного
медичного університету
МОЗ України
Провідна установа: Інститут проблем кріобіології та
кріомедицини НАН України, м. Харків
Захист дисертації відбудеться "22" жовтня 2001 року о 14.00 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка
(Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського
національного університету
(01003, Київ-33, вул. Володимирська, 58)
Автореферат розісланий " 7 " вересня 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Давидовська Т.Л.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. У теперішній час успішно проводиться кріоконсервація статевих клітин та ембріонів багатьох видів тварин та людини, за виключенням ооцитів і яйцеклітин свині, відсоток життєздатності яких після відтавання залишається низьким. У літературі зустрічаються лише окремі дані щодо особливостей їхнього заморожування, морфофункціональних та біохімічних параметрів (Dobrinsky J.R., 1996, 1998, 2000; Youngs C.R., 1994; Isachenko V., 1998). Пошук способів заморожування ооцитів свині носить здебільшого емпіричний характер, що потребує тривалих та дорогих експериментів. Майже на усіх етапах процесу кріоконсервації дослідник стикається як з позитивним, так і негативним впливом осмотичних ефектів. Але безперечно, що осмотичними властивостями клітин визначаються головні закономірності їхньої реакції на дію низьких температур (Гордієнко Є.О., Пушкарь М.С., 1994; Пушкарь М.С. та ін, 1995).
З огляду на це стає актуальним визначення таких біофізичних характеристик ооцитів та яйцеклітин свині як осмотичні параметри, проникність до води і кріопротекторів, а також вивчення процесів дегідратації для оптимізації методів їхньої кріоконсервації.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота зв'язана з виконанням тематичного плану на 1996 – 2000 рік Інституту тваринництва УААН і Харківського біотехнологічного центру та сумісними дослідженнями з університетом штату Айова (США). Здобувач була виконавцем за темами "Розробити біотехнологічні методи створення сільськогосподарських тварин з заданими господарсько-корисними ознаками (№ держреєстрації 0196U011388) та "Розробити метод кріоконсервації ембріонів свиней" (№ держреєстрації 0196U011390).
Мета і задачі досліджень. Метою даного дослідження, спрямованого на пізнання фізико-хімічних та біофізичних механізмів підвищеної чутливості ооцитів та яйцеклітин свині до дії низьких температур, було вивчення їхніх осмотичних властивостей і трансмембранного переносу води та кріопротекторів.
Для досягнення поставленої мети були вирішені такі задачі:
1. Визначити осмотичний склад і геометричні параметри ооцитів та яйцеклітин.
2. Дослідити кінетичні закономірності транспорту води крізь цитоплазматичну мембрану ооцитів і яйцеклітин.
3. Визначити коефіцієнти проникності цитоплазматичної мембрани до кріопротекторів.
4. Із використанням фізико-математичної моделі дослідити процеси дегідратації і внутрішньоклітинної кристалізації ооцитів та надати біофізичну інтерпретацію цих явищ.
Об'єкт дослідження – ооцити та яйцеклітини свині.
Предмет дослідження – осмотичний склад ооцитів та яйцеклітин свині, проникність до води і кріопротекторів, дегідратація ооцитів свині.
Методи дослідження. У роботі використовувались морфологічний метод оцінки клітин, культивування in vitro для дозрівання ооцитів до стадії метафази ІІ. За методом волюмометрії визначалися осмотичний склад ооцитів та яйцеклітин свині, проникність до води і кріопротекторів. За методами осмометрії та термометрії визначалися осмотичний тиск та температура розчинів, відповідно. При використанні математичного моделювання та варіаційного аналізу розраховували коефіцієнти проникності та проводили аналіз процесу дегідратації. Результати опрацьовували за методами статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначені параметри проникності цитоплазматичних мембран ооцитів та яйцеклітин свині до води і кріопротекторів. В порівняльному аспекті проаналізовані видові особливості осмотичного складу та мембранної проникності. Виявлено тенденцію до зміни осмотичного складу протягом раннього ембріогенезу свині.
У дисертаційній роботі вперше проаналізовано взаємозв'язок між геометричними та осмотичними характеристиками ооцитів та яйцеклітин.
Зроблений комплексний узагальнюючий аналіз процесу дегідратації ооцитів свині при повільному заморожуванні на підставі використання фізико-математичної моделі дегідратації та надана біофізична інтерпретація цього процесу.
Практичне значення одержаних результатів. Результати, що були одержані, можуть бути використані з метою оптимізації технології насичення та виведення кріопротекторів, а також для розробки методу заморожування статевих клітин свині.
Подані практичні рекомендації щодо використання безеквілібраційного методу вітрифікації для заморожування ооцитів свині.
Результати теоретичних розрахунків та дані експериментів використовуються при підготовці спеціалістів з біофізики Харківського національного університету у курсах кріобіотехнології та біології розвитку.
Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно провела експерименти з дослідження осмотичної реакції ооцитів, культивування in vitro для дозрівання ооцитів до стадії метафази ІІ, морфо-функціональну оцінку клітин. Серія дослідів з визначення осмотичного складу ооцитів, яйцеклітин та ембріонів свині проведена разом із співробітниками Харківського біотехнологічного центру та університету штату Айова. Здобувачем самостійно отримані результати теоретичних розрахунків, проведені аналіз дегідратації та статистична обробка експериментальних даних, їхнє обговорення та порівняння з даними, відомими для статевих клітин інших видів ссавців. Із загальних наукових експериментів і публікацій дисертант використовувала за згодою співавторів тільки свою частину результатів. Усі розділи дисертації та текст автореферату написані особисто здобувачем.
Апробація результатів дисертації. Апробація проведена на:
засіданні вченої ради Харківського біотехнологічного центру;
конференціях молодих вчених, Інститут тваринництва УААН, січень 1998 року, листопад 2000 року;
- міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 70-річчю з дня народження Ф.І. Осташко “Розвиток біотехнології розмноження та штучного осіменіння сільськогосподарських тварин в Україні: здобутки та проблеми“, Харків, 27-29 січня 1998 року;
- III міжнародній конференції з використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок в генетико-селекційних дослідженнях, 19-22 жовтня, 1999 р., м. Одеса;
- міжнародній конференції, присвяченій 50-річчю першої успішної ембріопересадки у свиней і 100-річчю з дня народження автора цієї технології професора О.В. Квасницького, 15-18 травня 2000 року, Київ;
- міжнародному симпозіумі “Біоетика на порозі ІІІ тисячоліття”, Харків, 4-7 жовтня 2000 року;
- звітній науково-технічній конференції Луганського державного аграрного університету за 2000 рік, 18-19 січня 2001 року, Луганськ.
Публікації. Результати дисертації опубліковані у 6 статтях у наукових журналах, 2 матеріалах і тезах конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, трьох розділів, що присвячені огляду літератури, опису методів досліджень та результатів досліджень з їх обговоренням, висновків і практичних рекомендацій, списку використаної літератури, 4 додатків. Вона містить 123 сторінки друкованого тексту, 9 таблиць, 37 рисунків, 23 сторінки списку використаних джерел, 16 сторінок додатків. Список літератури складається з 201 джерела, в тому числі 143 на іноземних мовах. Загальний обсяг роботи – 162 сторінки.
Основний зміст Роботи
Матеріали і методи дослідження
Дослідження проводились на базі Харківського біотехнологічного центру. Робота виконувалась з 1997 по 2000 рік.
Досліди проводились на ооцитах та яйцеклітинах свині. Усі маніпуляції з біооб'єктом - пошук, відмивання та підготовка до експериментів проводилися за загальноприйнятими методиками (Манк М., 1990). Оцінка життєздатності ооцитів та яйцеклітин проводилась морфологічно, за результатами короткочасного культивування in vitro або за результатами осмотичної реакції у гіпо- та гіпертонічних розчинах.
Проникність цитоплазматичних мембран до води та кріопротекторів вивчалась за допомогою методу волюмометрії (Безуглий М.Д., 1984). Досліди проводились у гіпертонічних розчинах NaCl осмолярністю 0.300, 0.322, 0.337, 0.414, 0.553, 0.74 та 1.102 осМ. Осмотичний тиск розчинів визначався за допомогою термометра Бекмана або осмометра. Використовували такі кріопротектори, як діметилсульфоксид (ДМСО) та гліцерин у концентрації 1.2 М. Досліди проводилися у діапазоні температур +4 … + 37 0С, в залежності від мети дослідження.
Для розрахунку чисельних параметрів використовували фізико-математичну модель процесів транспорту Кедем-Качальського (Kedem O., Katchalsky A., 1958), модель осмотичної поведінки клітини у розчинах проникаючих та непроникаючих речовин М.Д. Безуглого (Безуглий М.Д., 1984), методи апроксимації та варіаційного аналізу.
Результати дослідження та їх обговорення
Одними із головних особливостей клітин, що впливають на процес кріоконсервації на всіх її етапах та характеризують їх як з точки зору цитології, так і кріобіології є осмотичний склад та осмотичні властивості. До осмотичного складу відносяться кількість осмотично активної (вільної) води в цитоплазмі, неактивних та непроникаючих речовин. Визначення цих величин є необхідним для аналізу кінетичних закономірностей транспорту води і зміни її кількості протягом ембріогенезу, вивчення процесу кристалізації цитоплазми протягом заморожування.
На першому етапі наших досліджень визначали осмотичний склад і геометричні характеристики ооцитів та яйцеклітин.
Для кількісного визначення шуканих параметрів використовували модель одиночної ізольованої клітини як абсолютного осмометра (Безуглий М.Д., 1995).
Зміна відносного клітинного об'єму в гіпертонічних розчинах для ооцитів свині показана на рис. 1. Експериментальні дані відповідають закону Вант-Гоффа у діапазоні досліджуваних концентрацій. Дійсно, як випливає з рисунку, клітини поводяться як абсолютні осмометри у широкому діапазоні концентрацій, залежність відносного об'єму від концентрації є лінійною. Аналогічна залежність одержана для яйцеклітин свині.
Результати розрахунків показали, що відносний об'єм осмотично неактивних речовин (Vb), вільної води (VH2O) і непроникаючих речовин (Vi) в ооцитах свині, у середньому, складають 33.02±2.17; 66.08±2.17; 0.71±0.03%, відповідно (Табл. 1).
Рис. 1. Графік зміни відносного об'єму ооцитів свині у гіпертонічних розчинах NaCl у координатах Вант-Гоффа (n = 28):
Vс – загальний об'єм клітини;
Сiso – концентрація ізотонічного розчину;
Сe – концентрація гіпертонічного розчину.
Таблиця 1
Деякі осмотичні параметри ооцитів та яйцеклітин свині (M±m)
Примітка. a - У цій таблиці однаковими суперскриптами позначені величини, які вірогідно не відрізняються одна від одної.
Як можна бачити, ооцити та яйцеклітини свині за осмотичним складом вірогідно не відрізняються. Однак, має місце тенденція до збільшення осмотично активної води з розвитком клітини та зменшення осмотично неактивних речовин, що підтверджується даними для подальшого ембріогенезу. Розчинені речовини займають біля 1% відносного клітинного об'єму.
Склад ооцитів та яйцеклітин свині з погляду осмосу приблизно такий самий, як ооцитів та яйцеклітин раніше вивчених видів ссавців (корови, вівці, кролика), за виключенням яйцеклітин миші (Р<0.05) (Безуглый М.Д, 1995; Szell A., 1989; Van Blerkom J., 1991). Отже, осмотичний склад цих клітин не може бути причиною їхньої підвищеної чутливості до дії низьких температур.
В цілому, у популяції ооцитів об'єм осмотично неактивних речовин і об'єм вільної води приймали значення від 18% до 35% і від 64% до 81%, відповідно. Це свідчить, що між клітинами однієї стадії розвитку є істотні відмінності. Ці попередні дані підтверджують висновок О.В. Квасницького та Н.А. Мартиненко про різну якість статевих продуктів. Так, ооцит, об'єм запасних речовин якого тільки 18% на початковій стадії розвитку, може не бути забезпеченим необхідними речовинами для нормального росту, тоді як ооцити з кількістю осмотично активних речовин 25-30% і вище будуть мати необхідні умови для подальшого розвитку. Тому нами були вивчені індивідуальні властивості ооцитів і яйцеклітин свині та варіація цих параметрів у популяції.
За зображеннями клітин, записаними у базі даних ПЕОМ, визначались геометричні характеристики ооцитів свині, такі як діаметр, товщина зони пелюциду, загальний об'єм, абсолютний об'єм осмотично неактивних речовин та об'єм перивітелінового простору (для яйцеклітин), і варіація цих параметрів (табл. 2).
Виявлено, що між загальним об'ємом ооцитів і абсолютним об'ємом осмотично неактивних речовин існує лінійний позитивний кореляційний зв'язок (коефіцієнт кореляції К = 0,709 з вірогідністю Р < 0.001). Отже, загальний об'єм клітини залежить від об'єму, що займають живильні речовини та внутрішньоклітинні органели. І ці характеристики клітин можуть бути включені до діапазону морфологічних і цитологічних ознак, за якими можна визначити спроможність ооцитів до розвитку in vitro і подальшому заплідненню.
Різні параметри клітин характеризувалися різними коефіцієнтами варіації. (див. таблицю 2). Результати свідчать, що геометричні характеристики ооцитів та яйцеклітин свині мають нижчий рівень варіації, ніж їхні осмотичні характеристики. Існує гіпотеза про вплив варіації індивідуальними параметрів біооб'єктів на рівень збереженості після відтавання (Горбунов Л.В., 1996). Отже, за цією гіпотезою та нашими даними осмотичні характеристики будуть здійснювати більший вплив у порівнянні з геометричними. А лінійний розмір клітини (діаметр) з низьким рівнем варіації можливо враховувати як кількісний показник для оцінки її стадії розвитку.
Характер розподілу також впливає на величину схоронності біологічного матеріалу після кріоконсервації. Нами були побудовані варіаційні криві розподілу геометричних та осмотичних параметрів ооцитів та яйцеклітин свині, розраховані коефіцієнти асиметрії й ексцесу, більшість з яких не перевищувала табличні значення, що вказувало на нормальність розподілу. Також були пояснені причини виникнення відхилень та деяких протиріч з даними інших дослідників. У цих роботах показана ненормальність розподілів майже усіх геометричних та осмотичних характеристик ембріонів та статевих клітин ссавців. Це протиріччя може бути пояснене. Авторами вивчались геометричні характеристики суцільної популяції клітин без попередньої оцінки їхньої життєздатності. Перед нами була поставлена інша мета: вивчити розподіли саме тих клітин, які використовуються у експерименті. Виявилося, що при використанні штучного відбору, а в нашому випадку статевих клітин із яскраво вираженою життєздатністю, спостерігається нормальний розподіл параметрів. У той самий час природний відбір - загальна популяція - в окремих випадках призводить до відмінних від нормального розподілів.
Таблиця 2
Варіація осмотичних та геометричних характеристик ооцитів та яйцеклітин свині
Таким чином, у результаті першої частини досліджень виявлено, що характер осмотичної реакції ооцитів та яйцеклітин свині подібний такому для інших видів ссавців, а значення осмотичних параметрів співпадають за порядком величини. Отже, осмотичний склад ооцитів і яйцеклітин свині не є основною причиною підвищеної чутливості цих клітин до дії низьких температур.
На другому етапі ми досліджували кінетичні закономірності транспорту води крізь плазматичні мембрани ооцитів та яйцеклітин. З використанням даних по осмотичному складу та геометричних параметрах були визначені коефіцієнти проникності цитоплазматичної мембрани ооцитів та яйцеклітин свині до води при 22, 14 та 50С. За методом варіаційного аналізу рівнянь Кедем-Качальського, використовуючи фізико-математичну модель поведінки клітин у непроникаючих розчинах, крізь масиви експериментальних значень зміни відносного об'єму з часом були проведені розраховані криві, які найменшим чином відхилялися від експериментальних даних (рис. 2).
Рис. 2. Кінетика зміни відносного об'єму ооцитів свині з часом у 750 мосМ NaCl на ФСБ при 22oС (o, n=23), 14oС (, n=21), 5oС (D, n=9).
Так визначався середній час осмотичної реакції клітини у розчині хлориду натрію, а також коефіцієнт проникності цитоплазматичних мембран ооцитів та яйцеклітин свині до води, які характеризували дану криву.
Визначені коефіцієнти проникності цитоплазматичної мембрани ооцитів свині до води при 5, 14 та 220С представлені у табл. 3.
Таблиця 3
Вплив температури на кінетичні характеристики проникності мембран
ооцитів свині (М±m).
Примітка. a, b, c - У таблиці різними суперскриптами позначені дані, які відрізняються з вірогідністю не менше 0.95.
Для яйцеклітин свині при кімнатній температурі проникність мембрани до води, в середньому, складала 1.89±0.13 мкм3/(мкм2ґхвилґатм), а середній час осмотичної реакції дорівнював 66.12±4.34 с.
Був вивчений також характер розподілу коефіцієнтів проникності цитоплазматичної мембрани яйцеклітин свині. Для цього також була розрахована густина імовірності розподілу, побудоване її графічне зображення та визначені коефіцієнти асиметрії та ексцесу. Одержані значення Ax = 0.609, а Ех = - 0.567. Емпірично визначені величини ексцесу та асиметрії для прийнятого рівня значущості не перевищують табличні значення, отже, характер розподілу коефіцієнтів проникності цитоплазматичних мембран яйцеклітин свині нормальний. Як і у попередніх дослідженнях, простежується результат штучного відбору, при використанні якого на клітини менше впливає природна біологічна різноякісність гамет.
Температурну залежність коефіцієнта проникності вивчали в діапазоні позитивних температур відповідно до рівняння Арреніуса:
де Lp(To) – коефіцієнт проникності при температурі To;
 - енергія активації перенесення води крізь клітинну мембрану;
R – універсальна газова стала.
У координатах Арреніуса залежність коефіцієнта проникності від температури є лінійною (рис. 3).
Рис. 3. Графік Арреніуса для коефіцієнта проникності цитоплазматичної мембрани ооцитів свині до води.
Аналіз температурної залежності в координатах Арреніуса дає значення енергії активації транспорту води DЕact = 89.53±4.03 кДж/моль або 21.37±0.96 ккал/моль.
Значення коефіцієнта проникності до води ооцитів та яйцеклітин свині на порядок менше, ніж для еритроцитів та сперміїв ссавців (Papanek T.H., 1978; Drevius L.O., 1971; Curry M. R. et. al.,, 2000). Однак, значення коефіцієнтів проникності до води ооцитів та яйцеклітин свині при 220С більше, ніж у 2 рази перевищують дані для яйцеклітин та ембріонів ссавців (корови, миші, кролика, вівці), представлені в літературі, з вірогідністю Р < 0.05 (Безуглий М.Д., 1995; Leibo S.P., 1980; Agca Y. et. al., 1997; Van der Auwera I. et. al., 1992). Також, коефіцієнт проникності цитоплазматичної мембрани яйцеклітин свині після дозрівання in vitro вищий, ніж у ооцитів (Р < 0.05), що узгоджується з літературними даними для ооцитів та яйцеклітин корови, миші, кози (Agca Y. et. al., 1997; Van der Auwera I. et. al., 1992; Le Gal F. et. al., 1994; Kasai M., 1995; Utsumi K., 1996). Значення енергії активації транспорту води крізь цитоплазматичну мембрану ооцитів свині у зоні позитивних температур найвище із відомих для ооцитів, яйцеклітин та ембріонів інших видів тварин (Р < 0.05), що може бути пов'язане з конформаційними перебудовами цитоплазматичної мембрани у зоні позитивних температур.
Загальновідомо, що на збереженість ембріонів при заморожуванні суттєво впливають параметри проникності цитоплазматичних мембран до кріопротекторів. Вони визначають загальний вид осмотичної реакції і розміри максимальних змін клітинних об'ємів, їх необхідно враховувати як при насиченні клітини кріопротектором, так і при його видаленні.
Наступним етапом було визначення проникності ооцитів свині до кріопротекторів. Нами була вивчена осмотична реакція ооцитів свині у розчинах гліцерину і діметилсульфоксиду (ДМСО), визначені коефіцієнти проникності цитоплазматичної мембрани ооцитів свині до вищевказаних кріопротекторів та обчислені коефіцієнти відбиття при кімнатній температурі 22 оС.
З огляду на істотну різницю за часом осмотичної реакції та проникності до кріопротекторів, вивчення зміни відносного об'єму розбивали на два етапи. На першому етапі відбувається швидкий стиск клітин, зумовлений виходом води. На другому - повільне, у порівнянні з першим етапом, зрівноважування клітин за рахунок транспорту кріопротектора. На рис. 4 та 5 наведені графіки зміни відносного клітинного об'єму у розчинах гліцерину та діметилсульфоксиду (ДМСО).
Об'єм клітин зменшувався до мінімального у розчині діметилсульфоксиду за 1.2 – 1.6 хвил., а в розчині гліцерину - за 1.8 - 3 хвил. Час зрівноважування об'єму клітини у 1.2 М розчинах ДМСО і гліцерину значимо відрізняється. Якщо ооцити свиней відновлюють свій об'єм у розчині ДМСО за 20 - 30 хвил., то в розчині гліцерину цей процес відбувається протягом 3 – 3.5 годин (див. рис. 4, 5).
Різниця у часі відновлення об'єму може бути пояснена різними механізмами транспорту кріопротектору крізь цитоплазматичні мембрани ооцитів свині. Аналіз зміни клітинного об'єму ооцитів свині при зануренні у 1.2 М розчини гліцерину і ДМСО вказує на достатньо високу проникність цитоплазматичних мембран до ДМСО. Гліцерин можна віднести до повільно проникаючих у клітину в порівнянні з водою речовин.
| 
