|
ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. Ю.ФЕДЬКОВИЧА
ШЕЛИФІСТ
Антоніна Євгенівна
УДК:577.113.5+582.724.6
МОЛЕКУЛЯРНО-БІОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДІВ ПІДРОДИНИ PRUNOIDEAE FOSKE
03.00.04 – біохімія
А в т о р е ф е р а т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Чернівці – 2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Чернівецькому державному університеті ім. Ю.Федьковича, Міністерство освіти України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Костишин Степан Степанович, завідувач кафедри біохімії та експери-ментальної екології, ректор Чернівецького державного університету ім. Ю.Федьковича.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Штеменко Наталія Іванівна, Дніпропетровський державний університет, завідувач кафедри біофізики та біохімії;
кандидат біологічних наук, доцент Бутницький Іван Миколайович, Тернопільський державний педагогічний університет ім. Володимира Гнатюка, завідувач кафедри ботаніки.
Провідна установа – Львівський національний університет ім. І.Франка, кафедра фізіології рослин.
Захист дисертації відбудеться “16” лютого 2000 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому державному університеті ім. Ю.Федьковича (58012, м.Чернівці, вул. Коцюбинського, 2).
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Чернівецького державного університету ім. Ю.Федьковича (58012, м.Чернівці, вул. Л.Українки, 23).
Автореферат розісланий “14 ” січня 2000 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої
ради, доцент Г.П.Копильчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Застосування методів сучасної біохімії, молекулярної біології та біотехнології дає можливість глибше проникнути в розуміння процесів, що відбуваються в рослинному організмі. Аналіз білків, РНК і ДНК, направлений на з’ясування видових особливостей будови генотипів, набуває тепер великого значення. Значної уваги потребує також з’ясування закономірностей перебігу в організмі процесів, викликаних дією стресових факторів, що пов’язані з інтенсивним розвитком науково-технічного прогресу. Створення модельних систем відіграє важливу роль у розв’язанні цих завдань.
Для встановлення філогенетичних зв’язків інтенсивно застосовуються аналіз білків насіння [Судьина и др., 1982; Schirone et. al.,1991; Лесневич, 1998] та порівняння повторюваних одиниць геному, що включають в себе гени рРНК [Yakura et. al., 1983; Sun et. al., 1994]. Так, неодноразово були відмічені між- та внутрішньовидові відмінності останніх як за довжиною, так і за структурою.
Одне з центральних місць у системі квіткових рослин займає родина Rosaceae Juss. Питання її систематики залишається остаточно не з’ясованим. Особливо це стосується підродини Prunoideae Foske. [Тахтаджян, 1987]. За межами досліджень залишається і з’ясування впливу абіогенних факторів на деревні рослини цієї родини, більшість яких є представниками підродини Сливових. Тому виявлення можливостей застосування легкорозчинних білків насіння та рДНК для вирішення питань систематики підродини Prunoideae, розробка методики мікроклонального розмноження видів роду Prunus L. і з’ясування можливості використання її для різних біохімічних досліджень є актуальним і необхідним.
Зв’язок роботи з науковими темами. Робота проводилась з 1991 по 1999 роки в межах науково-дослідних робіт держбюджетних тематик кафедри біохімії та експериментальної екології Чернівецького державного університету ім. Ю.Федьковича: “Організація та функціонування геному в зв’язку з гетерозисом у рослин” (№ держреєстрації 01860060702), “Розробка способів отримання і оцінки селекційно-цінних форм сільськогосподарських рослин на основі біотехнологічних підходів” (№ держреєстрації 0193U023681), “Вивчення експресії геному сільськогосподарських рослин під дією хімічних та інших стресових факторів” (№ держреєстрації UA01002496Р), “Дослідження анатомії генів гібридних та інбредних (вихідних) форм рослин” (№ держреєстрації 0194U028026).
Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було виявлення та використання молекулярно-біохімічних критеріїв для таксономічних досліджень підродини Prunoideae та визначення можливості застосування системи in vitro як модельної при вивченні впливу абіогенних факторів на рослини. Відповідно до вказаної мети поставлено такі завдання:
- З’ясувати закономірності розподілу альбумінової та глобулінової фракцій білків насіння сливових в денатуруючих умовах у поліакриламідному гелі та виявити особливості організації їх рДНК.
- Розробити методику мікроклонального розмноження видів роду Prunus в культурі in vitro та визначити можливість використання її при дослідженні впливу іонів важких металів на рослини.
- Визначити закономірності впливу іонів стронцію, нікелю та кадмію на інтенсивність включення 3Н-лейцину в цитозольні білки сливи сорту ‘Стенлі’ (вид P. domestica L.) в умовах in vitro.
Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено, що представникам підродини властива присутність Hind III-сайтів в області субповторів, довжина яких становить ≈300 пн, та Dra I-сайту в положенні 1,5 тпн від гену 18S рРНК наступного повтору.
У роботі вперше досліджено легкорозчинні білки насіння підродини Prunoideae на рахунок можливого застосування їх для вирішення проблем систематики. Показано, що для реалізації цієї мети можливим є використання альбумінової фракції; на підставі електрофоретичного розподілу цих білків у поліакриламідному гелі розраховано генетичні дистанції між досліджуваними видами.
Розроблена система мікроклонального розмноження представників роду Prunus в культурі in vitro. Доведена можливість використання її як модельної при проведені різноманітних досліджень, пов’язаних з вивченням впливу іонів важких металів на деревні рослини. Встановлено, що за ступенем токсичності для P. domestica досліджувані елементи необхідно розміщувати таким чином: Sr2+<<Ni2+<Cd2+.
Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень легкорозчинних білків насіння та повторюваних одиниць рДНК є на біохімічному рівні доповненням характеристики підродини Prunoideae. При з’ясуванні якісного складу альбумінів насіння виявлені білкові компоненти, що можуть бути використані як біохімічні маркери окремих родів та підродини в цілому.
Розроблена система мікроклонального розмноження in vitro видів роду Prunus може широко застосовуватись в сільському господарстві а також як модельна для вивчення впливу іонів важких металів на деревні рослини.
Особистий внесок здобувача. Дисертантка самостійно підібрала та опрацювала літературні джерела, виконала експериментальну частину роботи, за одержаними експериментальними даними підготувала до друку наукові роботи. Аналіз та обговорення матеріалу, викладеного в дисертаційній роботі, проведено спільно з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були викладені на всесоюзних конференціях молодих вчених (Уфа, 1989, 1991), I Всесоюзній планово-звітній конференції “Генна і клітинна інженерія” (Москва, 1991), Всесоюзній конференції “Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу” (Черновцы, 1991), Міжнародній конференції “Навколишнє середовище і здоров’я” (Чернівці, 1993), конференції молодих вчених (Київ, 1996), VI з’їзді Українського біохімічного товариства (Київ, 1992), ІІ з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993) та VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей та 10 тез доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (5 розділів), матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення (4 розділи), висновків і списку використаних джерел (279 джерел). Робота викладена на 132 сторінках машинописного тексту, має у своєму складі 24 рисунки і 4 таблиці.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури висвітлено можливість використання у філогенетичних дослідженнях як маркерів білків насіння та рДНК, дана характеристика культури in vitro як методу розмноження деревних порід та висвітлено деякі аспекти фітотоксичного впливу іонів важких металів, зокрема стронцію, нікелю та кадмію.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об’єктами досліджень були представники різних родів підродини Prunoideae: з роду Prunus (P. spinosa L., P. cerasifera Ehrh. (сорти ‘Оленька’ і ‘Лавина’), P. domestica (угорки: 'Угорка крупна солодка', 'Угорка ювілейна', 'Стенлі'; ренклоди: 'Ренклод ранній', 'Кірк'; яєчні сливи: 'Яєчна жовта пізня')). З роду Persica Mill. досліджували вид P. vulgaris Mill. (нектарин 'Нектаред 4' і опушені сорти 'Яркий' та 'Фаворіта Моретіні'). Представниками роду Amygdalus L. були A. сommunis L., A. nana L., A. ledebouriana Schlecht., роду Padus Mill. - P. maackii (Rupr.) Kom., P. serotina (Ehrh.) Ag., роду Louiseania Carr. - L. triloba (Lindl.) Pachom.
В культуру in vitro вводили P. americana March., P. spinosa L., P. cerasifera (‘Оленька’ та ‘Лавина’) i P. domestica (угорки: ‘Стенлі’, ‘Анна Шпет’, ‘Угорка італійська’; ренклоди: ‘Кірк’, ‘Ренклод ранній’; яєчні сливи: ‘Яєчна жовта пізня’).
Визначення видів дано за Черепановим [Черепанов, 1981].
Матеріал для дослідження був наданий нам співробітниками Центрального ботанічного саду НАН України (м. Київ), УкрНДІ садівництва (м. Київ), Придністровської дослідної станції УкрНДІ садівництва (м. Чернівці) та ботанічного саду Чернівецького державного університету, за що висловлюємо подяку.
Дослідження впливу іонів важких металів на інтенсивність включення міченого попередника у цитозольні білки проводили на рослинах P. domestica сорту ‘Стенлі’, які вирощували в культурі in vitro.
Картування рДНК. Сумарну ДНК виділяли за описаними методами і осаджували в присутності цетавлону [Маниатис и др., 1984, Нактинис и др., 1987]. Додаткову очистку препаратів проводили за допомогою її інкубації з розчином РНК-ази. Для картування рДНК використовували рестриктази Eco RI, Eco RV, Bam HI, Xba I, Hind III, Dra I. Розщеплення ДНК рестриктазами, розділення продуктів гідролізу проводили за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, перенесення фрагментів ДНК на капронові фільтри та їх гібридизацію з міченими зондами проводили за описаними методами [Маниатис и др., 1984]. Як молекулярні зонди використовували 18S-рРНК та 25S-рРНК кукурудзи, отримані раніше в нашій лабораторії.
Електрофоретичне дослідження водо- та солерозчинних білків на-сіння. Фракціонування білків проводили з обезжиреного насіння за модифікованим методом Осборна. Електрофорез білків проводили в денатуруючих умовах за модифікованим методом Леммлі [Laemmli, 1970] у 7% концентруючому та 12,5% розділяючому гелі [Fairbanks et. al., 1990]. Забарвлення білкових зон проводили 0,05% розчином Coomassie blue R-250 в 12,5% ТХО.
Молекулярну масу поліпептидів розраховували на комп’ютері IBM PC/AT за складеною нами програмою. Денситограми гелів отримували на денситометрі “Appraise” фірми “Beckman” (США). Результати обробляли методом багатомірної статистики [Мандель, 1988].
Розробка методики мікроклонального розмноження видів роду Prunus в культурі in vitro. Мікроклональне розмноження рослин роду Prunus в культурі in vitro проводили за загальноприйнятою схемою: введення в культуру, яке включає процес стерилізації; власне мікроклональне розмноження; вкорінення експлантатів [Калинин, 1980]. Укорінені експлантати переносили в умови відкритого грунту
Визначення нагромадження важких металів у тканинах рослин методом атомно-адсорбційного аналізу. Мінералізацію проб проводили методом сухого озолення за ГОСТ-85. Вміст металів у розчині визначали на атомно-адсорбційному спектрофотометрі з полум’яною автоматизацією типу ААСФ-115-М1 (п/я В 2613, СРСР) [Хавезев и др., 1983].
Активність синтезу цитозольних білків оцінювали за включенням 3Н-лейцину в цитозольні білки, які виділяли за описаним методом [Дощанов и др., 1981] з незначними модифікаціями [Скоупс, 1985]. Радіоактивність вимірювали на рідинно-сцинтиляційному лічильнику “БЕТА-1” в толуольному сцинтиляторі ЖС-107.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Побудова рестриктних карт та характеристика на їх основі родинних відносин в підродині Prunoideae. Остаточно не з’ясована систематика роду Prunus і підродини Prunoideae в цілому є чималою перешкодою для успішного проведення селекційного процесу. Тепер уже доведено доцільність використання для розв’язання таких питань досліджень структури молекул ДНК. Особливого поширення набуло використання рДНК як моделі для вивчення молекулярної організації, еволюції та таксономії вищих рослин [Hilu et. al., 1992; Hsiao et. al., 1995; Soltis et. al., 1997].
Розташування сайтів впізнавання в рДНК досліджуваних видів вираховували опираючись на літературні дані [Rogers et. al., 1987; Самигулин и др., 1994] та виходячи з довжин фрагментів, отриманих при обробці ДНК різними рестриктазами.
У досліджуваних нами рослин виявлено різні довжини повторів. Вони коливаються в межах 7,9-11,4 тпн. Особливою властивістю плодових є існування у більшості представників по декілька варіантів повторів. Із всіх об’єктів дослідження тільки для черемх було виявлено те, що всі повтори мають велику довжину. Для сортів аличі характерним є присутність двох довгих і одного короткого повторів. Різниця між розмірами довгих повторів незначна. Вона коливається в межах 300-700 пн.
Взаєморозміщення в кодуючих ділянках сайтів впізнавання рестриктаз Eco RI, Dra I, Xba I та трьох сайтів Bam HI співпадає з такими для більшості дводольних рослин [Yakura et. al., 1984, Борисюк и др., 1989]. З літературними даними [Hsiao et. al., 1995] узгоджується і будова та розміри внутрішніх транскрибованих спейсерів.
Усі відмінності, що виявлено, стосуються міжгенного спейсера (МГС), який можна розділити на чотири області (рис. 1). Перша з них (А) починається від 3''-кінця гену 25S РНК і сягає положення 6,2 тпн. У деяких із досліджуваних видів тут знаходиться перший сайт впізнавання рестриктазою Hind III. У цій області лише у терену присутній сайт Xba I в положенні 6,1 тпн, який розщеплюється ферментом тільки в частині повторів рДНК.
Другу область (В) утворюють сайти рестриктази Hind III, кількість яких варіює у різних рослин. Часто вони розщеплюються ферментом лише в частині повторів рДНК. Розміри області В коливаються у широких межах. Її величиною визначається розмір повтору. Сайти впізнавання рестриктазою Hind III здебільшого розміщені в положеннях 6,2; 6,5; 6,8; 7,1 тпн від 5'' кінця гену 18S рРНК. На відміну від сливових, у інших представників родини (яблуні та груші) сайти впізнавання рестриктазою Hind III розташовані у ділянці МГС, що передує гену 18S рРНК [Самигулин Т.Х., 1994]. Порівняння локалізації Hind III-сайтів у досліджуваних видів дає можливість зробити припущення, що довжина субповторів сливових становить ≈”300 пн.
X EI EV D EI 6,2 -1,9 -1,1
-
B B B’ A B C D
Рис. 1. Схема будови МГС довгих повторів рДНК представників підродини Prunoideae.
Область С починається від першого Dra I-cайту в положенні -1,9 тпн від гену 18S рРНК і закінчується приблизно за 1,1 тпн до гену 18S рРНК наступного повтору. За останню точку прийнято сайт впізнавання рестриктазою, розташований найближче до гену (Eco RI-сайт в положенні -1,1тпн). Він присутній у коротких повторах аличі та мигдалів. Характерною особливістю Dra I-сайтів, не зважаючи на різницю в кількості, є їх локалізація в одних і тих же місцях. Це -1,9; -1,7 та -1,5 тпн від 5'' кінця гену 18S РНК. Особливою стабільністю локалізації характеризується останній. Він присутній в усіх об’єктах нашого дослідження.
Область D граничить безпосередньо з геном 18S рРНК і її розміри становлять 1,1 тпн. Підсумовуючи все це, логічно буде припустити, що присутність різної кількості Hind III-сайтів у МГС через проміжки кратні 300, наявність Dra I-сайтів (особливо у положенні –1,5 тпн від 5′-кінця гену 18S рРНК), розміри областей А і D можна використовувати як молекулярні маркери видів підродини Prunoideae.
На підставі розшифрування радіоавтографів побудовано рестриктні карти для всіх об’єктів дослідження (рис. 2).
Все сказане вище щодо будови рДНК стосується міжгенних спейсерів довгих повторів. Подібна структура зберігається тільки в дещо коротших повторах аличі та черемх. Міжгенні спейсери коротких повторів мають зовсім іншу специфіку будови. В обох коротких повторах мигдалів присутні сайти рестриктаз Xba I та Eco RI в положенні -1,3 і -1,1 тпн відповідно від гену 18S рРНК наступного повтору (див. рис. 2). Такий же Eco RI-сайт виявлено і в коротких повторах сортів аличі. Слід відзначити, що всі сайти рестриктаз, які присутні в коротких повторах, розщеплюються ферментами повністю. Іншою особливістю коротких повторів рДНК є повна відсутність в МГС сайтів впізнавання всіх шести використаних рестриктаз. Така картина спостерігається у персиків.
Рис. 2. Локалізація сайтів рестрикції Bam HI (B), Dra I (D), Eco RI (EI), Eco RV (EV), Hind III (H) та Xba I (X) в рДНК. Значком (’) відзначені сайти, стійкі до дії ферментів у частини рДНК.
Електрофоретичне дослідження білків насіння. Для таксономії дводольних рослин різними авторами використовуються як аналіз сумарних білків насіння, так і окремих їх фракцій, зокрема альбумінів та глобулінів [Судьина и др., 1982; Fairbanks et. al., 1990; Schirone et. al., 1991]. Оскільки при дослідженні дводольних у більшості випадків використовують глобулі-нову фракцію, спочатку нами була досліджена саме ця фракція білків насіння. Визначено, що для кожного об’єкту дослідження характерний свій електрофоретичний спектр глобулінів. Відмінності виявлено навіть у різних сортів одного виду. Оскільки для багатьох представників підродини Prunoideae характерним є явище несумісності [Жуковский, 1971; Власюк, 1989], аналіз електрофоретичних профілів глобулінів сливових привів до висновку про недоцільність використання цієї фракції білків насіння у таксономічних дослідженнях підродини Prunoideae.
Основна увага в подальших дослідженнях була зосереджена на вивченні електрофоретичного розподілу альбумінової фракції білків насіння. На його основі побудовано схеми електрофореграм (рис. 3). Виходячи із закономірностей інтенсивності забарвлення білкових смуг та їх кількості на одиницю площі, електрофоретичні доріжки можна розбити на чотири області. Їх детальне вивчення дало можливість встановити закономірності, властиві кожному з досліджуваних таксонів. Так, на електрофоретичному профілі терену колючого чітко виділяються за товщиною та інтенсивністю забарвлення смуги, що відповідають білкам з молекулярними масами 37,1; 40,7; 42,5 та 52,7 кД. Компоненти першої білкової групи виявлені у великій кількості у більшості досліджуваних видів. Тільки на електрофоретичному профілі альбумінової фракції білків насіння черемхи пізньої вони відсутні. Електрофоретична смуга, що відповідає білкам з молекулярною масою 52,7 кД, характерна практично для всіх досліджуваних представників підродини Сливові. Встановлено також, що дана електрофоретична смуга набуває максимальної інтенсивності забарвлення у всіх видів роду Prunus. Білкові препарати інших досліджуваних видів містять ці компоненти в середній кількості. У виду P. serotina білки присутні у незначній кількості. У всіх об’єктів дослідження виявлено компоненти, молекулярні маси яких становлять 62,4; 69,5 та 74,7 кД. Однак, у таксономічних дослідженнях, ймовірно, слід надавати увагу тільки першій білковій групі, оскільки інші дві містяться в більшості препаратів у слідових кількостях.
Рис. 3. Схема електрофореграм спектрів альбумінів насіння представників підродини Prunoideae: 1 - P. spinosa, 2 - P. cerasifera, 3 - P. domestica (a - угорки, b - яєчні сливи, c - ренклоди), 4 - P. vulgaris (а - опушені, b - нектарини), 5 - A. communis, 6 - P. serotina.
Виявилося, що електрофоретичні доріжки альбумінів різних сортів аличі тотожні. Їх характерною особливістю є відсутність білкових компонентів з молекулярними масами 40,7 та 42,5 кД, властивих для всіх представників роду Prunus. Крім цього, з’являється інтенсивно забарвлена смуга, що відповідає білкам з молекулярними масами 49,9 кД. Якісний склад альбумінової фракції білків насіння P. cerasifera найменший.
Для всіх досліджуваних сортів угорок (P. domestica) характерним є наявність смуги середньої товщини та інтенсивності забарвлення, яка відповідає білковим компонентам з молекулярною масою 59,6 кД. Їм характерними є також три інтенсивно забарвлені смуги, що відповідають білкам з молекулярними масами 40,7; 42,5 та 43,6 кД. Співставлення картин розподілу білків у гелі для різних сортів дає можливість встановити, що розподіл суміші альбумінів яєчної сливи тотожний до такого угорок. Відмінності, виявлені для ренклодів, пов’язані з різною інтенсивністю забарвлення окремих смуг, а саме: максимальної інтенсивності забарвлення набувають білки з молекулярною масою 62,7 кД. Інтенсивне забарвлення смуги, яку утворюють білки з молекулярною масою 52,7 кД, властиве не тільки ренклодам, але й іншим сортам P. domestica, однак, тільки у цієї групи сортів їх вміст найбільший. Вміст низькомолекулярних білків у ренклодів менший. Всі інші білки, що знаходяться в діапазоні молекулярних мас 32,9-73,8 кД, містяться в білковому препараті у помірних кількостях. Описані закономірності особливо чітко простежуються при порівнянні денситограм у всіх досліджуваних сортів виду P. domestica (рис. 4).
Серед електрофоретичних профілів альбумінів персиків за інтенсивністю забарвлення особливо виділяються смуги, що відповідають білкам з молекулярними масами 37,1 та 51,5 кД. Для решти смуг, розташованих у діапазоні молекулярних мас від 32,9 до 73,8 кД, цей показник приблизно однаковий. Як і у випадку з сливами, білкові профілі нектаринів відрізняються від таких у опушених персиків лише за інтенсивністю забарвлення смуг.
Високу подібність до персиків як в електрофоретичному розподілі білків у гелі, так і за ступенем забарвлення смуг виявляє електрофоретичний профіль альбумінів мигдалю. Білки з молекулярними масами 37,1 та 43,6 кД також містяться в білковому препараті в найбільших кількостях.
Найсуттєвіша різниця відзначена в будові електрофоретичного профілю P. serotina. Із всіх смуг особливою інтенсивністю забарвлення виділяються ті, що утворюються білками з молекулярними масами 48,1; 50,9; 67,6 та 70,1 кД. Перша з них характерна тільки для цього виду. Тільки у черемхи пізньої виявлені білкові компоненти з молекулярними масами 28,9 та 30,8 кД. Крім цього високою інтенсивністю забарвлення характеризується електрофоретична смуга, яку утворюють білки з молекулярною масою 31,4 кД. На відміну від усіх об’єктів дослідження у P. serotina відсутні білкові компоненти з молекулярною масою 19,9 кД. Оскільки найбільш сталою є структура треку в межах малих молекулярних мас, то можна стверджувати, що такий розподіл низькомолекулярних білків властивий підродині в цілому.
Рис. 4. Денситограми альбумінів насіння сортів P. domestica, де 1 – ‘Стенлі’, 2 – ‘Яєчна жовта пізня’, 3 – ‘Кірк’.
Електрофоретичний профіль альбумінів насіння P. serotina, хоча й має спільне з профілями інших досліджуваних таксономічних груп, у знач-ній мірі від них відрізняється. Ймовірно, це свідчить про найбільшу філоге-нетичну віддаленість роду Padus від усіх досліджуваних родів підродини Prunoideae. Серед родів Prunus, Persica та Amygdalus достатньо подібними є електрофоретичні профілі альбумінів P. domestica, P. vulgaris та P. serotina.
Значну подібність виявляють електрофоретичні профілі білкових компонентів різних видів роду Prunus. Повна подібність електро-форетичного профілю яєчної сливи до такого угорок дає підстави відносити цю групу слив до угорок. Виявлені відмінності доріжок ренклодів обумовлюють необхідність виділяти ці сорти в окрему групу. Це узгоджується з твердженням представників класичної систематики про необхідність розподілу виду P. domestica на підвиди [Жуковский, 1971].
На основі отриманих електрофореграм нами розраховано генетичні дистанції між представниками досліджуваних родів (табл. 1) (коеф. Рао [Мандель, 1988]).
Таблиця 1.
Ступінь спорідненості (%) видів підродини Prunoideae
Одержані результати не тільки не суперечать сучасному тлумаченню систематики плодових, а навпаки, доповнюють його. Таким чином, можна підсумувати, що молекулярні дані та морфологічні характеристики, допов-нюючи одне одного, є суттєвими для отримання філогенетичних висновків.
Мікроклональне розмноження видів роду Prunus. У результаті проведеної серії експериментів було з’ясовано, що для деревних плодових при введенні в культуру найкращим джерелом експлантатів є пахові брунь-ки, найбільш придатним періодом – лютий - березень. Було визначено, що на всіх етапах роботи з культурою in vitro видів роду Prunus необхідно вико-ристовувати антиоксиданти, зокрема аскорбінову кислоту. У результаті про-веденого пошуку був підібраний склад поживних середовищ для мікрокло-нального розмноження видів роду Prunus (табл. 2). Основою для їх приготу-вання служить середовище Мурасиге-Скуга (MС) [Murashige, Skoog, 1962].
Встановлено, що попередня висадка вкорінених мікроживців у перліт дає найкращі результати. Надалі рослини пересаджують в суміш перліт×торф×грунт (1:1:1) і тільки після цього - безпосередньо у грунт.
Вивчення впливу іонів стронцію, нікелю та кадмію на біосинтез цитозольних білків у P. domestica в культурі in vitro. Відомо, що процеси біосинтезу білка у живій клітині чутливо реагують на зміни в оточуючому середовищі. Практично усі білки цитозольної фракції кодуються ядерним геномом і мають активний метаболізм [Скоупс, 1985]. Саме тому такі хімічні забруднювачі, як іони стронцію, нікелю та кадмію, можуть впливати на інтенсивність їх синтезу.
Таблиця. 2.
Склад середовищ, що використовуються для введення в культуру in vitro
та мікроклонального розмноженні видів роду Prunus
На першому етапі необхідно було встановити концентрації важких металів у середовищі, які б: 1) не викликають суттєвих змін у рослин; 2) по-мітно порушують розвиток експлантатів; 3) значно порушують ріст та розви-ток, а також приводять до часткової загибелі рослин у кінці четвертого тижня культивування. Вони становили для стронцію 1) 4,8⋅10-5; 2) 56,8⋅10-5; 3) 113,2⋅10-5, для нікелю – 1) 4,2⋅10-5; 2) 23,1⋅10-5; 3) 69,2⋅10-5 і для кадмію – 1) 2,1⋅10-5; 2) 12,7⋅10-5; 3) 25,4⋅10-5 (у М/л).
На другому етапі досліджено вплив іонів металів на інтенсивність включення міченого попередника в цитозольні білки. Нами виявлено значне підвищення цього показника (майже у 2-3 рази) у рослин, які вирощували на середовищах з найменшими концентраціями іонів металів (рис. 5). Подаль-ше збільшення кількості металу в тканинах рослини приводить до значного зменшення інтенсивності включення міченого попередника в цитозольні білки. Особливо чітко це простежується за дії іонів кадмію. Не так різко знижується досліджуваний показник у випадку зі стронцієм та нікелем, хоча і доходить майже до відповідності контрольному варіанту. Однак, не зважаючи на те, що процеси синтезу в клітині і відбуваються з достатньо високою інтенсивністю, фізіологічний стан рослин значно погіршується.
Значне зниження, порівняно з контролем, інтенсивності протікання процесів синтезу при найвищих концентраціях металу в середовищі свід-чить, що кількість полютанту, яка акумулюється в рослині в даному випадку, є критичною, тобто подальше його збільшення призведе до загибелі росли-ни. До такого висновку приводить і аналіз морфофізіологічного стану рослин.
Співставлення визначених нами параметрів дає право стверджувати, що для P. domestica досліджувані метали за ступенем токсичності можна розмістити в такий ряд Sr2+<<Ni2+< Cd2+.
Рис. 5. Залежність інтенсивності включення міченого попередника 3Н-лейцину в цитозольні білки P. domestica сорту ‘Стенлі’ від здатності рослин акумулювати іони стронцію, нікелю та кадмію в культурі in vitro (M±m; n=6).
ВИСНОВКИ
- Виявлена спільність у будові рДНК представників підродини Prunoideae. У міжгенному спейсері в області субповторів, розміри яких становлять ≈300 пн, виявлено декілька сайтів впізнавання рестриктазою Hind III. В положенні -1,5 тпн від 5′-кінця гену 18S рРНК наступного повтору у всіх об’єктів дослідження присутній Dra I-сайт.
- Аналіз глобулінової фракції білків насіння сливових показав їх значну мінливість як між видами, так і в межах виду. Це свідчить про недоцільність використання цієї фракції білків насіння у таксономічних дослідженнях підродини Prunoideae.
- Типові відмінності характерні для ділянок електрофоретичних профілів альбумінів, утворених білками з молекулярними масами 32,9-62,4 кД. Їх якісний склад у сортів одного виду є незмінним.
- Білки з молекулярними масами 16,6; 17,2; 18,0; 18,9; 19,9; 52,7 та 62,4 кД характерні для всіх об’єктів дослідження, за виключенням P. serotina, у якого білкові компоненти з молекулярними масами 19,9 і 52,7 кД відсутні. Відмінності якісного характеру, виявлені для альбумінової фракції цього виду, свідчать про його найбільшу філогенетичну віддаленість.
- Встановлено, що низькі концентрації іонів стронцію (4,8⋅10-5 М/л), нікелю (4,2⋅10-5 М/л) та кадмію (2,1⋅10-5 М/л) у поживному середовищі викликають суттєве підвищення інтенсивності включення міченого 3Н-лейцину в цитозольні білки (≈1,8-3 рази). Збільшення вмісту металу до 56,8⋅10-5, 23,1⋅10-5 та 12,7⋅10-5 М/л відповідно веде до значного його зниження (майже до рівня контролю). За ступенем токсичності досліджувані хімічні елементи можна розмістити у наступний ряд: Sr2+<<Ni2+<Cd2+.
- Розроблена схема мікроклонального розмноження in vitro видів роду Prunus може бути використана для широкомасштабного тиражування деревних плодових та як модельна система для проведення біохімічних досліджень.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ ПРАЦЬ
1.Шелифост А.Е., Костышин С.С., Волков Р.А. Микроклональное размножение видов рода Prunus // Биотехнология. - 1993. - № 5.- С. 19-21.
2.Рогозинский М.С., Шелифост А.Е., Костышин С.С., Волков Р.А. Действие ионов тяжелых металлов на растения в культуре in vitro // Физиология и биохимия культ. растений. - 1998. - Т. 30, № 6. - С. 465-471.
3.Шелифіст А.Є., Давидюк Ю.М., Костишин С.С., Волков Р.А. Структура рибосомних генів представників родів Amigdalus та Persica // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наук. праць. Вип. 20: Біологія. - Чернівці: ЧДУ, 1998. - С. 29-38.
4.Шелифіст А.Є. Використання альбумінів насіння для визначення генетичних дистанцій між видами // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наук. праць. Вип. 38: Біологія. - Чернівці: ЧДУ, 1998. - С. 101-107.
5.Шелифіст А.Є. Альбуміни насіння як маркери філогенетичної спорідненості видів Prunoideae // Укр. бот. журн. - 1999. - № 2. - С. 170-174.
6.Волков Р.А., Панчук И.И., Шелифост А.Е. Молекулярно-генетические маркеры плодовых культур подсемейства сливовых // Тез. науч. конф. “Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов”. - Уфа, 1989. - Ч.II. - С. 104.
7.Волков Р.А., Костышин С.С., Панчук И.И., Рогозинский М.С., Толстюк С.М., Шелифост А.Е. Разработка способов получения и оценки селекционно-ценных форм сельскохозяйственных растений на основе биотехнологических подходов // Тез. докл. I Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению “Генная и клеточная инженерия”. Москва, 1991. - С. 91.
8.Шелифост А.Е., Костышин С.С., Волков Р.А. Применение антиоксидантов при микроклональном размножении сливы // Тез. науч. конф. “Изучение и рациональное использование природных ресурсов”. - Уфа, 1991. - С. 72.
9.Шелифост А.Е., Павельчук Г.И., Костышин С.С., Волков Р.А. Использование культуры in vitro для изучения влияния тяжелых металлов на растения // Тез. докл. Всесоюзн. конф. “Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу”. - Черновцы, 1991. - Т. II. - С. 60.
10.Шелифіст А.Є., Красичінська Н.Р., Волков Р.А. Вплив іонів важких металів на ріст і розвиток рослин // Тез. доп. VI з’їзду Укр. біохім. з'їзду. - К., 1992. - Т. 3.- С. 70-71.
11.Шелифіст А.Є., Костишин С.С., Волков Р.А. Вплив іонів важких металів на ріст рослин і біосинтез білків цитозолю у плодових культур in vitro // Тез. доп. Міжнародної конференції. “Навколишнє середовище і здоров’я”. - Чернівці, 1993. - С. 187.
12.Шелифіст А.Є., Волков Р.А., Костишин С.С. Вивчення токсичної дії іонів Cd та Ni на сливу в культурі in vitro // Тез. доп. II з’їзду Українського тов-ва фізіологів рослин. - Київ, 1993. - Т. II. - С. 131-132.
13.Панчук І.І., Шелифіст А.Є., Костишин С.С. Використання рДНК для молекулярної паспортизації сортів культурної яблуні // Тез. доп. VI конф. молодих вчених. - К., 1996. - С. 115-116.
14.Шелифіст А.Є., Панчук І.І., Костишин С.С., Волков Р.А. Рестрикційне картування рибосомних генів персиків // Тез. доп. VII Українського біохімічного з’їзду. - 1997. - С. 24.
15.Шелифіст А.Є., Копильчук Г.П. Використання запасних білків насіння в таксономічних дослідженнях // Тез. доп. VII Українського біохімічного з’їзду. - 1997. - С. 25.
Шелифіст А.Є. Молекулярно-біохімічна характеристика видів підродини Prunoideae Foske. Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. Чернівецький державний університет ім. Ю.Федьковича, Чернівці, 2000.
Захищається дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук, основні положення якої викладені в 15 наукових публікаціях. Дисертацію присвячено з’ясуванню можливостей використання легкорозчинних білків насіння та повторюваних одиниць рДНК у таксономічних дослідженнях підродини Prunoideae, а також розробці системи мікроклонального розмноження видів роду Prunus та вивченню закономірностей впливу іонів важких металів на інтенсивність включення міченого попередника в цитозольні білки P. domestica сорт ‘Стенлі’.
Встановлено, що сортові особливості представників підродини Prunoideae не впливають на електрофоретичний розподіл альбумінів насіння в поліакриламідному гелі, на відміну від глобулінів. У міжгенному спейсері рДНК сливових в області субповторів міститься декілька точок впізнавання рестриктазою Hind III. У ньому в усіх об’єктів дослідження на відстані ≈ -1,5 тпн від 5′-кінця гену 18S рРНК наступного повтору знаходиться Dra I-сайт. Розроблена система мікроклонального розмноження видів роду Prunus та виявлено, що низькі концентрації іонів Sr2+, Ni2+ та Cd2+ викликають різке підвищення інтенсивності включення міченого попередника у цитозольні білки в умовах in vitro. Збільшення вмісту іонів металів у поживному середовищі викликає значне зниження цього показника. За ступенем токсичності для P. domestica досліджувані елементи можна розмістити у такий ряд: Sr2+<<Ni2+<Cd2+.
Ключові слова: Prunoideae, Prunus, електрофорез, альбуміни, рДНК, in vitro, стронцій, нікель, кадмій.
Шелифост А.Е. Молекулярно-биохимическая характеристика видов подсемейства Prunoideae Foske. Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. Черновицкий государственный университет им. Ю.Федьковича, Черновцы, 2000.
Защищается дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, основные положения которой изложены в 15 научных публикациях. Диссертация посвящена выявлению возможностей использо-вания легкорастворимых белков семян и повторяющихся последователь-ностей рДНК в таксономических исследованиях подсемейства Prunoideae, а также разработке системы микроклонального размножения видов рода Pru-nus и установлению закономерностей влияния ионов тяжелых металлов на интенсивность включения меченого предшественника в цитозольные белки.
В результате исследования альбуминовой и глобулиновой фракций белков семян представителей подсемейства Prunoideae выявлена высокая межвидовая и внутривидовая компонентная изменчивость последних. Качественный состав альбуминов, напротив, оказался неизменным у сортов одного вида. Выявлены белки, которые можна использовать в качестве маркеров как для отдельно взятого рода, так и для подсемейства в целом.
Общие закономерности выявлены и при изучении рДНК-овых повторов. Так, у большинства объектов исследования обнаружено по несколько, отличающихся размерами межгенного спейсера, вариантов повторяющихся последовательностей. Практически у всех видов среди них присутствуют короткие. Исключение составляют черемухи, у которых все повторы рДНК отличаються большими размерами. Все обнаруженные в их организации отличия касаются структуры межгенных спейсеров, которые можна разбить на четыре части. Так, для всех объектов исследования характерным является присутствие в области субповторов, длина которых составляет ≈300 пн, нескольких Hind III-сайтов. В большинстве случаев они расположены на расстоянии 6,2; 6,5; 6,8 и 7,1 тпн от 5′-конца гена 18S рРНК. Особой стабильностью обладает сайт узнавания эндонуклеазой Dra I в положении –1,5 тпн от 5′-конца гена 18S рРНК следующего повтора, который обнаружен у всех объектов нашего исследования
Структура МГС коротких повторяющихся последовательностей этим правилам не подчиняется. Так, из шести использованых ферментов в них встречаются только нуклеотидные последовательности, которые распознают рестриктазы Xba I и Eco RI. Для коротких повторов персиков характерно полное отсутствие в межгенном спейсере сайтов узнавания исследованых эндонуклеаз.
В работе также представлена методика микроклонального размножения видов рода Prunus. В результате проведенного поиска был подобран состав питательных сред для культивирования и укоренения микрочеренков, а также подобраны условия их переноса в почву.
Разработанная система использована нами для определения закономерностей влияния ионов тяжелых металлов на древесные растения. Установлено, что низкие концентрации ионов стронция (4,8⋅10-5 М/л), никеля (4,2⋅10-5 М/л) и кадмия (2,1⋅10-5 М/л) в питательной среде вызывают существенное повышение интенсивности включения меченного предшест-венника в цитозольные белки (≈1,8-3 раза). Увеличение содержания ионов металлов в среде (до 56,8⋅10-5, 23,1⋅10-5 и 12,7⋅10-5 М/л соответственно) ведет к значительному снижению исследуемого показателя (почти до уровня контроля). Особенно ярко это выражается под влиянием ионов кадмия.
Значительное снижение интенсивности протекания процессов синтеза, по сравнению с контролем, при максимальных концентрациях металла в среде (113,2⋅10-5, 69,2⋅10-5 и 25,4⋅10-5 М/л для Sr2+, Ni2+ и Cd2+ соответственно) свидетельствует, что количество полютанта, которое аккумулируется в растении в данном случае является критическим, то есть дальнейшее его увеличение приведет к гибели организма. По степени токсичности для P. domestica исследуемые металлы можна разместить в следующий ряд: Sr2+<<Ni2+<Cd2+.
Ключевые слова: Prunoideae, Prunus, электрофорез, альбумины, рДНК, in vitro, стронций, никель, кадмий.
| 
