Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Ладохін Олексій Сергійович

УДК 577.322+577.31

МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ

БІЛКОВО-МЕМБРАННИХ ВЗАЄМОДІЙ:

ТЕРМОДИНАМІЧНИЙ І КІНЕТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ ВБУДОВУВАННЯ

03.00.03 - молекулярна біологія

Автореферат на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ; в Університетах штату Вірджинія, м. Шарлотсвиль, Джонс Хопкінса, м. Балтімор, штату Каліфорнія, м. Ірвайн.

Захист дисертації відбудеться “20” листопада 2001 р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143.

Автореферат розіслано “16” жовтня 2001 р.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Мембранні білки (МБ), що складають третину усіх білків клітини (Wallin, von Heijne, 1998), відіграють значну роль у різноманітних молекулярно-біологічних процесах у клітині, таких, зокрема, як упізнавання, передача сигналів, апоптоз, проліферація, виробництво енергії і транспорт поживних речовин. Проте наше розуміння молекулярних механізмів їхнього функціонування, а відтак і можливість спрогнозованої корекції асоційованих патогенних фенотипів обмежені, насамперед, відсутністю знань про загальні принципи, що визначають як правильний, так і неправильний фолдинг МБ.

Конститутивні МБ вбудовуються співтрансляційно за допомогою транслоконового комплексу (Andrews and Johnson, 1996; Bibi, 1998), тоді як неконститутивні (токсини, антимікробні пептиди) роблять це спонтанно. Жоден з цих процесів не вивчений достатньо на молекулярному рівні, хоча не виключено, що обидва вони ґрунтуються на тих же фізичних засадах. Спонтанний перехід МБ від водорозчинної до мембранозв’язаної форми необхідний для багатьох біологічних процесів – пост-трансляційного вбудовування білків у мембрани органел, дії комплементу, фузогенної активності вірусів, мембранної пермеабілізації токсинами та білковими антибіотиками тощо. Проте дуже мало відомо про конформаційні зміни, що супроводжують цей перехід, енергетичні бар’єри, які відокремлюють фолдингові інтермедіати, та про природу рушійних сил. Немає також загального розуміння стосовно співвідношення між термодинамічним і кінетичним контролем над процесом вбудовування білків у мембрани. Панівною в літературі є гіпотеза про виключне домінування термодинамічного контролю над фолдингом водорозчинних білків, проте залишається відкритим питання, наскільки ця концепція може бути застосована до МБ.

Розв’язання проблеми вбудовування МБ є важливим для розуміння процесу білкового фолдингу. Взаємодії білкових поліпептидних ланцюгів між собою та з оточенням визначають структуру і стабільність білка. Вивчення розчинних білків як спрощується, так і ускладнюється наявністю спільної водної фази (White and Wimley,1999). Для мембранних білків, хоча їхнє оточення більш складне, бішар створює термодинамічні та геометричні обмеження, які лімітують число можливих структурних мотивів. Перевагою вивчення білкового фолдингу на МБ є те, що події, взаємопов’язані в складні шляхи у розчинних білках, можуть бути значною мірою відокремлені.

Як структурні, так і термодинамічні дослідження МБ суттєво відстають від вивчення їхніх розчинних аналогів. Основна причина криється в тому, що ліпідні бішарові мембрани є завеликими для ЯМР-досліджень у розчині і занадто “двовимірними” для дифракційних методів, зокрема рентгенівських. Ці обмеження, що знижують можливість застосування структурних методів з високою роздільною здатністю, принципово не поширюються на флуоресценцію та інші спектроскопічні методи. Отже, на додаток до традиційного застосування флуоресценції як методу, що дозволяє отримувати інформацію про динамічні флюктуації білкової структури та її кінетичні зміни, вона може відігравати нову роль структурного інструменту у вивченні МБ. Однак це вимагає розробки нових методичних підходів, спеціально призначених для флуоресцентних досліджень у мембранних системах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу механізмів трансляції генетичної інформації ІМБіГ НАН України. Частково її виконано в рамках бюджетної теми “Молекулярні основи компартменталізації білкового синтезу” (шифр теми 2.2.4.9, № держ. реєстрації 0198U000672, 1998-2001 рр.). Робота виконувалася також у рамках вітчизняних грантів МОС України, шифр 5.04/0061, 5.04/0073, та грантів США NIH: GM 23858, GM 46823, AI 22931.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було встановлення загальних принципів та молекулярних механізмів вбудовування білків у ліпідні мембрани і набуття ними активної конформації.

До завдань роботи входило:

-- розробка флуоресцентних методів структурного, термодинамічного та функціонального аналізу, придатних для дослідження МБ;

-- кількісне визначення енергетики мембранного зв’язування за наявності гідрофобних і електростатичних взаємодій та структурна характеризація нативного індоліцидину і його аналогів;

-- кількісне визначення енергетики формування αα-спіральної структури на мембрані та структурна характеризація нативного і енантіомерного мелітину;

-- кількісне визначення енергетики формування ββ-структури та структурна характеризація модельного гексапептиду WLLLLL;

-- з’ясування співвідношення термодинамічного і кінетичного контролю над процесом пост-трансляційного вбудовування в мембрани та набуття активної конформації мелітином, нативним цитохромом b5 i його мутантами;

-- узагальнення отриманих результатів та створення структурно-термодинамічної концепції вбудовування білків у мембрани.

Об’єкт дослідження: процеси спонтанного пост-трансляційного вбудовування білків у ліпідні мембрани та їхні молекулярні механізми.

Предмет дослідження: нативний мелітин із бджолиної отрути і його синтетичний енантіомерний аналог; нативний бичачий антимікробний пептид індоліцидин і його дев’ять синтетичних аналогів із модифікованою гідрофобністю; нативний кролячий цитохром b5 і три його мутанти з одиночними і подвійними замінами в мембранозв’язаному фрагменті; синтетичний мембранно-активний пептид WLLLLL і низькомолекулярні модельні сполуки; модельні ліпідні мембрани.

Мелітин -- переходить із невпорядкованого клубка у розчині в α-спіральну конформацію на мембрані і є зручною моделлю для вивчення енергетики формування вторинної структури на мембрані.

Індоліцидин -- має унікальний амінокислотний склад (40 % Trp, 25 % Pro, 25 % катіонних груп), що дозволяє вивчати гідрофобні та електростатичні складові вільної енергії мембранного зв’язування.

Модельний пептид WLLLLL -- переходить на мембрані з мономерного стану в розчині до β-структурного агрегату, що дає змогу вивчати енергетику формування β-структури.

Цитохром b5 -- важливою рисою є його здатність обмінюватися між мембранами, що дозволяє вивчати кінетичні аспекти білково-мембранних взаємодій.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено загальну структурно-термодинамічну концепцію спонтанного пост-трансляційного вбудовування білків у мембрани, згідно з якою спонтанне вбудовування неодмінно проходить через фолдинговий інтермедіат.

Вперше експериментально доведено наявність кінетичного контролю над пост-трансляційним вбудовуванням і фолдингом мембранних білків.

Вперше продемонстровано і кількісно охарактеризовано неадитивність гідрофобних і електростатичних складових білково-мембранних взаємодій. Запропоновано просте емпіричне правило обчислення сумарної вільної енергії зв’язування пептидів з мембранами.

Вперше кількісно визначено вільну енергію формування вторинної структури білків

(α-спіралі та β-структури) у поверхневій зоні мембрани і теоретично обгрунтовано феномен спряження процесів мембранного зв’язування і фолдингу білків.

Розроблено серію експериментальних і обчислювальних засобів, що дозволяють отримувати коректні параметри флуоресценції в присутності сильного світлорозсіювання на мембранах. Запропоновано новий структурний метод розподільного аналізу гасіння флуоресценції в мембранах, залежного від глибини, що дозволяє визначати глибину занурення хромофорів, ступінь їхньої експонованості в ліпідну фазу і конформаційну гетерогенність.

Теоретичне та практичне значення роботи. Основним результатом виконаної роботи є розробка структурно-термодинамічної концепції вбудовування білків у мембрани, без якої неможливе розуміння фундаментальних засад життєдіяльності клітини на молекулярному рівні. Результати досліджень широко цитуються міжнародною науковою спільнотою і є базисними для подальшого вивчення як спонтанного, так і співтрансляційного фолдингу та функціонування МБ.

Дослідження енергетики білково-мембранних взаємодій та мембранної пермеабілізації взагалі, а надто ті, що зроблені за допомогою антимікробного пептиду індоліцидину, мають потенційно важливе значення для розробки пептидних антибіотиків. Через велику варіабельність патогенних бактерій проблема розробки нових підходів антимікробного контролю постає в усьому світі. Особливе значення цієї проблеми в умовах України пов’язане з наслідками аварії на ЧАЕС, що спричинили зниження загального рівня природного імунітету населення.

В останні роки встановлено, що помилковий білковий фолдинг і наступна акумуляція білків при хворобах Альцгеймера, Паркінсона та інших пріонових захворюваннях тісно пов’язані з білково-мембранними взаємодіями. Вивчення механізмів та енергетики білкової агрегації, що супроводжує формування β-структури в поверхневій зоні ліпідного бішару, відкриває нові шляхи пошуку новітніх методів діагностики і лікування цих хвороб.

Запропоновані методологічні розробки в галузі флуоресцентної спектроскопії значно розширюють сфери її успішного використання для вивчення термодинамічних, кінетичних, структурних і функціональних аспектів білково-мембранних взаємодій.

Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні та експериментальні ідеї, що розроблялися в дисертації, належать автору. Всі експерименти здійснено особисто автором за винятком частини експериментів, що наведені в розділі 5.3, у виконанні яких брав участь Dr. W. C. Wimley (Університет Каліфорнії, Ірвайн, США). Приготування та виділення мутантів цитохрому b5 було зроблено у співробітництві з Dr. L. Wang тa Dr. A. W. Steggles (Північно-Східний Університет Огайо, США). Отримані в співробітництві результати опубліковано як спільні наукові статті.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідалися на III Конгресі Європейського Товариства Фотобіологіі (Будапешт, Угорщина, 1989), на 5-му Симпозіумі Білкового Товариства (США, 1991), на щорічних з’їздах Американського Біофізичного Товариства (США, 1991-2001), на 17-му Міжнародному конгресі з біохімії та молекулярної біології (США, 1997), на двох конференціях FASEB “Біофізика клітинних мембран” (США, 1998, 2000). Вони також повідомлялися на наукових семінарах в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, в Аграрному Університеті (Вагенинген, Нідерланди, 1993); в Інституті лазерних досліджень (Ірвайн, США, 1995) та Університеті Рутгерс (Нью Брунсвік, США, 1998).

Публікації. За темою дисертації надруковано 31 статтю (з них – 7 одноосібних) у вітчизняних та зарубіжних фахових журналах, що реферуються, та тези 16 доповідей на наукових конференціях. Вони в повному обсязі висвітлюють зміст, результати, висновки і рекомендації дисертації.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, результатів дослідження та їхнього обговорення, висновків та переліку використаних джерел, який охоплює 517 посилань. Роботу викладено на 328 сторінках машинописного тексту. Вона містить 67 рисунків та 17 таблиць на 47 стор.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Особливості флуоресцентних досліджень на мембранах

Стислий огляд методів дослідження. Основним методологічним підходом до вирішення поставлених завдань була флуоресцентна спектроскопія, що поєднує в собі чутливість і універсальність, так необхідні для мембранних досліджень. Оскільки в дисертації вирішувалася ціла низка оригінальних завдань, багато уваги було приділено розробці специфічних флуоресцентних методів, націлених на розв’язання конкретних питань. Особлива важливість розвитку методології флуоресцентного мембранного експерименту знайшла відбиток у висновках і наукових досягненнях роботи, про що йтиметься нижче. Серед інших методів значне місце посідає круговий дихроїзм (КД), який дозволяє визначати вторинну струк­туру білків – необхідну скла­дову структурно-термодинамічної характеризації. Енергетику білко­во-мембранних взаємодій дослід­жу­вали методом рівноважного діалізу.

Параметри обраховували за методом мінімізації найменших квадратів із розподіленою вагою експериментальних точок, зворот­но пропорційною стандартній по­милці у даній точці. Звичайна похибка не перевищувала 5 %. Як модельні мембрани було використано везикули різного ліпідного складу та розміру: малі бішарові везикули (МБВ) та великі бішарові везикули (ВБВ).

Розробка методології флуорес­центних досліджень у мембранних системах. На першому етапі досліджень нам було необхідно розв’язати низку методологічних завдань, пов’язаних із застосу­ванням флуоресцентної спектро­скопії до мембранних систем. Труднощі, що притаманні таким системам, полягають у викривленні спектрів флуоресценції внаслідок значного розсіювання світла біша­ровими везикулами (модель­ними мембра­нами), яке залежить від довжини хвилі. На рис. 1 наведено характерний приклад, що ілюструє необхідність корекційних процедур для визначення термо­динаміки зв’я­зу­вання мелітину з різними ти­па­ми модельних мембран. Заува­жимо, що інтенсивності відхиля­ються при високих концентраціях везикул через втрати, викликані розсіюванням як збуджуючого світла, так і флуоресценції. Ці результати чітко показують, що використання нескоректованих даних може призвести до отримання неправильних значень моль-фракційних коефіцієнтів і вільнoї енергії зв’язування тa навіть до помилкових висновків стосовно самого процесу “зв’язування”, наприклад, про некооперативне зв’язування або агрегування мелітину на поверхні.

Ми здійснили систематичне дослідження артефактів подібного типу і методичних підходів для їхнього усунення, які можна легко застосовувати в експерименті. Всі подальші флуоресцентні дослідження проводили з використанням оптимізованих експериментальних схем детекції, а отримані дані піддавали необхідній математичній корекції та аналізу.

Дослідження природи неекспоненцій­ного затухання триптофанової флуорес­ценції. Природа неекспоненційного затухання флуоресценції тісно пов’язана з динамічною організацією білкової структури. В представленому розділі було використано дві прості моделі з альтернативними механізмами відхилення затухання від моноекспоненційної поведінки: 1) мультиекспоненційне затухання флуоресценції Trp-цвітеріону в швидкорелаксуючому водному оточенні є результатом гетерогенності основних станів (наявність множинних обертальних конформерів); 2) неекспоненційне затухання флуоресценції індолу, який не має ротамерних форм, у суміші вода--гліцерин є результатом релаксації розчинника.

У той час як для триптофану (Trp) не виявлено залежності затухання флуоресценції від збудження, подібна залежність є суттєвою для індолу в гліцерині. Таким чином, залежність затухання від довжини хвилі збудження може бути використана як критерій розрізнення альтернативних механізмів, які призводять до відхилення від експоненційного затухання флуоресценції білків. Показано, що затухання флуоресценції Trp-19 мелітину для різних його конформацій має риси як конформаційної гетерогенності, так і реакції збудженого стану залежно від конформаційного стану білка. Так, для мелітину в метанолі було продемонстровано існування від’ємної передекспоненційної експоненти, яка є достатнім (хоч і не необхідним) показником реакції збудженого стану. Характерно, що розчин мелітину в метанолі часто розглядається як модель його мембранозв’язаної конформації, оскільки в обох випадках мелітин є α-cпіральним і знаходиться в середовищі зі зменшеною полярністю порівняно з водним. Той факт, що затухання флуоресценції мелітину в оточенні, яке імітує мембранне, безпосередньо віддзеркалює вплив конформаційної динаміки, є важливою передумовою для коректної інтерпретації механізмів затухання флуоресценції МБ.

Триптофаново-октиловий ефір (ТОЕ) як низькомолекулярна модель для вивчення триптофанової флуоресценції мембранних білків. Для успішного вивчення МБ флуоресцентними методами треба спочатку вирішити питання щодо впливу ліпідного бішару на спектроскопічні властивості природних флюорофорів. Для цього ми використали зручну модельну сполуку -- ТОЕ, яка містить індольний хромофор і добре зв’язується з ліпідними мембранами. Найголовніше питання, яке слід було розв’язати, -- це експериментальне визначення механізму гасіння флуоресценції в мембранах, який без достатніх підстав вважався суто статичним (Сhattopadhaya, London, 1987). Для цього ми виміряли кінетику затухання флуоресценції ТОЕ в ПОФХ (1-пальмітоїл-2-олеоїлфосфати­дилхолін) везикулах та в мембранах, сформованих із бромованих ліпідів, здатних гасити флуоресценцію. Результати наших досліджень наведено в табл. 1. Той факт, що час затухання флуоресценції скоротився в присутності бромоліпідів, однозначно свідчить про динамічний механізм гасіння. Додатковим підтвердженням цього є та обставина, що гасіння стає більш ефективним із підвищенням температури. Було визначено енергію активації гасіння, яка дорівнювала 1,3 ккал/моль. Описано такі принципові властивості флуоресценції мембранозв’язаного ТОЕ, як час життя, квантовий вихід, анізотропія, спектральний розподіл і червоний крайовий зсув.

Ці дані забезпечують корисні контрольні точки для множини даних зі стаціонарної та кінетичної флуоресценції МБ. Той факт, що молекули ТОЕ, повністю експоновані в ліпід, зазнають повільної структурної релаксації, є важливою відправною точкою для подібних вимірювань на МБ. На противагу цьому експоновані залишки Trp у водорозчинних білках не викликають ефекту червоного краю. Таким чином, ліпідна мембрана є середовищем, яке модулює динаміку білкової конформації.

Оскільки попередні методи структурного аналізу з використанням гасіння флуоресценції були основані на ідеї статичного гасіння (Сhattopadhyay, London, 1987), постає необхідність теоретичної розробки нових, адекватних методів, чому і присвячено наступний підрозділ.

Структурні дослідження білково-мембранних комплексів

Визначення глибини занурення білків у мембрани. Необхідною умовою дослідження білково-мембранних комплексів було створення теорії гасіння флуоресценції в мембранах, яка б відбивала сучасне розуміння структурно-динамічної організації мембран. Наші уявлення стосовно структури мембран зазнали суттєвих змін в останнє десятиріччя, зокрема, окреслилися важливі складові трансверсної організації, які спостерігаються як експериментально (White and Wiener, 1995), так і з використанням розрахункових методів (Pastor et al., 1991).

Через велику термічну неупорядкованість, характерну для рідких бішарів, “структура” мембрани може бути визначена лише як усереднене за певний час розподілення основних структурних груп, спроектованих на вісь, нормальну до площини бішару, і представлених Гауссовими функціями. Згідно з уявленнями щодо такого “розподільного” характеру структури бішару, розроблений нами метод “розподільного аналізу” (РА) гасіння флуоресценції в мембранах використовує Гауссовий розподіл для апроксимації профілів гасіння. Розроблені нами теоретичні основи цього методу враховують також динамічний характер гасіння в мембранах, описаний у попередньому підрозділі.

Теорія. В експериментах щодо гасіння, залежного від глибини, інтенсивність флуоресценції, F, вимірюється як функція відомої глибини гасника, h. Інтенсивність за відсутності гасіння -- F0. У найзагальнішій формі РА описує профіль гасіння за допомогою суми двох дзеркально-симетричних Гауссових розподілiв, G (з трьома незалежними параметрами):

ln(F0/F(h))= G(h) + G(-h),                де         

       Необхіднїсть у двох симетричних Гауссіанах диктується необхідністю враховування транс-бішарового гасіння. Незалежно від того, буде хромофор розподілений в одному моношарі або в двох, у протилежному моношарі завжди знайдеться гасник. Три вільних параметри РА, використані в процесі мінімізації, мають наступний зміст: 1) середня глибина, hm, відповідає найвірогіднішому положенню флуоресцентної проби на перетині бішару; 2) дисперсія, σσ, залежить від таких скла­дових, як кінечність розмірів зонда і гасника та їхнi термічні флюктуації.

Додаткова гетерогенність може бути внесена множинними білковими конформаціями, як, наприклад, у випадку поверхнево­зв’язаного і вбудованого мелітину (див. рис. 14); 3) площа під кривою, S, пропорційна загальному гасінню. Вона може бути представлена добутком власної константи гасіння, γγ, яка визначається природою механізму, що викликає гасіння; часу життя збудженого стану за відсутності гасіння, ττ; ступеня експонування зонда в ліпідне середовище, ωω, і концентрації гасників,С. (S= γ ω τ C).

Параметр S може бути використаний для визначення експонування флюорофору в ліпідну фазу. Докладніше це буде розглянуто в наступному підрозділі.

Застосування методу РА до модельних мембранних систем (ТОЕ та модельний пептид з триптофаном посере­дині) продемонстровано на рис. 2. Індивідуальні профілі гасіння для одного моношару подані на рис. 2Б для чіткішого уявлення. Профіль для ТОЕ в МБВ показано для порів­няння пунктирною ліні­єю. Виявилося, що розподіл пептидів у двох мембран­них системах має однакове середнє положення -- близько до центра бішару. Розподілення у ВБВ є ширшим, ніж у МБВ, що дозволяє припустити наявність різниці в поперечній гетерогенності, можливо, у зв’язку з розбіжностями в ліпідній упаковці. В обох випадках ширина розподілення менша, аніж така для ТОЕ. Останнє вказує на можливу обмеженість поперечної рухомості пептиду на перетині бішару, що є наслідком його α -спіральної конформації.

Oтримані результати демонструють, що роз’єднання параметрів площі та ширини в профілі гасіння флуоресценції, залежного від глибини, згідно з РА, призводить до

1) мінімізації систематичних помилок у визначенні глибини проникнення зонда в мембрану та 2) отримання додаткової інформації щодо поперечної гетерогенності і експо­нування зонда в ліпід. Метод РА використано в подаль­шому для описання про­никнення в мембрану деяких білків.

Визначення ступеня експо­нування триптофану в ліпідну фазу. Згідно з теорією, запро­понованою в попередньому підрозділі, площа під профілем гасіння, S, пов’язана зі сту­пенем експонування хромофора в ліпідну фазу, ωω. Відносне експонування можна отримати шляхом порівняння абсолютно­го експонування досліджува­ного пептиду (NPP) мутантного цитохрому  b5  із  значенням

для ТОЕ:

Якщо немає можливості виміряти часи життя, то їхнє співвідношення можна апроксимувати співвідношенням квантових виходів, Q, для білка, що вивчається, і модельної сполуки ТОЕ в ліпідній мембрані:.

Отримано такі значення квантових виходів для пептиду і ТОЕ, зв’язаних з ПОФХ везикулами (виражені відносно квантового виходу для ТОЕ за температури 20 оС): QТОЕ (60 оС) = 0,66; QNPP (20 оС) = 1,65; QТОЕ (60 оС) = 0,92. Ці величини були використані разом з результатами з табл. 2

для визначення відносного експонування Trp-109 в NPР.

Значення, отримані згідно з РА, склали: ΩΩ (20 оС) = 0,69; ΩΩ (60 оС) = 0,95. Ці розрахунки показали, що пептид зазнає температурозалежної конформаційнoї зміни. За низької тем­ператури Trp-109 частково закритий рештою білкової структури. При нагріванні Trp-109 повністю експонується в ліпід. Нагрівання призводить до збільшення ширини профілю гасіння, що вказує на значну гетерогенність поперечного положення хромофора. Ця конформаційна зміна пов’язана з температурно-індукованою інверсією обмінюваної (“вільно” зв’язана) в необмінювану (“міцно” зв’язана) форму цитохрому b5, яка радикально відрізняється швидкістю обміну між мембранами (див. рис. 13).

Дослідження термодинамічного контролю білкового вбудовування в мембрани

Дослідження термодинамічного контролю вбудовування білків у мембрани становить (разом з кінетичним) центральну частину даної роботи. Воно охоплює кілька окремих завдань: встановлення співвідношення електростатичних і гідрофобних взаємодій на поверхні мембрани та кількісну характеристику енергетики формування різних типів вторинних структур.

Гідрофобні та електростатичні взаємодії на поверхні мембрани. Адитивність різних компонентів вільної енергії є фундаментальною концепцією в біохімії, яка, проте, не досліджена адекватно у випадку зв’язування білків з мембранами. Хоча гідрофобні і електростатичні взаємодії окремо добре охарактеризовані за допомогою різноманітних наборів модельних пептидів, але все ж малозрозумілим залишається їхній взаємозв’язок. Адитивність гідрофобних (ΔΔGГФ) і електростатичних (ΔΔGЕС) внесків у вільну енергію зв’язування допускається часто з огляду на зручність, а не на основі експериментальних доказів.

Щоб вивчити в деталях різні аспекти мембранних взаємодій, ми обрали природний пептид індоліцидин як матричний пептид. Природний індоліцидин має незвичайний амінокислотний склад, у якому переважають п’ять триптофанів, три проліни і чотири катіонні групи. Така комбінація гідрофобних, заряджених і деструктуючих залишків робить його привабливою моделлю для вивчення пептидно-мембранних взаємодій. Ми синтезували та дослідили низку індоліцидинових мутантів, у яких змінювали заряд і гідрофобність (табл. 3).

Дані щодо вільної енергії зв’язу­вання індоліцидинових му­тантів з нейтральними, ПОФХ, і аніонними мембранами, ПОФГ (1-пальмітоїл-2-олеоїл­фосфа­ти­дил-гліцерин), наведено на рис.3. Експери­ментальні точ­ки зв’язування пептиду з ПОФХ лягають на пряму з нахилом 1,04±±0,04 та перетином на --0,1±±0,3 ккал/моль. Це означає, що шкала гідрофобності точно описує абсолютні значення вільної енергії відповідно до замін аміно­кислот. Ми не виявили суттєвої різниці у зв’язуванні пептидів одного й того ж складу, але з різним положенням залиш­ку Trp. Зроблено висновок стосовно наявності групової адитивності компо­нентів вільної енергії в ши­рокому діапазоні гідрофобності.

Природний індоліцидин зв’язу­єть­­ся міцніше з аніон­ними ПОФГ везику­лами, аніж з нейтральними ПОФХ, внаслідок додаткових сприят­ливих електростатичних взаємодій. Це справедливо для всіх варіантів індоліцидину, і дані щодо вільної енергії для індоліцидинів -W, -Y, -F, -L (рис. 3) також лягають на пряму. Її нахил, однак, не дорівнює одиниці, що свідчить про відсутність простих адитивних внесків гідрофобних і електростатичних взаємодій.

Загальну стратегію аналізу наявності адитивності показано на рис. 4. У випадку ідеальної адитивності співвідношення ефектив­ності заряду (Zeff) до номінального заряду (Z) не повинно залежати від

ΔΔGГФ та дорівнює одиниці. Однак отримані співвідношення для ін-доліцидинових мутантів менші за одиницю, а прямі для відповідних пар характеризуються суттєвим від’ємним нахилом. Чим більша гідрофобність, тим більше відхилення від ідеальної поведінки. Екстраполяція даних в зону низької гідрофобності показує, що чисто електростатичне зв’язування пропорційне номінальному зарядові. Така поведінка відповідає модельним даним на заряджених пептидах низької гідрофобності.

Причини відсутності адитивності вільних енергій остаточно не з’ясовані, але видається доцільним припустити, що вони пов’язані зі структурними вимогами для максимізації гідрофобних і електростатичних взаємодій. Виявилося, що індоліцидиноподібні пептиди в змішаних ліпідних бішарах не можуть задовольнити цим вимогам одночасно. Щоб передбачити кількісне зв’язування гідрофобних і заряджених пептидів зі змішаними аніонно-цвітеріонними мембранами, необхідно зменшувати номінальний заряд на 20 % нa кожнi 3 ккал/моль у гідрофобному зв’язуванні.

Енергетика формування αa-структури в мембранних білках. Для визначення вільної енергії формування αα-спіральної конформації в поверхневому шарі мембрани використовували нативний мелітин та його синтетичний енантіомер, D4,L-мелітин, який містить D-аміно­кислотні залишки в положеннях 5, 8, 17, 21. Введення D-амінокислот у мелітин значно зменшує вірогідність формування вторинної структури (про що свідчать спектри КД на рис. 5), зберігаючи при цьому загальну гідрофобність.

Вільні енергії переходу двох форм мелітину з водної фази на поверхню мембрани ПОФХ ВБВ вимірювали в умовах, які забез­печують мономерний стан мелітину як у водній, так і в мембранній фазах. Молярно-часткові коефіцієн­ти зв’язування Кχχ для мелітину i D4,L-мелітину складають (80±±30)⋅?105 і (4±±2)⋅?105 відповідно. Ці значення дають наступні величини вільної енергії: 2,6±±0,3 ккал/моль для D4,L-мелітину і --7,6±±0,4 ккал/моль для нативного мелітину (рис. 6). Різниця у вільній енергії --5,0±±0,7 ккал/моль між “симульованим” незгорнутим і реальним згорнутим мелітином узгоджується з малою популяцією нативного мелітину в незгорнутому мембранозв’язаному стані та відповідає гіпотезі про те, що утворення вторинної структури забезпечується зниженням вільної енергії зв’язування пептидних груп внаслідок формування водневих зв’язків. Оскільки D4,L-мелітин не може легко утворювати вторинну структуру на поверхні, він не здатний знижувати вільну енергію переходу з водної фази в мембрану шляхом утворення водневих зв’язків, які беруть участь у формуванні вторинної структури.

Розрахунок ΔΔGзалишок для утворення мелітинової спіралі потребує даних щодо середнього числа залишків, які утворюють спіраль, для двох форм мелітину, зв’язаних з ПОФХ мембранами. Проте еліптичність D4,L-мелітину в ПОФХ мембранах не може бути виміряна безпосередньо через його дуже слабке зв’язування. Тому ми використали менш прямий підхід. Встановлено, що еліптичність нативного мелітину на 222 нм є практично ідентичною у випадку повного гідрофобного зв’язування з ПОФХ та повного електроста­тичного зв’язування з аніонним ліпідом ПОФГ (1-пальмітоїл-2-олеоїлфосфатидил-гліцерин). Припустивши, що подібна ситуація спостерігається для D4,L-мелітину, ми використали значення еліптичності (θθ) для двох форм мелітину в метанолі та при зв’язу­ванні з ПОФГ для визначення різниці в ступені їхньої спіралізації. Фракційну спіральність розраховували за формулою fa = (θθ -- θθRC)/(θθH --θθRC), де θθRC i θθH -- граничні значення еліптичності для повністю розгорнутої і повністю спіральної конформацій відповідно. Обрахування спектрів, наведених на рис. 5, виявило, що середній вміст спіральних ділянок (fa) у складі нативного мелітину втричі перевищує спіральність D4,L-мелітину: 0,69 та 0,22 відповідно. До складу спіралі нативного мелітину входять біля 18, а D4,L-мелітину - 6 амі­нокислотних залишків.

Таким чином, наведені вище результати (рис. 6) дають значення ΔΔGзалишок, яке дорівнює --0,41±±0,06 ккал/моль для зниження вільної енергії на залишок, яке промотує утворення спіралі при зв’язуванні мелітину з поверхнею ПОФХ бішару.

Енергетика формування βb-структури в мембранних білках. Для кількісного визначення вільної енергії формування ββ-конформації на мембрані було використано синтетичний пептид АсWL5, який може існувати в трьох станах: як невпорядкований мономер у розчині та на мембрані, а також як ββ-структурний мембранозв’язаний агрегат при високій власній концентрації. Спектри КД цих агрегатів є типовими для ββ-структури з максимумом на 198 нм і мінімумом на 215 нм (рис. 7).

Експерименти з рівноважного діалізу дали перші вказівки на неочікувані властивості AсWL5 у мембранах, коли його зв’язування з везикулами різко зростало зі збільшенням концентрації (рис. 8). Зв’язування починає зростати при співвідношенні пептид:ліпід (П:Л) більше 0,01 і різко підвищується при П:Л більше 0,05, сягаючи 40 Кχχ для П:Л >> 0,03. Таке безпрецедентне зростання зв’язу­вання при збільшенні П:Л перед­бачає високий ступінь коопера­тивності. Для підтвердження кооперативності процесу агрегації отримані дані щодо зв’язування було проана­лізовано за допомогою моделі “зародження--ріст”, описаної Terzi (1994), згідно з якою ріст великих агрегатів розміром n йде за стадією утворення димерного ядра.

Результати застосування цієї моделі до даних щодо ПОФХ і ОБФХ (табл. 4) пока­зують, що при проникненні у фосфатидилхолінові везикули AсWL5 агрегує кооперативно у великі комплекси (n >> 10). Вільна енергія формування цих ββ-структурних агрегатів є досить значною і в перерахунку на один залишок становить --0,46--0,61 ккал/моль залежно від ліпіду. Наведені величини є дуже близькими до вільної енергії формування αα-спіралі, розглянутої в попередньому підрозділі. Це свідчить про універсальність термодинамічної концепції мембранної взаємодії білків з різними структурними мотивами. Варто зазначити, що значні витрати на зв’язування пептидних груп з мембранами є рушійною силою формування вторинної структури в мембранах, причому ідея полягає в тому, що пептидна група, зв’язана водневим зв’язком, має вищий коефіцієнт розподілу порівняно з вільною пептидною групою. Такий фундаментальний процес позначають як спряженість зв’язування і згортання.

Принцип конформаційної селективності та формування “поворотів” у мембранних білках. Необхідно було з’ясувати, як саме спряженість зв’язування і згортання проявляє себе в тих випадках, коли первинна структура не передбачає легкого формування αα-спі­ральної або ββ-складчастої структури. Знову зручною моделлю стали аналоги індоліцидину, які через значну кількість залишків проліну не здатні утворювати регулярну вторинну структуру.

Температурна залежність спек­тра КД індоліцидину в SDS (рис. 9) показує, що від’ємна смуга на 227 нм спряжена з піком на 217 нм, який знаходиться між мінімумами на 202 і 227 нм. Таку поведінку можна очікувати при екситонному розщепленні, обумовленому сте­кінгом ароматичних хромофорів. Спектри кругового дихроїзму індоліцидину-F (рис. 9) мають риси спектрів обох індоліцидинів -- L i W. Основна від’ємна смуга знаходиться на 202 нм, як і для індоліцидину-W, але загальна температурна за­лежність нагадує таку для індоліцидину-L і свідчить про те, що можливий екситоновий дуплет між Phe залишками набагато слабший, ніж для Trp залишків. Цього можна було чекати з огляду на більш низьку осциляторну силу Phe. В усякому разі Phe може робити свій внесок у загальний вигляд спектрів КД у дальній УФ зоні.

На рис. 10 представлені спектри КД індоліцидинових варіантів з одним Trp. Ці варіанти з Trp в положеннях 4, 8 і 11 (А, Б і В відповідно) поводять себе подібно до індоліцидину-L, але не індо­ліцидину-W (для порівняння див. рис. 9), що дає підставу припустити відповідальність сумарних властивостей мно­жинних Trp індоліцидину-W за його незвичайний спектр КД. Безпосередні ЯМР вимірювання і моделювання молекулярної динаміки малих пептидів у воді чітко показують, що пролінові (Pro) залишки в оточенні ароматичних залишків (Ar) формують повороти типу VI через стекінг ароматичних залишків з проліновим кільцем. Індоліцидин містить дві Ar-Pro-Ar послідовності (Trp6-Pro7-Trp8 i Trp9-Pro10-Trp11) на додаток до Leu2-Pro3-Trp4 послідовності. Можна сподіватися, що всі ці три ділянки формують пово­роти. Більш того, дві сусідні Ar-Pro-Ar можуть зближувати їхні Trp залишки і тим самим створювати умови для екситонового спарювання між Trp. Досить сильний дуплет спостерігається в спектрах КД для індоліцидину-W у міцелах SDS (рис. 9 Б) і дуплет у половину цієї сили -- для індоліцидину-W у мембранах. Останнє узгоджується з можливістю того, що в мембранах лише одна з двох Ar-Pro-Ar ділянок має стекінг-конформацію, в той час як у міцелах таку конформацію мають обидві послідовності. Передбачається, що подібний стекінг стабілізує структуру індоліцидину-W порівняно з іншими аналогами, що відповідає температурній інваріантності спектра КД для пептиду дикого типу в межах 195--200 нм (рис. 9 Б).

Щоб унаочнити конформацію мембранозв’язаного індоліцидину, ми розробили молекулярні моделі, використовуючи ΨΨ кути, які відповідають поворотам типу VІa. Одну таку модель з Trp6-Pro7-Trp8 у подібній конформації показано на рис. 11. Вона демонструє, що Trp залишки дійсно можуть бути упакованими навколо цис-Pro, стабілізуючи поворот. Цікаво, що конформація індоліцидину, яка показана на рис. 11, містить триптофани і заряджені залишки на протилежних поверхнях. Це дає підставу вважати, що амфіпатична конформація є важливим чинником його високої мембранної активності.

Оскільки Trp залишки мають винятково виражену спорідненість до мембранних поверхонь, проникненню індоліцидину-W у мембрани повинні сприяти максимальні контакти Trp з поверхнею. Ми припускаємо, що такі контакти стабілізують Ar-Pro-Ar повороти на поверхні, яка вже має перевагу над водною фазою, -- процес, позначений нами як “конформаційна селективність”. Ця “конформаційна селективність” і є проявом загального принципу спряженості

зв’язування і згортання для білкових систем з “нерегулярними” вторинними структурами.

Дослідження кінетичного контролю білкового вбудовування в мембрани

За визначенням, кінетичний контроль полягає в існуванні залежності енергії системи від того шляху, яким ця система опинилася в даній точці конформаційного простору. На відміну від цього, за термо­динамічного контролю енергія залежить лише від конформаційної координати, в якій ця система перебуває зараз. Характерною рисою кінетичного контролю є існування перехідних “метастабільних” кон­формацій у процесі вбудовування білків у мембрану. Наступним завданням була ідентифікація таких конформацій при взаємодії натив­ного і мутантних форм цитохрому b5 i мелітину з різними ліпідними мембранами.

Термічна активація переходу між двома кінетично відмінними формами цитохрому b5. Характеризацію переходу цитохрому b5 з вільної у міцно зв’язану форму, існування яких пов’язувалося або з вибором ліпіду, або з методом реконструкції білка в ліпідний бішар (Enoch, Strittmatter, 1979; Tennyson, Holloway, 1986), проводили шляхом вимірювання температурної залежності відносних квантових виходів флуоресценції нативного і мутантного неполярного пептиду цитохрому b5 (NPP) у ПОФХ (рис. 12). Перше температурне сканування (відкриті символи) проходить через незворотний перехід. Однак, якщо тільки проба була один раз нагріта, температурна залежність укладалася в пряму лінію (затемнені символи) незалежно від того, гріється проба чи охолоджується. Наведені вище дані показують, що взаємодія цих двох пептидів з мембраною не може бути описана одноступінчастим процесом. До досягнення кінцевої конформації білок має проходити через метастабільний “перед-зв’язаний” стан. Перехід із цього стану в стабільнішу конформацію досягається лише нагріванням до температури вище 50 оС і є незворотним.

Наявність двох чи більше станів при мембранній взаємодії нагадує попередні спостереження двох типів взаємодії b5 з мембранами. Тому здавалося логічним порівняти обмінюваність b5 у передінкубованому та інтактному станах. Експериментальний протокол був таким: b5 (нативний або мутантний) змішували з ПОФХ везикулами в молярному співвідношенні 1:400, що забезпечує повне зв’язування білка. Після інкубації протягом 3 год при температурі 25 оС пробу розділяли на дві частини; одну порцію інкубували ще 4 год при 25 оС, другу -- витримували протягом 20 хв при 50 оС, щоб мембранозв’язуючий домен набув свою кінцеву конформацію (подальше нагрівання могло б призвести до суттєвої втрати гему). Далі проби повертали до 25оС і до кожної з них додавали рівні кількості 9,10-БФХ везикул, так що білково-ліпідне співвідношення складало 1:800. Втрату інтенсив­ності флуоресценції вимірювали з огляду обміну білка з ПОФХ у БФХ везикули (рис. 13).

Як видно з цього рисунка, після початкового падіння інтенсивності флуоресценції внаслідок розведення подальше зменшення відбувалося зі швидкістю, яка залежала від попередньої термічнoї обробки зразка. Швидкість обміну мутант­ного цитохрому b5 між ПОФХ і БФХ везикулами є повільнішою у випадку зразка, що зазнав попередньої інкубації при підвищеній темпе­ратурі.

Ми передбачаємо таку по­слідовність подій у процесі зв’я­зування b5 з ліпідною везикулою. Спочатку білок зв’язується з мембра­ною в метастабільному “перед­зв’язаному” стані. На цій стадії зв’язування дуже нестійке, і білок може легко обмінюватися. Для переходу до справді зв’язаного стану необхідно подолати енергетичний бар’єр, однак як тільки він пройдений, ця нова конформація білка стає переважаючою. Таким чином, посилена динаміка флуктуацій, індукована нагріванням (яке було описане раніше), сприяє подоланню енергетичного бар’єра. У цей момент білок міцно зв’язаний і може обмінюватися лише дуже повільно. Структурною особливістю остаточно вбудованої “міцно зв’язаної” форми порівняно з метастабільною “вільно зв’язаною“ може бути транслокація С-кінця NPP на транс-сторону мембрани.

Кінетика переходу мелітину з поверхневої в транс-мембранну конформацію у цвітеріонних мембранах. Кінетику зв’язування мелітину з мембранами можна спостерігати або по збільшенню інтенсивності флуоресценції після додавання ПОФХ, або по зменшенню її після додавання БФХ. Кінетика зв’язування є складною і залежить від виду ліпіду. Після початкового падіння інтенсивності спостерігається повільне відновлення у випадку менш глибокого залягання гасника (4, 5-БФХ) або повільне зменшення -- у випадку глибше розташованих гасників (6, 7; 9, 10 і 11, 12- БФХ). При зв’язуванні з ПОФХ повільна компонента кінетики не виявляється. Інкубація при більш високій температурі навіть призводить до сильнішої взаємодії з глибинними гасниками порівняно з поверхневими.

Для кількісного вивчення залежного від глибини гасіння флуоресценції мелітину було застосовано розроблений раніше РА, отримані за допомогою якого результати наведено на рис. 14. Усі параметри харак­теризуються складною кінетикою через пере­ходи між різними популяціями з різною глибиною проникнення. Додатковим  свідченням мно­жинних конформацій є той факт, що дисперсія профілю гасіння на рис. 14 набагато ширша від такої для модельної сполуки, ТОЕ.

Важливо підкреслити, що кінетика гасіння ліпідом не пов’язана з кінетикою зв’язу­вання, оскільки ніяких змін інтенсивності флуоресценції ме­літину не було помічено через 10 с після додавання ПОФХ мембран. Кінетика обміну мелітину між ПОФХ і БФХ везикулами, доданими згодом (даних не наведено), демонструє наявність обмінюваної і необмінюваної форм пептиду подібно до цитохрому b5 (див. попередній підрозділ). Включення мелітину в мембрану може бути представлено так:

•- швидке зв’язування з мембраною (часова шкала в секундах);

•- повільне занурення у бішар, що видно по збільшенню інтенсивності у випадку 4,5-БФХ та по зменшенню її у випадку інших бромоліпідів (часова шкала у хвилинах і годинах).

Ми передбачаємо таку низку подій при зв’язуванні мелітину з бішаром. Мелітин зв’язується з поверхнею мембрани. Така конформація є метастабільною, і білок може обмінюватися між везикулами. Утворення стабільної конформації призводить до переміщення Trp-19 ближче до центра бішару і залучає переорієнтацію (можливо, і агрегацію) мелітинових молекул поперек бішару. Зв’язаний мелітин характеризується повільним встановленням рівноваги між різними конформаціями білка. Зростання температури або безпосередньо полегшує транслокацію частини молекул у бішар, або робить це за рахунок збільшення латеральної дифузії у випадку залучення агрегації.

Структурно-функціональні прояви дії кінетичного контролю вбудовування мелітину в аніонні та цвітеріонні мембрани. Здатність мелітину набувати транс-бішарову орієнтацію і, як наслідок, переходити в барельно-агрегаційний стан передбачалася у вигляді основи пермеабілізації фосфохолінових везикул. Таким чином, вирішальним є питання, чи здатний мелітин набувати транс-бішарову конформацію. Відомо, що орієнтація αα-спіралі відносно мембран може бути визначена шляхом вимірювань КД спіраль­них пептидів, вбудованих у ліпідні бішари, орієнтовані на кварцовій пластині (орієнто­ваний КД - ОКД). Коли пла­стину зорієнтованo перпен­дикулярно оптичній осі, спіральні пептиди, розміщені паралельно поверхні мембрани, мають спектри з мінімумами на 208 і 222 нм. Пептиди, орієнтовані перпендикулярно поверхні, мають спектр з єдиним мінімумом на 222 нм.

Спектри мелітину в орієнтованих ПОФХ і ПОФГ бішарах за високого ступеня гідратації показано на панелях А і В відповідно (рис.15). Для зразків, підготовлених і врівноважених при температурі 23 оС, спектри ОКД мелітину як у ПОФХ, так і в ПОФГ відповідають спектрам, очіку­ваним для спіралей, орієн­тованих паралельно поверхні бішару, про що можна судити по домінантному мінімуму на 208 нм. Після нагрівання зразків з подальшим досягненням рівноваги при 23 оС спектр мелітину для ПОФГ не змінювався, у той час як для ПОФХ спектр змінювався на такий з домінантним мінімумом на 222 нм (криві 2 на панелях А і В, рис. 15). Ми використали в моделюванні відносні популяції поверхневого (su) i вбудованого (in) мелітину для описання спектра пептиду в ПОФХ до нагрівання. Панель Б (рис. 15) показує, що співвідношення su:in = 1,1 задовільно пояснює спектр. Тому ми можемо зробити досить обгрунтований висновок, що мелітин здатний набувати транс-мембранну орієнтацію в ПОФХ, але не в ПОФГ. Те, що він знаходиться лише в орієнтації, паралельній ПОФХ бішарам, за відсутності нагрівання, відповідає наявності кінетичного бар’єра вбудовування, який, без сумніву, збільшується у в’язкому оточенні орієнтованих бішарів.

Функціональне значення кінетичного контролю транслокації мелітину було досліджено за допомогою розробленого нами методу визначення механізму мембранної пермеабілізації. Метод грунтується на диференційному вивільненні співінкапсульованих маркерів різного розміру. Попередньо везикули наванта­жували флуоресцентно міченими декстранами ФД-4 (4,4 кДа) і ФД-70 (50,7 кДа), а потім інкубували з мелітином. Відносне вивільнення двох маркерів кількісно визна­чається за допомогою проточної кювети, розміщеної в спектро­флюориметрі. Пептиди, що утворюють пори, які є каналами будь-якого типу з обмеженими отворами, будуть викликати витікання вмісту везикул у залежності від розмірів присутніх молекул. Однак, якщо пептид діє як детергент і “розчиняє” мембрану, то різниці у вивільненні маркерів різного розміру не повинно бути (рис. 16).

Встановлено, що мелітин при взаємодії зі цвітеріонними ПОФХ мембранами стимулює вивільнення обох маркерів, але пік ФД-4 значно більший від піка ФД-70 у профілі елюції (рис. 17). Це вказує, найімовірніше, на утворення за цих умов пор діаметром 25--30 Е. Показано, що, на відміну від ПОФХ, пермеабілізація аніонних ПОФГ мембран характеризується низькою селективністю -- відношення виходу ФД-4 до ФД-70 зменшується до 1,2--1,4 (порівняно з 3,8 для ПОФХ). Показано також, що ефективність пермеабілізації значно нижча в аніонних мембранах. Таким чином, можливість транслокації мелітину в транс-бішарову конформацію, зафіксована методами КД, корелює з функціональними харак­теристиками дії на різні мембрани. Варто додати, що розуміння природи ліпідної специфічності мембранної пермеабілізації є важливим аспектом розробки пеп­тидних антибіотиків, які мають бути активними проти бактеріальних мем­бран, що несуть значний негативний заряд, і нейтральними до клітинних мембран організму. Подані нами результати висвітлюють важливість розуміння термодинамічного і кінетичного контролю мембранного вбудовування для цих і багатьох інших теоретичних і практичних завдань.

Концептуальна модель пост-трансляційного вбудовування білків у мембрану

Отримані нами результати з вивчення термодинаміки і кінетики взаємодії нативних та модельних білків і пептидів з мембранами дозволяють запропонувати наступну концептуальну модель спонтанного пост-трансляційного вбудовування білків у ліпідні мембрани (рис. 18).

Основною рисою моделі є наявність проміжного стану (фолдингового інтермедіату) при переході від початкової водорозчинної до остаточної мембрановбудованої форми білка. Він являє собою аналог стану “розплавленої глобули”, що є необхідним проміжним етапом фолдингу глобулярних білків, і так само характеризується високим рівнем вторинної структури і низьким рівнем нативних третинних контактів. По відношенню до ліпідного бішару білок у цьому стані знаходиться в поверхневій зоні, яка має суттєву товщину. Другою важливою рисою моделі є наявність як термодинамічного, так і кінетичного контролю над вбудовуванням білків у мембрани та формуванням функціонально активної конформації. Перехід від водорозчинної до проміжної форми перебуває під термодинамічним контролем. На противагу цьому, остаточне вбудовування відбувається здебільшого за кінетичного контролю. Поширюючи цю концептуальну модель на співтрансляційне вбудовування конституційних мембранних білків, ми пропонуємо вважати, що функція комплексу транслокону з термодинамічної точки зору полягає в подоланні кінетичного бар’єра на шляху до остаточного вбудовування, підвищуючи тим самим ефективність формування функціонально активної конформації білкової молекули.

ВИСНОВКИ

1.        Запропоновано і обґрунтовано структурно-термодинамічну концепцію вбудовування білків в мембрани, згідно з якою спонтанне вбудовування неодмінно проходить через фолдинговий інтермедіат. Останній має конформацію, близьку до “розплавленої глобули”, і розміщується в поверхневій зоні ліпідного бішару. Передбачається, що у випадку співтрансляційного вбудовування транслоконовий комплекс призводить до зниження кінетичного бар’єра і тим самим сприяє мембранному вбудовуванню та набуттю білком активної конформації.

2.        Встановлено, що вбудовування білків у мембрани та формування функціонально активної конформації перебувають як під термодинамічним, так і кінетичним контролем:

а)        термодинамічний контроль здійснюється на початкових етапах вбудовування, які включають взаємодію з поверхневою зоною ліпідного бішару та формування вторинної структури білка;

б)        кінетичний контроль здійснюється на подальших етапах вбудовування, а саме - на стадіях формування третинної/четвертинної структури білка та встановлення остаточної (цис або транс) мембранної топології.

3.        Доведено, що взаємодія білків з поверхневою зоною мембрани характеризується неадитивністю електростатичних та гідрофобних взаємодій. Запропоновано правила, які дозволяють обраховувати вільну енергію мембранного зв’язування, враховуючи обидві компоненти. Показано, що ефективний заряд пептиду обернено пропорційний його гідро­фобності. Щоб обрахувати його величину, треба зменшити номінальний заряд на 20 % на кожні 3 ккал/моль гідрофобної енергії.

4.        Кількісно охарактеризовано енергетичну спряженість процесу взаємодії білок–поверхнева зона мембрани з формуванням вторинної структури білка. Порівнянням енергетики мембранного зв’язування нативного та енантіомерного мелітину встановлено, що вільна енергія формування α-структури в поверхневому шарі мембрани становить 0,41±0,06 ккал/моль на амінокислотний залишок. Аналіз енергетики кооперативного зв’язування модельного пептиду WLLLLL дозволив встановити величину вільної енергії формування β-структури, яка дорівнює 0,5±0.1 ккал/моль на залишок.

5.        Розроблено, вдосконалено та впроваджено в науково-дослідну практику низку флуоресцентних методів вивчення термодинамічних, кінетичних і структурно-функціональних характеристик білково-мембранних взаємодій. Створено експеримен­тальні і обчислювальні підходи, що дозволяють мінімізувати і коригувати артефактні ефекти розсіювання світла у флуоресцентних експериментах з мембранами. Запро­по­нований метод розподільного аналізу, який дає змогу визначати не лише глибину занурення флуоресцентного зонда в мембрани, а й ступінь його експонованості в ліпідну фазу. Розроблено флуоресцентні методики характеризації білкових пор у мембранах.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Ladokhin A. S. Fluorescence spectroscopy in peptide and protein analysis // Encyclopedia of Analytical Chemistry: Instrumentation and Applications / Ed. R. A. Meyers. – New York: John Wiley and Sons, 2000. – P. 5762-5779.
2. Ladokhin A. S. Distribution analysis of depth-dependent fluorescence quenching in membranes: a practical guide // Meth. Enzymol. - 1997. – Vol. 278. – P. 462-473.
3. Ladokhin A. S., Wimley W. C., Hristova K., White S. H. Mechanism of leakage of contents of membrane vesicle determined by fluorescence requenching // Meth. Enzymol. - 1997. – Vol. 278. – P. 474-486.
4. White S. H., Wimley W. C., Ladokhin A. S., Hristova K. Methods for determining the energetics of peptide-bilayer interactions // Meth. Enzymol. - 1998. – Vol. 295. – P. 62-87.
5. Ладохин А. С. Равновесная динамика белка. Изучение собственной флюоресценции мелитина // Биополимеры и клетка. – 1990. – Т. 6, № 4.  C. 84-90.
6. Ladokhin A. S., Wang L., Steggles A. W., Holloway P. W. Fluorescence study of a mutant cytochrome b5 with a single tryptophan in the membrane binding domain // Biochemistry. - 1991. – Vol. 30, N 42. – P. 10200-10206.
7. Ladokhin A. S., Malak H., Johnson M. L., Lakowicz J.R., Wang L., Steggles A.W., Holloway P. W. Frequency-domain fluorescence of mutant cytochrome b5 // Time-resolved laser spectroscopy in biochemistry III. Proceedings SPIE. – 1992. – Vol. 1640. – P. 562-569.
8. Ladokhin A. S., Holloway P. W., Kostrzhevska E. G. Distribution analysis of membrane penetration by depth dependent fluorescence quenching // J. Fluorescence. - 1993. – Vol. 3, N 2. - P. 195-197.
9. Ladokhin A. S., Wang L., Steggles A. W., Malak H., Holloway P. W. Fluorescence study of a temperature induced conversion from the "loose" to the "tight" binding form of membrane-bound cytochrome b5 // Biochemistry. - 1993. – Vol. 32, N 27. – P. 6951-6956.
10. Tretyachenko-Ladokhina V. G., Ladokhin A. S., Wang L., Steggles A. W., Holloway P. W. Amino acid substitutions in the membrane-binding domain of cytochrome b5 alter its mem­brane-binding properties // Biochim. et biophys. acta. - 1993. – Vol. 1153, N 2. – P. 163-169.
11. Ladokhin A. S., Wimley W. C., White S. H. Leakage of membrane vesicle contents: Determination of mechanism using fluorescence requenching // Biophys. J. - 1995. – Vol. 69, N 5. – P. 1964-1971.
12. Ladokhin A. S., Holloway P. W. Fluorescence of membrane-bound tryptophan octyl ester. A model for studying intrinsic fluorescence of protein-membrane interactions // Biophys. J. - 1995. – Vol. 69, N 2. – P. 506-517.
13. Ladokhin A. S., Holloway P. W. Fluorescence quenching study of melittin-membrane interactions // Укр. біохім. журн. - 1995. – Т. 67, № 2. – С. 34-40.
14. Ladokhin A. S., Brand L. Evidence for an excited-state reaction contributing to NADH fluorescence // J. Fluorescence. - 1995. – Vol. 5, N 1. – P. 99-106.
15. Petrushenko Z. M., Negrutskii B. S., Ladokhin A. S., Budkevich T. V., Shalak V. F., El’skaya A. V. Evidence for the formation of an unusual ternary complex of rabbit liver EF-1α with GDP and deacylated tRNA // FEBS Lett. - 1997. – Vol. 407, N 1. – P. 13-17.
16. Ladokhin A. S., Selsted M. E., White S. H. Bilayer interactions of indolicidin, a small antimicrobial peptide rich in tryptophan, proline, and basic amino acids // Biophys. J. - 1997. – Vol. 72, N 2. – P. 794-805.
17. Ladokhin A. S., Selsted M. E., White S. H. Sizing membrane pores in lipid vesicles by leakage of co-encapsulated markers: Pore formation by melittin // Biophys. J. - 1997. – Vol. 72, N 4. – P. 1762-1766.
18. White S. H., Wimley W. C., Ladokhin A. S., Hristova K. Protein folding in membranes: pondering the nature of the bilayer milieu // Biol. skr. Kgl. dan. Vid. selsk. - 1998. – Vol. 49. – P. 99-106.
19. Wimley W. C., Hristova K., Ladokhin A. S., Silvestro L., Axelsen P. H., White S. H. Folding of b-sheet membrane proteins: a hydrophobic hexapeptide model // J. Mol. Biol. - 1998. – Vol. 277, N 5. – P. 1091-1110.
20. Ladokhin A. S. Evaluation of lipid exposure of tryptophan residues in membrane peptides and proteins // Anal. Biochem. - 1999. - Vol. 276, N 1. - P. 65-71.
21. Ladokhin A. S., Selsted M. E., White S. H. CD spectra of indolicidin antimicrobial peptides suggest turns, not polyproline helix // Biochemistry. - 1999. – Vol. 38, N 38. – P. 12313-12319.
22. Ladokhin A. S., White S. H. Folding of amphipathic α-helices on membranes: Energetics of helix formation by melittin // J. Mol. Biol.  1999. – Vol. 285, N 4. – P. 1363-1369.
23. Ladokhin A. S. Analysis of protein and peptide penetration into membranes by depth-dependent fluorescence quenching: Theoretical considerations // Biophys. J. - 1999. – Vol. 76, N 2. – P. 946-955.
24. Ladokhin A. S. Red-edge excitation study of non-exponential fluorescence decay of indole in solution and in a protein // J. Fluorescence. - 1999. – Vol. 9, N 1. – P. 1-10.
25. Ladokhin A. S., Jayasinghe S., White S. H. How to measure tryptophan fluorescence in

mem­ branes properly, and why bother? // Anal. Biochem. - 2000. – Vol. 285, N 2. – P. 235-245.

26. Osapay K., Tran D., Ladokhin A. S., White S. H., Henschen A. H., Selsted M. E. Formation and characterization of a single Trp-Trp crosslink in indolicidin that confers protease stability without altering antimicrobial activity // J. Biol. Chem. - 2000. – Vol. 275, N 16. – P. 12017-12022.
27. Ladokhin A. S., White S. H. Protein chemistry at membrane interfaces: Non-additivity of electrostatic and hydrophobic interactions // J. Mol. Biol. - 2001. – Vol. 309, N 3. –

P. 543-552.

28. Ladokhin A. S. On the interpretation of decay-associated spectra in proteins // Біополімери і клітина. – 2001. - Т. 17, № 3. – С. 221-224.
29. White S. H., Ladokhin A. S., Jayasinghe S., Hristova K. How membranes shape protein structure // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, N 35. – P. 32395–32398.
30. Ladokhin A. S., White S. H. Alphas and taus of tryptophan fluorescence in membranes // Biophys. J. – 2001. – Vol. 81, N 3. – P. 1825–1827.
31. Ladokhin A. S., White S. H. ‘Detergent-like’ permeabilization of anioinic lipid vesicles by melittin // Biochim. et biophys. аcta. – 2001. – Vol. 1514, N 2. – P. 253-260.
32. Ladokhin A. S. Structural dynamics of aqueous and membrane-bound melittin // Book of Abstracts III Congr. Eur. Soc. Photobiology. -Вudapest, 1989. – Р. 243.
33. Ladokhin A. S., Wang L., Steggles A. W., Malak H., Lakowicz J.R., Holloway P. W. Fluorescence study of a mutant cytochrome b5 with a single tryptophan in the membrane-binding domain // Abstracts of the Fifth Symposium of the Protein Society. – Baltimore, 1991. – P. 129.
34. Ladokhin A. S., Chikishev A.Yu., Kamalov V.F., Lebedeva N.V. Equilibrium dy­na­mics of melittin studied by intrinsic fluorescence // Biophys. J. - 1991. – Vol. 59. – P. 359a.
35. Ladokhin A. S., Kostrzhevska E. G., Shcherbatska N. V., Demchenko A.P., Holloway P.W. Study of melittin-membrane complex. Evidence for heterogeneity in depth distribution of protein // FASEB J. – 1992. – Vol. 6. – P. A85.
36. Ladokhina-Tretyachenko V. G., Ladokhin A. S., Wang L., Steggles A.W., Holloway P.W. Studies of cytochromes b5 with amino acid residues in the membrane binding domain replaced by leucine // FASEB J. – 1992. – Vol. 6. – A85.
37. Ladokhin A. S., Brand L. Steady-state and dynamic fluorescence of NADH in solution and bound to liver alcohol dehydrogenase // Biophys. J.– 1993. –Vol. 64, N 2. – P. A53.
38. Ladokhin A. S. Distribution analysis of membrane penetration by depth dependent fluorescence quenching // Biophys. J. – 1993. – Vol. 64, N 2. – P. A290.
39. Ladokhin A. S. Configurational relaxation of the solvent shell of the indole fluorophore in solution and in a protein // Biophys. J. - 1995. – Vol. 68, N 2. - P. A192.
40. Ladokhin A. S., Selsted M. E., White S. H. Interaction of antimicrobial peptide with membranes // Biophys. J.– 1996. –Vol. 70, N 2. – P. A447.
41. El’skaya A. V., Negrutskii B. S., Petrushenko Z. M., Ladokhin A. S., Budkevich T. V., Shalak V. F. A possible role of EF-1α in tRNA/aminoacyl-tRNA channeling during higher eukaryotic protein synthesis // FASEB J.– 1997. –Vol. 11. – P. A1233.
42. Ladokhin A. S., White S. H. Partitioning-folding coupling: Energetics of melittin folding on membranes // Biophys. J. - 1998. – Vol. 74, N 2. – P. A305.
43. Ladokhin A. S., White S. H. Interplay of hydrophobic and electrostatic interactions in membrane partitioning of unfolded peptides // Biophys. J. - 1999. – Vol. 76, N 1. – P. A68.
44. Ladokhin A. S. Evaluation of lipid exposure of tryptophan residues in membrane proteins and peptides // Biophys. J. - 2000. – Vol. 78, N 1. – P. A162.
45. Ladokhin A. S., White S. H. Protein folding in membranes: Thermodynamic measurements of helix insertion // Biophys. J. - 2000. – Vol. 78, N 1. – P. A14.
46. Ladokhin A. S., Jayasinghe S., White S. H. How to measure tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? // Biophys. J.– 2000. –Vol. 78, N 1. – P. 127A.
47. Ladokhin A. S., Isas J.M., Haigler H.T., White S.H. Interface-directed membrane insertion of proteins: from a general concept to an insertion pathway // Biophys. J.– 2001. –Vol. 80, N 1. – P. 539A.

анотації

       Ладохін О.С. Молекулярно-біологічні аспекти білково-мембранних взаємодій: термодинамічний і кінетичний контроль вбудовування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено встановленню загальних принципів та молекулярних механізмів спонтанного вбудовування білків у мембрани і набуття ними активної конформації. Запропоновано і обґрунтовано структурно-термодинамічну концепцію білкового вбудовування, згідно з якою воно неодмінно проходить через фолдинговий метастабільний інтермедіат. Вивчено взаємовідношення кінетичного і термодинамічного контролю, які здійснюються на різних стадіях вбудовування і фолдингу мембранних білків. Доведено, що білки взаємодіють з поверхневою зоною мембрани за відсутності адитивності електростатичних та гідрофобних взаємодій. Кількісно охарактеризовано енергетичну спряженість процесу взаємодії білок-поверхнева зона мембрани з формуванням вторинної структури білка. Встановлено, що різні типи вторинної структури (α-спіраль і β-складка) мають близькі вільні енергії фолдингу. Розроблено, вдосконалено та впроваджено в науково-дослідну практику низку флуоресцентних методів вивчення термодинамічних, кінетичних і структурно-функціональних характеристик білково-мембранних взаємодій.

Ключові слова: вбудовування білків у мембрани, термодинамічний і кінетичний контроль, фолдинг, електростатичні та гідрофобні взаємодії, спряження зв’зування і згортання, флуоресценція.