|
Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна
Леонова Ірина Сергіївна
УДК 597.222: 547.2
МЕХАНІЗМИ НАКОПИЧЕННЯ ЕРГОСТЕРИНУ В КЛІТИНАХ ДРІЖДЖІВ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в НДІ біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник: доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Божков Анатолій Іванович,
Харківський національний університет імені В.Н.Каразіна
Міністерства освіти і науки України,
директор НДІ біології
Офіційні опоненти:
доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник
Іонов Ігор Анатолійович, Харківський національний педагогічний університет імені Г.С. Сковороди Міністерства освіти і науки України, декан природничого факультету, м. Харків
доктор біологічних наук, професор Бондаренко Тетяна Петрівна,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, м. Харків
Провідна установа:
Львівський національний університет імені Івана Франка (кафедра генетики і біотехнології) Міністерства освіти і науки України, м. Львів
Захист відбудеться “8” червня 2005 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. ІІІ-15.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий “5” травня 2005 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Однією з центральних проблем сучасної біохімії є дослідження молекулярних механізмів адаптації, які спрямовані на перебудову системи метаболізму відповідно до вимог факторів середовища. Актуальність дослідження відповідних реакцій на дію екзо- і ендогенних факторів зумовлена, тим що без знань цих механізмів неможливо зрозуміти такі фундаментальні явища, як онтогенез, розвиток патологий та інші. Зазначенні питання є темою досліджень фахівців різних наукових напрямків. Основна частина робіт присвячена вивченню первинного обміну – реакцій, подібних у всіх живих організмів, і пов'язаних із синтезом нуклеїнових кислот та білків. Однак поряд з цим існує величезна кількість метаболічних шляхів, які приводять до утворення і накопичення сполук, властивих лише деяким біологічним видам чи одній хімічній расі – вторинних сполук [Лукнер М., 1979; Zinser E., 1993]. Сучасні дослідження показують, що продукти вторинного обміну можуть як опосередковано, так і безпосередньо впливати на первинний обмін і, таким чином, на структурно-функціональні характеристики клітини: інтенсивність проліферації, швидкість старіння [F. Ness, 1998].
У зв'язку з цим вивчення впливу різних факторів на накопичення продуктів вторинного обміну і його можливий взаємозв'язок зі структурно-функціональним станом клітини становить інтерес для розуміння регуляції метаболізму в процесі адаптації.
Вторинний метаболізм добре виражений у такого різнобічно вивченого об'єкта, як дріжджі-сахароміцети [Pereira R. 1998; Meunier J.R. et al., 1999], на яких проведений ряд біохімічних, молекулярно-генетичних і геронтологичних досліджень [Matsuyama S., 1999; Nose H, 2002].
Основним вторинним метаболітом дріжджів є стерини, зокрема, ергостерин, на частку якого припадає 60-90% усіх стеринів клітини [Синицкая Н.А., 1993]. Ергостерин є попередником сполук, які мають Д-вітамінну та гормональну активність, тому ергостерин дріжджів становить інтерес для вирішення проблеми авітамінозів групи Д у дітей і молодняку тварин, що є гострм питанням у багатьох країнах світу, у тому числі й в Україні.
Використання клітин дріжджів як харчових і кормових добавок ускладнено через особливості будови їх клітинної стінки [Kapteyn J.C., et al., 1999], на яку припадає до 30% сухої маси клітини [Smith A.E., et al., 2000]. У зв'язку з цим розробка нових способів руйнування або видалення клітинної стінки дріжджів, що дозволить одночасно підвищити вихід цільового продукту, є досить актуальною.
Незважаючи на те, що процес стериноутворення досліджується протягом багатьох років [Yang H., 1996; Yu C., 1996; Dimster-Denk D. et al.,1999], усе ще недостатньо вивченими є питання впливу складу середовища, умов росту клітин дріжджів та віку культури на активність вторинного метаболізму, зокрема, на накопичення ергостерину і взаємозв'язок між первинним і вторинним метаболізмом.
Вивченню цих питань і присвячена дана робота.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися в науково-дослідному інституті біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна в рамках теми “Дослідження екстрацелюлярних ферментів фітопатогенів і їх ролі у формуванні рослинного імунітету” (НДР: 0103U004281).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення механізмів накопичення ергостерину в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae у процесі старіння культури і за різних умов культивування, а також розробка методів гідролітичного руйнування клітинних стінок дріжджів. Відповідно до цього були поставлені такі задачі:
- Вивчення впливу популяційного віку культури на накопичення ергостерину клітинами дріжджів і їх стійкість до осмотичного і температурного шоку.
- Дослідження впливу джерела вуглецю (різні концентрації пивного сусла й етилового спирту) та етапу росту культури, на якому вносили добавку, на вміст ергостерину в клітинах дріжджів.
- Дослідження комплексного впливу іонів кальцію, етилового спирту і різних температурних режимів культивування на накопичення ергостерину клітинами дріжджів.
- Вивчення можливості індукції стериноутворення ферментними комплексами міцеліальних грибів, що руйнують клітинні стінки дріжджів.
Об'єкт дослідження – механізми накопичення ергостерину клітинами дикого штаму пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.
Предмет дослідження – показники вмісту ергостерину й інтенсивності дихання культури дріжджів, динаміка росту культури дріжджів, вміст продуктів перекисного окислення ліпідів, вміст білку і нуклеїнових кислот у біомасі дріжджів.
Методи дослідження – спектрофотометричні (кількість клітин дріжджів у культурі, вміст ергостерина, рівень перекисного окислення ліпідів, вміст нуклеїнових кислот), мікроскопічні (кількість клітин дріжджів, діаметр клітин) метод тонкошарової хроматографії ліпідів, полярографичний метод визначення інтенсивності дихання клітин дріжджів, статистичні методи обробки даних.
Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено, що інтенсивність накопичення ергостерину визначалася як індуктором, так і станом метаболізму клітини на момент впливу. Зміна вмісту ергостерину в клітинах дріжджів залежала не тільки від концентрації етилового спирту у середовищі культивування, але і від етапу росту культури, на якому він був внесений. Сумісне внесення іонів кальцію та етилового спирту у середовище культивування дріжджів спричиняло адитивний ефект при накопиченні ергостерину, що може свідчити про їх регуляторну дію на різних етапах синтезу ергостерину в клітинах дріжджів.
Вперше показано, що комплекс екзогенних гідролітичних ферментів міцеліального гриба Chaetomium globossum Kunze може забезпечити руйнування клітинних стінок дріжджів. Уперше виявлена можливість індукції стериноутворення в клітинах культури дріжджів при їх інкубації з екзометаболітами Chaetomium globossum Kunze. У випадку пролонгованої дії ферментного комплексу виявлявся ефект накопичення ергостерину, що може свідчити про адаптивну роль ергостерину у клітині. Виявлено, що накопичення ергостерину в клітинах дріжджів, до якого призводив вплив комплексу екзогенних ферментів, у ряді випадків може розглядатися як адаптивна реакція клітини на дію екстремальних факторів.
Виявлено, що збільшення популяційного віку культури дріжджів призводило до зниження вмісту ергостерину в клітинах, зменшення розміру клітин, збільшення кількості мертвих клітин у культурі, а також до зниження їх стійкості до теплового й осмотичного шоку.
Практична значимість роботи. Отримані результати свідчать про зміну вихідних характеристик культури клітин дріжджів при тривалому й інтенсивному пасируванні, що необхідно враховувати при використанні культур клітин дріжджів у науковій і практичній діяльності. Застосування комплексу гідролітичних екзоферментів міцеліального гриба Chaetomium globossum Kunze, здатного модифікувати або цілком руйнувати клітинну стінку дріжджів, дозволить:
- одержувати харчові добавки, що мають високу харчову цінність.
- одержувати протопласти дріжджів, необхідні для сучасних біотехнологій і молекулярно-генетичних досліджень.
Підбір умов культивування зможе забезпечити стабільне і більш інтенсивне (в 1,5 – 2 рази у порівнянні з контролем) накопичення ергостерину клітинами дріжджів, дозволить одержати харчову і кормову добавку, збагачену попередником вітаміну Д, що необхідно для профілактики рахіту у дітей і молодняку тварин.
Результати цієї роботи були використані у навчальному процесі біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна і кафедри біотехнології Харківського національного політехнічного університету “Харківський політехничний інститут”, а також при утилізації залишкових пивних дріжджів на ОАТ“Пивзавод “Рогань”.
Особистий внесок здобувача. Самостійно була підібрана і проаналізована література за темою дисертації, здійснена постановка експериментів, вибір досліджуваних показників і статистична обробка отриманих результатів. Усі експерименти проведені самостійно, крім експериментів з руйнування клітинних стінок дріжджів екзометаболітами Chaetomium globossum Kunze, які були виконані разом з В.І. Облак. Аналіз і інтерпретація отриманих результатів проведені разом з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати й основні положення роботи доповідалися на конференції “Научные исследования в наукоградах Московской области: От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям” (Пущино, 2002), конференції “Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии” (Томськ, 2004), VII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта`2004” (Дніпропетровськ, 2004), VI Міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2004) і наукових семінарах у НДІ біології Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна.
Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковані 3 статті і 4 тез доповідей.
Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу і розділів: огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати власних досліджень та їх обговорення (5 розділів), узагальнення отриманих результатів і висновків, а також списку цитованої літератури (260 літературних джерел, з яких 122 іноземних авторів). Робота викладена на 153 сторінках друкованого тексту і містить 15 таблиць і 18 малюнків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Огляд складається з 4-х підрозділів, у яких наведено аналіз наукової літератури щодо метаболізму ергостерину: механізмів синтезу і його регуляції, ролі ергостерину в клітинах дріжджів, а також залежності накопичення ергостерину в клітинах дріжджів середовища культивування. Розібрані питання будови клітинної стінки дріжджів і методи її руйнування. В огляді обґрунтовано вибір напрямків досліджень і наведені способи вирішення задач, що поставлені у роботі.
Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводили на дикому штамі пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.
Динаміку росту культури визначали за кількістю клітин, яку рахували загальнопринятим методом у камері Горяєва, а також по зміні оптичної щільністі при довжині хвилі 550 нм на спектрофотометрі СФ-46 (“ЛОМО”, Росія). Нативність плазматичної мембрани клітин дріжджів оцінювали за допомогою фарбування барвником 0,8% трипановим синім [Seglen P.O., 1976] і виражали у відсотках від загальної кількості клітин. Діаметр клітини вимірювали, використовуючи мікроскоп МБІ-6 з окуляр-мікрометром. Екстракцію стеринів із клітин дріжджів здійснювали за методом Бревика і Оводса в модифікації Вудса [Woods R.A., 1971]. Визначення вмісту ергостерину проводили за допомогою двопроменевої спектрофотометрії при довжині хвилі 200-310 нм на спектрофотометрі Specord UV VIS "Carl Ziess Jena" (Німеччина), максимум поглинання при 281 нм [Яхимович Р.И., 1978], використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 11500 М-1⋅ см-1 [Huber W., 1945], а також за методом тонкошарової хроматографії [Хиггинс Д.А., 1990] і виражали у нмоль на 10 клітин. Інтегральну активність метаболізму клітин дріжджів оцінювали за інтенсивністю ендогенного дихання клітин [Аливердиева Д.А., 2001, Рихванов Е.Г., 2001], яку визначали полярографічно за швидкістю споживання кисню з використанням закритого платинового електроду Кларка [Зеленский М.И., 1986] і виражали у натом О/ хв. на 10 клітин. Інтенсивність вільно-радикального ушкодження оцінювали за вмістом ТБК-активних продуктів перекисного окислення ліпідів у суспензії дріжджів і виражали у нмоль малонового діальдегіду на мг білку. Вміст нуклеїнових кислот визначали після фракціонування за Шмідтом і Тангаузером з наступною спектрофотометрією за методом Спіріна [Спирин А.С., 1958] при довжинах хвиль 260, 270, 290 нм і виражали у мкг на 10 клітин [Сокурова Е.Н., 1973]. Вміст білка досліджували за методом Лоурі в модифікації Міллера [Miller G.L., 1959]. Як стресорні чинники були обрані температурний і осмотичний шок. Тепловому шоку культуру дріжджів піддавали у водяному термостаті з температурою 45 ˚С. Експозиція становила 15, 30 і 60 хвилин [Рихванов Е.Г. и др., 2001]. Для вивчення стійкості клітин дріжджів до осмотичного шоку в культуру дріжджів вносили NaCl до кінцевої концентрації 1,3 М [Albertyn J. et al., 1994]. Експозиція становила 15, 30 і 60 хвилин. Стійкість культур дріжджів оцінювали за кількістю мертвих клітин, пофарбованих барвником трипановим синім. Продуцентами ферментного комплексу були міцеліальні гриби Chaetomium globossum Kunze:Fr., Trichoderma viride Pers.et Harz., Bipolaris sorokiniana Sacc.et Shoem., та Fusarium sp. Статистичну обробку нормально розподілених даних проводили за допомогою методу Стьюдента-Фішера [Лакин Г.Ф., 1990]. Рангову кореляцію обчислювали за Спірманом.
Основні результати та їх обговорення
Зміна деяких морфофункціональних характеристик у процесі тривалого культивування дріжджів. Старіння клітинних культур внаслідок численних пересаджень, яке веде за собою зміну вихідних характеристик – це загальнобіологічна проблема, що стосується як культур мікроорганізмів, так і рослинних та тваринних клітин. Разом з тим, у наукових дослідженнях і на виробництві часто застосовується тривале й інтенсивне пасирування культур, що може вести до морфофункціональних зрушень у клітинах, обумовлених накопичуванням різних генетичних модифікацій [Божков А.И. и др., 2000; Голтвянский А.В., 2004], внаслідок чого культура клітин втрачає свої вихідні характеристики. Дослідження інтенсивності вторинного метаболізму, про яке судили за вмістом ергостерину в культурі дріжджів, при тривалому інтенсивному пасируванні раніше не проводилися.
Метою даного етапу досліджень було визначення вмісту ергостерину в процесі тривалого культивування дріжджів Saccharomyces cerevisiae (10–15 пасажів – популяційно-“молода” культура і 70-75 пасажів – популяційно-“стара” культура) і деяких морфофункціональних характеристик клітин дріжджів. Пересадження культури проводили кожні 14–16 днів, тобто вік популяційно-“молодої” культури становив 5–6 місяців, а популяційно-“старої” культури – 3-3,5 роки. Виходячи з цього терміни популяційно-“молода” і популяційно-“стара” культура у даному випадку відбивають саме популяційний вік культури дріжджів.
До 14-ї доби росту вміст ергостерину був порівняно невисоким в обох культурах і істотних розходжень виявлено не було. На 21 добу вміст ергостерину в популяційно-“молодій” культурі був на 23% вище, ніж у “старій” (табл. 1).
Таблиця 1
Вміст ергостерину в клітинах популяційно-“молодої” і популяційно-“старої” культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae у контролі та при внесенні у середовище 0,3 % етилового спирту в першу добу культивування (n=20) (середовище росту: 1% глюкоза, 0,5% сусло, 0,5% дріжджовий екстракт)
* - Р < 0,05 у порівнянні з відповідною популяційно-“молодою” культурою
Відповідна реакція на індукцію стериноутворення внесенням 0,3% етилового спирту, яку оцінювали за зміною вмісту ергостерину, спостерігалася в обох культурах. Внесення спирту приводило до збільшення вмісту ергостерину в популяційно-“молодій” культурі на 14 добу росту на 13,7%, а на 21 добу – на 26% у порівнянні з відповідним контролем. У “старій” культурі вміст ергостерину був відповідно на 23% і 47% нижче, ніж у “молодій” культурі (табл. 1).
При підрахунку кількості клітин було виявлено, що популяційно-“молода” і популяційно-“стара” культури різнілися за кількістю живих і мертвих клітин (мал. 2). Кількість мертвих клітин у популяційно-“молодій” культурі до 14 доби становила близько 2%, а у популяційно-“старій” – 5%. На 21 добу у популяційно-“молодій” культурі було близько 8% мертвих клітин, а у популяційно-“старій” – 13 % (мал. 1).
Кількість живих клітин у 1 мл популяційно-“молодої” культури на 14 добу росту була на 16%, а до 21 – на 15% більша, ніж у популяційно-“старій” культури дріжджів. Було виявлено, що діаметр клітин у популяційно-“молодій” культурі був на 9 – 10 % більшим за діаметр клітин культури, що пройшла 75 пасажів (мал. 1).
Мал. 1. Кількість живих і мертвих клітин у популяційно-“молодій” (а) і популяційно-“старій” (б) культурах дріжджів Saccharomyces cerevisiae (n=60)
Відомо, що захисні та репараційні системи клітин індукуються ушкодженнями чи прямою реакцією на стрес і активуються для обмеження ушкоджень. При старінні накопичені ушкодження насамперед викликають зниження рівня активності та дезорганізацію захисних систем [Кордюм Е.Л., 2003]. Старіння веде до зменшення інтенсивності та стресіндуцибельності енергетичного метаболізму, нормальний рівень яких є необхідною вимогою для ефективної відповіді клітин на стрес і виживання в стресорних умовах [Toussaint O. et al., 1998]. У зв'язку з цим ми порівнювали стійкість популяційно-“молодої” і популяційно-“старої” культури до теплового та осмотичного стресу.
Мал. 2. Кількість мертвих клітин у 14-добовій популяційно-“молодій” (1) і популяційно-“старій” (2) культурах клітин Saccharomyces cerevisiae після теплового шоку (45° С) (n=10)
Було виявлено, що популяційно-“молода” культура була більш стійкою до температурного впливу (мал. 2). У випадку осмотичного шоку 15- і 30- хвилинні експозиції призводили до збільшення кількості мертвих клітин в обох культурах майже в 2 рази, істотних розходжень між ними не спостерігалося. Через годину від початку впливу кількість мертвих клітин у популяційно-“старій” культурі становила майже 62%, що було в 1,6 разів більше, ніж у популяційно-“молодій”. Таким чином, популяційно-“стара” культура була менш стійкою до стресорних впливів, що виявлялося в значно більшій загибелі її клітин при температурному й осмотичному стресі у порівнянні з популяційно-“молодою” культурою.
Зниження накопичення ергостерину в популяційно-“старій” культурі можна пояснити зменшенням діаметра клітин і збільшенням кількості мертвих клітин у культурі при тривалому й інтенсивному культивуванні. Однак відомо, що для росту і розмноження клітини дріжджів потребують певного вмісту ергостерину [Михайлова Н.П. и др., 1987], тому можливий і зворотний механізм, коли зміна у метаболізмі ергостерину і, як наслідок, зниження його вмісту в культурі клітин, веде до морфологічних змін і зменшення загальної кількості клітин у культурі. Відповідна реакція на індукцію стериноутворення, оцінювана за вмістом ергостерину, була менш вираженою у популяційно-“старій” культурі, отже, ефективність індукції залежить від активності метаболічної системи об'єкта на момент впливу і знижується при збільшенні популяційного віку культури.
У подальших експериментах ми використовували культуру клітин дріжджів, що пройшла не більше 50 пасажів.
Вплив концентрації і терміну внесення джерела вуглецю на накопичення ергостерину в клітинах дріжджів. Відповідно до сучасних уявлень, біосинтез стеринів і, зокрема, ергостерину, у дріжджів регулюється проміжними продуктами вуглеводного обміну і залежить, в основному, від штаму дріжджів, складу живильного середовища і умов культивування [Синицкая Н.А., 1993].
Нами була поставлена задача вивчення активності вторинного метаболізму, яку оцінювали за індукцією накопичення ергостерину в культурі клітин S. cerevisiae, у залежності від концентрації і терміну внесення джерела вуглецю у середовище культивування дріжджів.
Як джерело вуглецю використовували різні концентрації пивного сусла (при наявності і відсутності 1% глюкози у середовищі) і етилового спирту в першу добу росту, а також низькі концентрації етилового спирту на початку експоненціальної і на різних етапах стаціонарної фази росту культури клітин дріжджів.
Мал. 3. Вплив концентрації пивного сусла в середовищі культивування на вміст ергостерину й інтенсивність дихання клітин культури Saccharomyces cerevisiae (21-а доба росту) (n=10)
Оптимальна концентрація пивного сусла для накопичення ергостерину в культурі клітин дріжджів та максимальній активності метаболізму, яку оцінювали за інтегральним показником інтенсивності дихання суспензії дріжджів, становила 15-35%. Подальше збільшення вмісту сусла призводило до зниження накопичення ергостерину і падіння інтенсивності дихання в культурі дріжджів (мал. 3).
При використуванні комбінації 1% глюкози з 25, 50, 75 або 100%-им пивним суслом, максимальний вміст ергостерину виявлявся при рості культури дріжджів на 1% глюкозі і 25% пивному суслі – 28, 3 нмоль на 10 клітин, що відповідало вмісту ергостерину при рості дріжджів на 25%-35% пивному суслі без глюкози. Подальше збільшення концентрації пивного сусла у середовищі призводило до зниження накопичення ергостерину й інтенсивності дихання в культурі дріжджів. Таким чином, спостерігалася дозова залежність, яка виражалася в індукції стериноутворення при рості на середовищі, що містить низькі концентрації джерела вуглецю, і інгібування накопичення ергостерину високими концентраціями вуглецю. Пригнічення утворення вторинних сполук надлишком живильних речовин, зокрема, глюкозою, а також іншими легко засвоюваними джерелами вуглецю, фосфатом і іншими, являє собою загальне явище в культурах мікроорганізмів .
Ріст на різних середовищах може приводити до змін у вторинному метаболізмі, і, як наслідок, до варіацій у накопиченні вторинних метаболітів у клітинах дріжджів, що, у свою чергу, може виявлятися в різній стійкості культур до стресорних впливів. При порівнянні стійкості культур, що виросли на середовищах з різним вмістом пивного сусла (25%, 50%, 75%, 100%) і 1% глюкозою до теплового й осмотичного шоку була виявлена тенденція до збільшення загибелі клітин у культурах, що росли на 75% і 100% пивному суслі і постійному вмісті глюкози (1%).
Різні концентрації джерела харчування, імовірно, діють на різних етапах біосинтезу ергостерину: при внесенні низьких концентрацій пивного сусла відбувається включення вуглецю до ацетату і з ним – у подальший біосинтез стеринів, тобто ефект має місце на початкових етапах синтезу. Збільшення концентрації джерел вуглецю в середовищі культивування призводить до катаболічної репресії [Hongay C. et al., 2002] і, як наслідок, до інгібування дихання і блокуванню кінцевих стадій синтезу ергостерину зі сквалену. Таким чином, внесення різних концентрацій джерел вуглецю у середовище може справляти регуляторний вплив на різних етапах біосинтезу ергостерину.
Оскільки синтез стеринів безпосередньо не пов'язаний з ростом і розмноженням клітин, то довгий час дослідження були спрямовані на пошуки таких субстратів, які були б найбільш ефективними відносно стериноутворення. Ефективність різних джерел вуглецю щодо накопичення стеринів залежить від здатності вуглеводів проникати через клітинну стінку дріжджів. Найбільший приріст ергостерину спостерігався при використанні таких джерел вуглецю, як глюкоза, сахароза та етиловий спирт [Ляпунова Т.С., 1966]. Відомо, що етиловий спирт істотно впливає на динаміку росту культури клітин і метаболізм ліпідів у дріжджів, водоростей та інших одноклітинних організмів [Божков А.И. та ін., 2002; Zhang M. et al., 2000].
Внесення різних концентрацій етилового спирту в культуру дріжджів приводило до різних ефектів: так, при концентрації від 0,3% до 0,9% спостерігалося збільшення вмісту ергостерину в культурі клітин без значної зміни життєздатності клітин. Збільшення вмісту спирту в середовищі до кінцевої концентрації 1,2% – 2,1% супроводжувалося більш значним приростом ергостерину, однак кількість мертвих клітин при цьому також різко зростала. Подальше збільшення концентрації спирту в середовищі культивування до 2,4% – 3,0% спричиняло зниження накопичення ергостерину клітинами дріжджів відносно максимального приросту. Відсоток мертвих клітин при цьому зростав у декілька разів. Це свідчить про високу чутливість клітин дріжджів навіть до невеликих змін концентрації внесеного етилового спирту.
Вивчення ефективності регуляторної дії однакових факторів при їх впливі на різні етапи онтогенезу є загальбіологічною задачею. Відомо, що додаткове внесення кисню протягом стаціонарної фази росту культури дріжджів призводило до ряду змін у метаболізмі, в тому числі й до збільшення накопичення стеринів [Rosenfeld E. et al., 2003]. Зміни у стериноутворенні при внесенні спирту на різних стадіях росту культури дріжджів раніше не вивчалися. Дослідження цього питання становить інтерес для характеристики метаболізму клітин дріжджів у процесі росту культури.
Етиловий спирт вносили до кінцевої концентрації 0,3% на першу, 7-у та 10-у добу росту. Внесення спирту на більш пізніх етапах культивування не приводило до підвищення вмісту ергостерину та змін у швидкості споживання кисню (мал. 4).
Мал. 4. Інтенсивність дихання клітин культури Saccharomyces cerevisiae у процесі культивування (1) і після внесення етилового спирту до кінцевої концентрації 0,3% на першу добу (2), 7 добу (3) і 10 добу (4) росту (n=5)
У мікроорганізмів розрізняють дві основні фази розвитку культури: фазу росту – тропофазу і фазу спеціалізації клітин – ідіофазу. Протягом останньої фази розвиваються характерні для даного організму хімічні і морфологічні особливості, у тому числі і вторинний обмін. Тропофазні клітини мікроорганізмів і ембріональні клітини тваринних організмів і вищих рослин у багатьох відношеннях подібні один одному – їхній метаболізм добре збалансований і забезпечує максимальну швидкість синтезу метаболітів, необхідних для розмноження. На окремих прикладах було показано, що залежність вторинного обміну від фази є наслідком фазозалежного утворення ферментів, які синтезують вторинні сполуки [Лукнер М., 1979].
Оскільки 7 доба росту – це етап переходу від експоненціальної до стаціонарної фази росту культури, то при внесенні етилового спирту в середовище ще спостерігається незначний ефект. Однак на 10 добу культура знаходиться у стаціонарній фазі росту, вторинний метаболізм вже активований, і тому внесення етилового спирту не впливає на накопичення стеринів клітиною. Отже, ефект збільшення вмісту ергостерину в клітинах дріжджів залежить не тільки від концентрації етилового спирту в середовищі культивування, але і від характеристик метаболічної активності системи на момент впливу.
Таким чином, можна говорити про те, що на ранніх етапах синтезу доступність біосистем для ефективного регуляторного впливу з боку екзогенних факторів значно вища, ніж на більш пізніх етапах росту культури (у стаціонарній фазі).
Вміст ергостерину в клітинах дріжджів при використанні різних концентрацій іонів Са, температурних режимів культивування та етилового спирту. Синтез ергостерину – складний процес, регуляція якого може здійснюватися на різних етапах [Hand R.A.et al., 2003], отже, є підстави припустити, що спільна дія декількох індукторів синтезу ергостерину, які діють на різних етапах біосинтезу, здатна, забезпечити адитивний ефект щодо накопичення ергостерину в клітинах дріжджів. У зв'язку з цим становить інтерес дослідження ефективності спільної дії етилового спирту та іонів кальцію на стериноутворення в клітинах дріжджів. Такий підхід дозволить не тільки одержати максимальний ефект, але й вивчити можливі механізми дії етилового спирту та іонів кальцію на стериноутворення.
У першій серії експериментів вивчали вплив іонів Ca на накопичення ергостерину, а також на фізіологічний стан культури дріжджів, який оцінювали за кількістю мертвих клітин, вмістом продуктів перекисного окислення ліпідів і інтенсивністю дихання клітин.
Внесення в середовище культивування CaCl до концентрації 0,1 мг/мл не приводило до достовірних змін досліджуваних показників: вміст ергостерину, кількість мертвих клітин, інтенсивність дихання культури і вміст у ній продуктів перекисного окислення ліпідів були на рівні контролю (табл. 3).
Таблиця 3
Вміст ергостерину, продуктів перекисного окислення ліпідів (визначених за МДА) і інтенсивність дихання суспензії клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae на 14 добу росту культури при внесенні різних концентрацій CaCl у першу добу росту (n=5)
* - Р < 0,05 у порівнянні з контролем
При концентрації CaCl у середовищі 0,5 мг/мл накопичення ергостерину збільшувалося і перевищувало контроль на 26,2%. Вміст продуктів окислення ліпідів у культурі і кількість мертвих клітин залишалися на рівні контролю (табл. 3).
Вміст CaCl у середовищі в концентрації 1,0 мг/мл приводив до зменшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів відносно контролю на 9,2%. Інтенсивність дихання культури клітин дріжджів також знижувалася на 24,3% відносно контролю. Кількість мертвих клітин зростала в 1,9 рази. Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів у культурі істотно не змінювався (табл. 3).
Можна припустити, що збільшення накопичення ергостерину при внесенні іонів кальцію пов'язано з активацією специфічних ферментних систем і активністю мітохондрій, які мають вплив на кінцеві етапи стериногенеза.
У другій серії експериментів для вивчення спільного впливу на накопичення ергостерину іонів кальцію і етилового спирту використовували комбінацію оптимальних концентрацій: CaCl – 0,5 мг/мл, етилового спирту – 0,3%, 0,5% і 1,0% (кінцеві концентрації у середовищі). Вимір показників проводили на 10 і 14 добу росту культури дріжджів. Спільне внесення 1,0% етилового спирту й іонів кальцію в середовище культивування приводило до збільшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів на 14 добу росту майже на 62%. При внесенні тільки іонів Са в концентрації 0,5 мг/мл у живильне середовище вміст ергостерину в клітинах дріжджів зростав на 26% у порівнянні з контролем, а при внесенні тільки етилового спирту – на 40% .
Відомо, що важливим фактором регуляції росту мікроорганізмів є температура, оскільки вона впливає на швидкість біосинтетичних процесів у клітинах і в підсумку – на склад синтезованих продуктів і швидкість росту мікроорганізмів [Феофилова Е.П. и др., 2000]. Було встановлено, що мікроорганізми мають два температурних оптимуми: один для росту, інший – для вторинного метаболізму [Квасников Е.И. и др., 1991].
Оптимальною температурою культивування клітин дріжджів для накопичення ергостерину є 25°С: на 24 добу вміст ергостерину становив біля 20 нмолей на 10 клітин. При культивуванні дріжджів при 30°С кількість ергостерину незначно зростала (мал. 5), однак кількість мертвих клітин у культурі збільшувалась .
Внесення іонів кальцію при рості культури дріжджів при неоптимальному для накопичення стеринів режимі вело до збільшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів тільки у випадку росту при температурі 20°С. При культивуванні клітин дріжджів при температурі 35°С наявність іонів кальцію в середовищі не тільки не призводила до підвищення вмісту ергостерину, а навіть знижувала його на 12%.
| 
