|
ХАРКIВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНIВЕРСИТЕТ
ШЕББАНI МОНА МОХАММЕД
УДК 574.352.3
МЕХАНIЗМИ АДАПТАЦIЇ ТВАРИН РIЗНОГО ВIКУ
ДО СIРЧАНОКИСЛОЇ МIДI
03.00.04 - бiохiмiя
АВТОРЕФЕРАТ
дисертацiї на здобуття наукового ступеня
кандидата бiологiчних наук
Харкiв - 1999
Дисертацiєю є рукопис
Роботу виконано в науково-дослiдному iнститутi бiологiї Харкiвського державного унiверситету Мiнiстерства освiти України
Науковий керiвник: доктор бiологiчних наук, старший науковий співробітник Божков Анатолiй Iванович, завiдувач вiддiлом молекулярної бiологiї та бiотехнологiї науково-дослiдного iнституту бiологiї Харкiвського державного унiверситету Мiнiстерства освiти України
Офiцiйнi опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Бабич Євген Михайлович, завiдувач лабораторiєю крапляних iнфекцiй науково-дослiдного iнституту мiкробiологiї та iмунологiї iм. I.I. Мечнiкова Мiнiстерства охорони здоров'я України
доктор бiологiчних наук, професор Клiменко Анатолiй Iванович, завiдувач кафедрою бiологічних основ фізичного виховання і спорту Харкiвського iнституту фiзичної культури Державного комітету з фізичної культури і спорту України
Провiдна установа: Iнститут геронтологiї (лабораторiя молекулярної генетики) АМН України, м. Київ.
Захист вiдбудеться " 3 " березня 1999 р. о 1515 годинi на засiданнi спецiалiзованої вченої ради К 64.051.17 у Харкiвському державному унiверситетi Мiнiстерства освiти України за адресою: 310077 м. Харкiв, м. Свободи, 4, ауд. III-15.
З дисертацiєю можна ознайомитися в Центральнiй науковiй бiблiотецi Харкiвського державного унiверситету Мiнiстерства освiти України за адресою:
310077 м. Харкiв, м. Свободи, 4.
Автореферат розiсланий " 2 " лютого 1999 р.
Вчений секретар спецiалiзованої вченої ради
кандидат бiологiчних наук,
старший науковий спiвробiтник Падалко В.I.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальнiсть теми. Одним з глобальних факторiв сучасної iнвайронментальної кризи є неухильне зростання вмiсту солей важких металiв у водному середовищi та грунтi (Яницкий, 1994; Сытник, Вассер, 1995). Ця обставина призвела до необхiдностi всебiчних дослiджень впливу солей важких металiв на бiологiчнi системи. На цей час існує велика кiлькiсть робiт щодо первинної або короткотермiнової дiї iонiв металiв на бiологiчнi системи.
Показано, що iони мiдi, яка є одним з найпоширеніших токсикантів, iндукують синтез мРНК металотiонеїнiв у щурiв (Wake, Merser, 1985), дрiжджiв (Thiele et al., 1992) та мiкроорганiзмiв (Mellano, Cooksey, 1988). Регуляцiя синтезу цих бiлкiв здiйснюється на транскрипцiйному рiвнi. Так, для клiтин дрiжджiв показано, що металотiонеїни кодуються локусом CUP1, а його активацiя здiйснюється бiлком ACE1 (Furst et al., 1988). Проте, iндукцiя металотiонеїнiв залежить вiд багатьох факторiв, i не завжди спостерiгається повна кореляцiя мiж концентрацiєю iонiв металiв i синтезом металотiонеїнiв (Blalock et al., 1988). Крiм того, остаточно не вирiшене питання про роль металотiонеїнiв в адаптацiї органiзму до дiї солей металiв. Не дослiджене питання про можливiсть iндукцiї металотiонеїнiв у тварин при тривалому контактi з солями металiв.
Наявні данi про первинний ефект дiї iонiв металiв свiдчать про полiфункцiональний характер їхньої дiї на бiологiчнi системи. Разом з тим, вклад рiзних метаболiчних систем у формування вiдповiдi на дiю iонiв мiдi залишається не ясним.
Одна з центральних проблем сучасної бiологiї пов'язана з механiзмами адаптацiї тварин до дiї iонiв металiв на рiзних етапах онтогенезу. Як вiдомо, здатнiсть органiзму адаптуватися до дiї рiзноманiтних факторiв з вiком зменшується, і це грає важливу роль в тривалостi життя. Механiзми вiкового зниження адаптивностi залишаються малодослiдженими. В цьому вiдношеннi дослiдження вiкових механiзмiв адаптацiї до дiї iонiв мiдi має важливе теоретичне i практичне значення як в розумiннi механiзмiв взаємодiї iонiв мiдi з бiологiчними системами, так i в розумiннi вiкових механiзмiв адаптацiї.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослiдження проводили у вiддiлi молекулярної бiологiї i бiотехнологiї НДI бiологiї Харкiвського держунiверситету в межах теми "Дослiдження механiзмiв дiї ендогенних регуляторiв бiлкової та лiпiдної природи на пролiферацiю клiтин тваринних i рослинних органiзмiв та роль цих регуляторiв в онтогенетичнiй адаптацiї до екзогенних факторiв довкiлля" N ДР 0198U005803, яку включено до координацiйного плану N16 "Механiзми розвитку i старiння бiологiчних систем" за фаховим напрямком "Бiологiя" Мiнiстерства освiти України.
Мета i задачi дослiдження. З'ясувати роль металотiонеїнiв в механiзмах адаптацiї тварин рiзного вiку до тривалої дiї великих доз сiрчанокислої мiдi. Для досягнення мети вирiшували наступнi задачi:
1. Визначити стiйкiсть i здатнiсть молодих і старих тварин адаптуватися до великих доз сiрчанокислої мiдi;
2. Визначити внутрішньоклiтинний характер розподiлу iонiв мiдi на прикладi клiтин печiнки адаптованих i неадаптованих до сiрчанокислої мiдi молодих i старих тварин;
3. Визначити можливiсть iндукцiї металотiонеїнiв iонами мiдi в клiтинах печiнки молодих i старих тварин;
4. Визначити вплив рiзних доз сiрчанокислої мiдi на швидкiсть синтезу i транспорту РНК в клiтинах печiнки;
5. Визначити можливий "захисний" ефект металотiонеїнiв в клiтинах печiнки тварин, адаптованих до дiї iонiв мiдi.
Наукова новизна одержаних результатiв. Показано, що молодi щури (2-3 мiс. вiку) мають бiльшу стiйкiсть i здатнiсть адаптуватися до великих концентрацiй сiрчанокислої мiдi (12,5 мкмоль/100 г маси тварини) порiвняно iз старими тваринами (20-24 мiс. вiку). Здатнiсть до адаптацiї залежить вiд схеми попереднiх введень до органiзму сiрчанокислої мiдi.
Виявлено вiкову рiзницю в характерi внутрішньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi на прикладi клiтин печiнки. Багаторазовi послiдовнi введення низьких доз сiрчанокислої мiдi (5 мкмоль/100 г маси тварини) формують характерний "малюнок" внутрішньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi, який залишається незмiнним i пiсля введення великих доз сiрчанокислої мiдi (12,5 мкмоль/100 г маси тварини), що може забезпечувати стiйкiсть тварин до цього токсиканту.
В цитозолi клітин печiнки молодих щурiв вмiст металотiонеїнiв зростав у бiльшiй мiрi, нiж у старих щурiв пiсля 3-х послiдовних введень до органiзму 5 мкмоль/100 г маси тварини сiрчанокислої мiдi. У молодих тварин ці бiлки зв'язували в 2 рази бiльше iонiв мiдi на 1 мг металотiонеїну порiвняно iз старими.
Низькi дози сiрчанокислої мiдi (менше 5 мкмоль/100 г маси тварини) збiльшували швидкiсть транскрипцiї, а великi дози пригнiчували активнiсть РНК-полiмераз.
Металотiонеїни, що були видiленi з цитозолю клiтин печiнки адаптованих до дiї iонiв мiдi тварин, чинять захисну дiю на мiкросоми в системi in vitro. Так, зниження активностi глюкозо-6-фосфатази мiкросом було в 2 рази нижче в присутностi цих бiлкiв порiвняно з контрольним варiантом.
Практичне значення одержаних результатiв. Показано роль металотiонеїнiв в депонуваннi та внутрішньоклiтинному розподiлi iонiв мiдi, що дозволяє пояснити роль цих бiлкiв в механiзмах адаптацiї. Вiковi особливостi адаптацiї тварин до тривалої дiї сiрчанокислої мiдi визначаються характером внутрішньоклiтинного розподiлу токсиканту, важливу роль в якому вiдiграють металотiонеїни. Здатнiсть тварин до адаптацiї залежить вiд схеми попереднiх введень низьких доз сiрчанокислої мiдi i метаболiчного стану органiзму.
Розроблено схему iндукцiї адаптацiї тварин до дiї сiрчанокислої мiдi, що може бути використана для вивчення вiкових механiзмiв адаптацiї, їхнього змiнювання в онтогенезi, а також для оцiнювання антитоксичних препаратiв.
Особистий внесок здобувача. Роботу з лiтературою i написання огляду лiтератури, експерименти з дослiдження адаптивностi i стiйкостi тварин до сiрчанокислої мiдi, характеру внутрішньоклiтинного розподiлу, зв'язування iонiв мiдi в рiзних компартментах клiтин в системi in vitro було проведено самостiйно. Експерименти з дослiдження впливу сiрчанокислої мiдi на активнiсть генетичного апарату i структуру мембран ендоплазматичного ретикулюму було проведено разом з науковим керiвником. Аналiз та інтерпретацiю одержаних результатiв було проведено самостiйно.
Апробацiя результатiв дисертацiї. Результати i основнi положення роботи доповiдалися на проблемнiй конференцiї Геронтологiчного товариства Росiйської Академiї Наук "Старение и долголетие: системные и междисциплинарные подходы" (Москва, 1997) та наукових семiнарах в НДI бiологiї Харькiвського держунiверситету.
Публiкацiї. За результатами дисертацiйної роботи опублiковано 4 статтi у фахових виданнях.
Структура та обсяг дисертацiї. Дисертацiйна робота складається з вступу i роздiлiв: огляду лiтератури, опису матерiалiв i методiв дослiдження, результатiв власних дослiджень та їхнього обговорення, заключення i висновкiв, а також списку використаних джерел з 200 найменувань. Роботу викладено на 137 сторiнках друкованого тексту, вона мiстить 2 таблицi i 19 рисункiв.
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ
Дослiдження проводили на щурах лiнiї Wistar обох статей 2-х, 3-4-х, 12-ти i 20-24 мiсячного віку, яких утримували на повноцiннiй за мiкроелементами дiєтi.
Розчин сiрчанокислої мiдi (CuSO4.5H2O) готували на фiзiологiчному розчинi (0,95% NaCl) перед введенням та вводили тваринам внутрiшньочеревно за трьома схемами. При одноразовому введеннi (перша схема) використовували дози 4; 5; 10; 12; 12,5 мкмоль/100 г маси тварини. Багаторазове введення сiрчанокислої мiдi здiйснювали у дозi 5 мкмоль (мала доза) кожнi 48 годин (друга схема). За третьою схемою експериментальним тваринам одноразово, двiчi або тричi вводили малi дози, пiсля чого їм вводили летальну дозу сiрчанокислої мiдi 12,5 мкмоль на 100 г маси тварини. В експериментальних тварин оцiнювали тривалiсть наркотичного сну, як описано (Божков и др., 1995), та час загибелi.
Через 24 години пiсля останнього введення малої дози сiрчанокислої мiдi тварин забивали декапитацiєю, видаляли печiнку та гомогенiзували її. Фракцiї ядер, хроматину, мiкросом та цитозолю клiтин печiнки отримували диференцiальним центрифугуванням гомогенату. Для отримання фракцiї хроматину з ядер екстрагували ядернi РНП-частки, як описано (Самарина и др., 1967). Постмiкросомальну фракцiю використовували як фракцiю цитозолю. Бiлки цитозолю подiляли на фракцiї високомолекулярних та низькомолекулярних бiлкiв. До високомолекулярних бiлкiв вiдносили бiлки, що осаджуються 5 %-ною ТХО, до низькомолекулярних - що не осаджуються за цих умов.
У фракцiях ядер, хроматину, мiтохондрiй, мiкросом, високомолекулярних та низькомолекулярних бiлкiв цитозолю визначали вмiст бiлка за методом Лоурi (Lowry et al., 1957) та вмiст iонiв мiдi з N,N-дiетилдiтiокарбаматом натрiя (Новиков и др., 1990). Вмiст мiдi розраховували в мкг на мг бiлка.
Субклiтиннi фракцiї одержували як описане вище. Суспензiї вiдповiдних фракцiй iнкубували з 1.10-5, 1.10-4 та 1.10-3 моль/л сiрчанокислої мiдi на протязi 30 хвилин при 30°C. Бiлки осаджували сумiшшю хлороформметанол (1:2), яку вносили у проби у спiввiдношеннi 4:1. В осадах визначали вмiст мiдi та бiлка як описано вище.
За 1 годину до забивання тварин їм вводили 0,04; 0,2; 0,1; 0,5; 2,5; 5,0; 10,0; 12,5 мкмоль сiрчанокислої мiдi на 100 г маси тварини. За 40 хвилин до забивання щурам вводили по 1,1 МБк [14C]оротової кислоти та по 2 МБк [3H]тiмiдина. Видiляли фракцiю полiсом цитоплазми, як описано (Божков и др., 1991). Ядра одержували за методом (Blobel, Potter, 1968). З ядер видiляли ядернi РНП-частки (Самарина и др., 1967) i потiм гiдролiзували РНК, що входить до складу хроматину (Трудолюбова, 1974). Пiсля вилучення РНК з фракцiй хроматину гiдролiзували ДНК. Кiлькiсть РНК яРНП-часток та РНК i ДНК хроматину визначали двухвильовим методом на спектрофотометрi СФ-46 ("ЛОМО", Росiя). Радiоактивнiсть одержаних фракцiй РНК и ДНК визначали у дiоксановому сцiнтиляторi на сцінтиляцiйному β-спектрометрi Вeckman LS-7800 (USA). Питому радiоактивнiсть розраховували в iмп/(хвилину.мг).
Для визначення активностi РНК-полiмераз ядра видiляли з печiнки iнтактних щурiв та печiнки щурiв пiсля часткової гепатектомiї (12 годин пiсля операцiї). Отримували фракцiї ядер та цитозолю гепатоцитiв як описане вище. Для визначення активностi РНК-полiмерази I+III готували сумiш такого складу: 2.107 ядер, 100 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 10мМ MgCl2, 5 мМ дiтiотреїтола (ДТТ), до 25% глiцерина, 2,5 мг бiлка цитозолю, 0,4 мМ АТФ, ГТФ, ЦТФ и 74 КБк (0,004 мМ) УТФ. Для визначення активностi РНК-полiмерази II готували сумiш 2.107 ядер, 100 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 4 мМ MnCl2, 0,15 М (NH4)2SO4, 5 мМ ДТТ, 2,5 мг бiлка цитозолю, 0,4 мМ АТФ, ГТФ, ЦТФ и 74 КБк (0,004 мМ) УТФ, до 25% глiцерину. Проби iнкубували в присутностi 0,0085, 0,085 и 0,85 М CuSO4.5H2O на протязi 15 хвилин при 27°C. Екстрагували РНК та визначали її кiлькiсть i радiоактивнiсть як описано вище.
В суспензiю мiкросом вносили розчин сiрчанокислої мiдi до остаточної концентрацiї вiд 5.10-7 до 5.10-3 М та iнкубували їх при 30°C 30 хвилин, пiсля чого визначали активнiсть глюкозо-6-фосфатази як описано (Arion et al., 1983), а вмiст малонового дiальдегiду - з тiобарбiтуровою кислотою. Пiсля iнкубування мiкросом iз сiрчанокислою мiддю з концентрацiєю 5 мМ їх роздiляли центрифугуванням у градiєнтi щiльностi сахарози 15-30% при 90000 g 75 хвилин, а розподiл визначали у проточнiй кюветi на спектрофотометрi СФ-46 за довжиною хвилi 280 нм.
При видiленнi металотiонеїнiв цитозоль пiддавали термообробцi при 80°C на протязi 2 хвилин. Термостабiльнi бiлки роздiляли хроматографiєю на колонцi 1,5х40 см з сефадексом G-75 за швидкістю 0,3 мм за хвилину. У фракцiї визначали вмiст бiлка та iонiв мiдi як описано вище.
Усi експерименти повторювали 3-5 разiв, результати оброблювали статистично, використовуючи непараметричнi критерiї оцiнки рiзницi мiж вибірками (Гублер, 1978).
ОСНОВНI РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕННЯ
Здатнiсть тварин рiзного вiку адаптуватися до дiї сiрчанокислої мiдi. Доза сiрчанокислої мiдi 5 мкмоль/100 г маси тварини не викликала загибелi експериментальних тварин. Внутрiшньочеревне одноразове введення сipчанокислої мiдi у кiлькостi 12,5 мкмоль/100 г маси пpизводило до загибелі тварин на протязi 1-2 годин пiсля введення. Тривалiсть життя молодих i старих тварин пiсля одноразового введення 12,5 мкмоль/100 г рiзнилася: якщо молодi щури (2 мiс.) пiсля введення гинули за 85±5 хвилин, то старi (20-24 мiс.) - за 25±5 хвилин.
Якщо тварини одержували одноразову дозу 5 мкмоль/100 г, а через 2 доби їм вводили летальну дозу 12,5 мкмоль/100 г, то загибель наставала значно пiзнiше порiвняно з тваринами, що одержували одноразову летальну дозу. Ще у значнiшiй мiрi збiльшувалася тривалiсть життя щурiв, що одержували дворазове введення сiрчанокислої мiдi у дозi 5 мкмоль/100 г з подальшою летальною дозою (рис. 1).
Рис. 1. Час загибелі 3-5 мiс. щурiв пiсля одноразового внутрішньочеревного введення CuSO4.5H2O у дозi 12,5 мкмоль/100 г маси тiла (1), одного (2), двох (3), чотирьох (4) i шiстьох (5) введень по 5 мкмоль/100 г кожнi 48 г, пiсля чого усi групи одержували 12,5 мкмоль/100 г маси тварини
Однак у найбiльшiй мiрi ефект зниження летальностi для дози 12,5 мкмоль/100 г виявлявся пiсля трьох попереднiх введень 5 мкмоль/100 г сірчанокислої мiдi. При тому тривалiсть життя молодих щурiв збiльшувалася у 9,5 разiв, а старих - тiльки у 4 рази. Низька здатнiсть адаптуватися до сiрчанокислої мiдi в старих тварин корелювала зі зменшенням маси тварин та пригнiченням детоксикацiйної функцiї печiнки на вiдмiну вiд молодих щурiв у тривалому експериментi. Це свiдчить про найбiльший прояв ефекту кумулятивностi iонiв мiдi у старих щурiв порiвняно з молодими, та отже про менший ефект у них iндукованої резистентностi.Отже, багаторазове введення 5 мкмоль/100 г маси сiрчанокислої мiдi супроводжується адаптацiєю органiзму до дiї летальних доз; по-друге, адаптивнiсть залежить вiд схеми попереднiх введень токсиканта та вiку тварин.
Характер внутрiшньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi за одноразових та багаторазових введень в органiзм. Можна припустити, що характер вiдповiдної реакцiї та здатнiсть до адаптацiї буде визначатися функцiонуванням механiзму внутрiшньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi.
Через 24 години пiсля одноразового введення дози 5 мкмоль/100 г найбiльша кiлькiсть iонiв мiдi виявлялася у фракцiях низькомолекулярних бiлкiв цитозолю з м.м. менше 10 кДа i мiкросом (рис. 2,а). Збiльшення дози сiрчанокислої мiдi у 2 рази приводило до змiни характеру її розподiлу в клiтинах печiнки (рис. 2,б). Її вмiст зменшувався у низькомолекулярних бiлках i мiкросомах та збiльшувався у високомолекулярних бiлках цитозолю.
Рис. 2. Вмiст iонiв мiдi у фракцiях мiкросом печiнки (1), високомолекулярних (2) i низькомолекулярних бiлкiв цитозолю (3), клiтинних ядрах (4) i хроматинi (5) через 12 г пiсля одноразового введення 5 мкмоль/100 г маси тварини CuSO4.5H2O (а), одноразового введення 10 мкмоль/100 г (б), 4-х введень 5 мкмоль/100 г з iнтервалом 48 г (в), 3-х введень 5 мкмоль/100 г з наступним введенням 10 мкмоль/100 г (г)
Пiсля чотирьох послiдовних введень сiрчанокислої мiдi у дозi 5 мкмоль/100 г з iнтервалом 48 годин вмiст iонiв мiдi збiльшився в значнiй мiрi у фракцiях низькомолекулярних бiлкiв цитозолю, декiлька в меншiй мiрi в ядрах i хроматинi та залишився незмiнним у мiкросомах (рис. 2,в). Введення великої дози сiрчанокислої мiдi (10 мкмоль/100 г) пiсля трьох послiдовних введень малих доз супроводжувалося лише збiльшенням вмiсту iонiв мiдi у фракцiях низькомолекулярних бiлкiв цитозолю (рис. 2.1,г).
Результати внутрiшньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi у 2 i 20-ти мiс. щурiв пiсля багаторазових введень сiрчанокислої мiдi у дозi 5 мкмоль/100 г показали, що молодi та старi щури практично не розрiзнялися за кiлькiстю iонiв мiдi, що зв'язанi з ядрами та фракцiєю мiкросом (рис. 3). У старих щурiв найвищу концентрацiю мiдi було виявлено у мiтохондрiях. У молодих щурiв найбiльший прирiст накопиченої мiдi спостерiгався у мiкросомах. У цитозолi пiсля трьох введень сульфата мiдi концентрацiя мiдi у молодих тварин практично не змiнилася, а у старих - знизилася. Фракцiя високомолекулярних бiлкiв цитозолю старих тварин мiстила у 2 рази менше iонiв мiдi, у той час як фракцiя низькомолекулярних бiлкiв цитозолю - в 2,6 рази бiльше мiдi в порiвняннi з молодими тваринами (рис. 3).
Рис.3.Вмiст iонiв мiдi в ядрах (а), мiкросомах (б), мiтохондрiях (в), високомолекулярних бiлках фракцiї цитозолю (г) i низькомолеку лярних бiлках фракцiї цитозолю (д) клiтин печiнки молодих (1) i старих (2) щурiв пiсля 4-х послiдовних введень сiрчанокислої мiдi в дозi 5 мкмоль/100 г кожнi 48 годин
Експерименти з дослiдження спорiдненостi субклiтинних фракцiй гепатоцитiв до iонiв мiдi у системi in vitro повнiстю пiдтверджують отриманi в системi in vivo залежностi.
Отже, адаптивнiсть до дiї мiдi на клiтинному рiвнi у значнiй мiрi залежить вiд активностi бiлкiв цитозолю, якi, можливо, виконують функцiї депонування та транспорту iонiв мiдi, що проникають у клiтину.
Роль металотiонеїнiв та iнших бiлкiв цитозолю в зв'язуваннi iонiв мiдi. Термостабiльнi бiлки, до складу яких входять металотiонеїни печiнки, роздiлилися на двi фракцiї за хроматографуванням на сефадексi G-75. Якщо на легку фракцiю, що мiстить металотiонеїни, у молодих щурiв припадало 80-90%, то у старих вона складала не бiльше 55-60% вiд усiх термостабiльних бiлкiв. Через 24 години пiсля трьох послiдовних введень сiрчанокислої мiдi у одномiсячних щурiв з металотiонеїнами зв'язувалося у 2 рази бiльше iонiв мiдi, нiж у 24-х мiсячних щурiв у розрахунку на 1 мг бiлка. Внесення сiрчанокислої мiдi до концентрацiї 10-3 М у суспензiю бiлкiв цитозолю молодих щурiв супроводжувалось зв'язуванням Cu2+ у кiлькостi, що в 10 разiв перебiльшувала вiдповiдну фракцiю старих щурiв. Збiльшення концентрацiї сiрчанокислої мiдi до 10-2 М приводило до зменшення рiзницi мiж молодими та старими тваринами до 3,2 рази. Можливо, це пов'язане з тим, що за таких великих концентрацiй iонiв мiдi втрачається специфiчнiсть зв'язування.
Результати, що представленi у цьому роздiлi, переконують, що: 1 - металотiонеїни старих тварин зв'язували у 2 рази менше iонiв мiдi, нiж вiдповiдна фракцiя бiлкiв молодих щурiв; 2 - у цитозолi молодих щурiв пiсля багаторазових введень сiрчанокислої мiдi виявляється бiльший вмiст металотiонеїнiв, нiж у старих щурiв; 3 - поряд з металотiонеїнами у зв'язуваннi iонiв мiдi беруть участь також iншi бiлки цитозолю.
Дiя iонiв мiдi на функцiональну активнiсть генетичного апарату клiтин печiнки щурiв. Як вже було показане, адаптацiя щурiв до сiрчанокислої мiдi супроводжується змiною характеру розподiлу iонiв мiдi мiж компартментами клiтин печiнки, зокрема, збiльшенням їх вмiсту у клiтинних ядрах i хроматинi. Такий характер внутрiшньоклiтинного розподiлу, можливо, i зумовлює виявлений ефект адаптивностi. Для перевiрки цього припущення у наступнiй серiї експериментiв дослiджували вплив iонiв мiдi на рiзнi показники функцiональної активностi генетичного апарату клiтин печiнки щурiв.
Питома радiоактивнiсть ДНК через 60 хвилин пiсля введення 0,004; 0,02; 0,1; 0,5; 2,5; 5,0 мкмоль/100 г залишалася практично незмiнною i не вiдрiзнялася вiд контролю. Питома радiоактивнiсть РНК хроматину, тобто знову утвореної РНК, не змiнювалася при низьких дозах (0,004 і 0,02) i збiльшувалась у 1,3 рази при дозах 0,1-5 мкмоль (рис. 4,а). Низькi дози (0,02 и 0,1 мкмоль) не впливали на питому радiоактивнiсть РНК ядерних РНП-часток, доза 2,5 мкмоль приводила до збiльшення, а 5 мкмоль зменшувала цей показник в 1,8 разiв у порiвняннi з початковим рiвнем (рис. 4,б).
Зниження питомої радiоактивностi РНК яРНП-часток може бути наслiдком транспорту знову синтезованих РНК у цитоплазму. На наступному етапi визначали питому радiоактивнiсть РНК полiсом пiсля 60 хвилин експозицiї з 0,5 і 5,0 мкмоль сiрчанокислої мiдi. Введення сiрчанокислої мiдi тваринам у дозi 0,5 мкмоль збiльшувало питому радiоактивнiсть РНК полiсом у 1,3 рази в порiвняннi з контролем, а при бiльшiй дозi спостерiгалося зменшення цього показника, хоча вiн i перевищував контрольний рiвень (рис. 4,в). Цi результати свiдчать про збiльшення швидкостi транспорту знову синтезованої РНК у цитоплазму та про включення її у склад полiсом. Питома радiоактивнiсть РНК у постполiсомнiй фракцiї, яка мiстить тРНК та мРНК iнформосом, залишається на постiйному рiвнi при рiзних дозах i не вiдрiзняється вiд контрольного рiвню.
Рис. 4. Вплив рiзних доз iонiв мiдi на питому радiоактивнiсть РНК хроматину (а), ядерних РНП-часток (б), полiсом (в) i цитозолю (г)
Визначення активностi РНК-полiмерази II (яка синтезує мРНК) у системi видiлених ядер у присутностi 8,5 мМ сiрчанокислої мiдi показало збiльшення активностi ферменту в 3,9 рази порiвняно з контролем. Якщо у середовищi культивування ядер концентрацiю iонiв мiдi збiльшували у 10 разiв, то це супроводжувалось iнгiбуванням активностi ферменту на 75%. Подальше збiльшення концентрацiї до 850 мМ призводило до 80%-го iнгiбування (рис. 5).
Рис. 5. Вплив рiзних концентрацiй CuSO4.5H2O на активнiсть РНК-полiмерази II (а) i I+III (б), що видiленi з печiнки iнтактних щурiв
Видiленi через 12 годин пiсля часткової гепатектомiї клiтиннi ядра печiнки щурiв використовували як модель з високим рiвнем функцiональної активностi геному в порiвняннi з ядрами iнтактної печiнки. Внесення сiрчанокислої мiдi (8,5 мМ) у систему ядер з печiнки, що регенерує, супроводжувалося збiльшенням активностi РНК-пол II на 80% у порiвняннi з контролем. У ядрах з печiнки, що регенерує, на вiдмiну вiд iнтактної, активнiсть РНК-пол II збiгалася з такою контролю, а при 850 мМ сiрчанокислої мiдi активнiсть ферменту зменшилася на 84%. Невелику рiзницю мiж ядрами з iнтактної печiнки та печiнки, що регенерує, було виявлено i за активнiстю РНК-пол I+III. Зокрема, низька концентрацiя сiрчанокислої мiдi збiльшувала активнiсть цих ферментiв у печiнцi, що регенерує, на 54% і не впливала на цей показник у ядрах iнтактної печiнки, а концентрацiя 85 и 850 мМ iнгiбувала їх на 80 i 90% вiдповiдно (рис. 6).
Рис. 6. Вплив рiзних концентрацiй CuSO4.5H2O на активнiсть РНК-полiмерази II (а) i I+III (б), що видiленi з регенеруючої печiнки щурiв
Зважаючи на отримані результати, можна заключити, що, по-перше, iони мiдi при одноразовому введеннi впливають на функцiональну активнiсть геному в клiтинах печiнки; по-друге, найбiльший ефект проявляється на посттранскрипцiйному рiвнi - змiна швидкостi процесiнгу i транспорту знову синтезованих РНК у полiсоми; по-третє - вiдповiдна реакцiя генетичної системи на iони мiдi залежить вiд рiвню її функцiональної активностi i дози сiрчанокислої мiдi; і зрештою - виявлений трифазний характер реакцiї відгуку зберiгається для ядер з iнтактної печiнки i печiнки, що регенерує, та може бути зумовлений характером внутрiшньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi.
Дiя iонiв мiдi на деякi показники функцiональної активностi мембран ендоплазматичного ретикулюму печiнки щурiв. Визначення здатностi видiлених із печiнки адаптованих тварин мiкросом зв'язувати iони мiдi виявило, що в молодих тварин ця здатнiсть зменшується в порiвняннi з контролем i, навпаки, збiльшується у старих тварин. Такий характер внутрiшньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi у адаптованих до дiї сiрчанокислої мiдi щурiв може прояснити визначений ефект адаптивностi. Для перевiрки цього припущення було проведено дослiдження активностi маркерного ферменту мiкросом - глюкозо-6-фосфатази в iнтактних та адаптованих щурiв. Визначено, що при концентрацiї 0,005 мМ активнiсть глюкозо-6-фосфатази була на 40% вища за контрольний рiвень, а збiльшення концентрацiї мiдi супроводжувалося лiнiйним зниженням активностi цього ферменту до повного її втрачення (рис. 7).
Рис. 7. Вплив рiзних концентрацiй CuSO4.5H2O на активнiсть глюкозо-6-фосфатази в системi видiлених мiкросом
Внесення сiрчанокислої мiдi у суспензiю мiкросом з печiнки iнтактних щурiв супроводжувалось зниженням активностi глюкозо-6-фосфатази на 50%, у той час як, у мiкросомах з печiнки адаптованих щурiв цей показник знижувався тiльки на 25%. Падiння активностi ферменту супроводжувалося рiзким збiльшенням кiлькостi продуктiв перекисного окислення лiпiдiв, зокрема малонового дiальдегiду у дiапазонi концентрацiй 0,005-5 мМ. Рiзке падiння активностi глюкозо-6-фосфатази супроводжувалося структурними перебудовами мембран, що привели до формування великих агрегатiв мембранних везикул, про що свiдчать результати розподiлу мiкросом у градiєнтi щiльностi сахарози. Можна стверджувати, що у процесi адаптацiї вiдбуваються структурно-функцiональнi перебудови мембран ендоплазматичного ретикулюму, якi формують резистентнiсть до дiї iонiв мiдi.
Адаптацiя тварин до сiрчанокислої мiдi може супроводжуватися iндукцiєю бiлкiв цитозолю печiнки, якi специфiчно зв'язують iони мiдi i тим самим лiквiдують їхню дiю на iншi клiтиннi структури. Якщо в iнкубацiйну систему видiлених мiкросом разом з iонами мiдi внести бiлки, що видiленi з фракцiї цитозолю, то це приводить до суттєвих якiсних та кiлькiсних змiн активностi глюкозо-6-фосфатази в порiвняннi з системою мiкросом (рис. 8). Активнiсть глюкозо-6-фосфатази знижувалася на 75% пiсля внесення у систему мiкросом сiрчанокислої мiдi (5 мМ) як у фiзiологiчному розчинi, так i разом з бiлками цитозолю печiнки iнтактних щурiв. Самi бiлки цитозолю не впливали на активнiсть глюкозо-6-фосфатази. Отже, бiлки цитозолю iнтактної печiнки не модифiкують дiю iонiв мiдi, що виявляється у структурно-функцiональних змiнах мiкросом. У тому випадку, коли сiрчанокислу мiдь вносили у суспензiю мiкросом разом з бiлками цитозолю, що видiленi з печiнки адаптованих щурiв, тоді активнiсть глюкозо-6-фосфатази знижувалася лише на 55% (рис. 8). Можна заключити, що бiлки цитозолю печiнки адаптованних щурiв сприяють зниженню токсичностi сiрчанокислої мiдi. Неповне зняття дiї Cu2+, вiрогiдно, пов'язане з тим, що не всi iони мiдi зв'язалися з бiлками цитозолю.
Рис. 8. Вплив бiлкiв цитозолю, видiлених з печiнки iнтактних (I) i адаптованих (II) щурiв на активнiсть глюкозо-6-фосфатази
ВИСНОВКИ
1. Молодi щури (2-3 мiс. вiку) мають бiльшу стiйкiсть i здатнiсть адаптуватися до великих концентрацiй сiрчанокислої мiдi (12,5 мкмоль/100 г маси тварини) порiвняно iз старими тваринами (20-24 мiс. вiку). Здатнiсть тварин адаптуватися до сiрчанокислої мiдi залежить вiд схеми попереднiх введень цього токсиканту до органiзму.
2. Iони мiдi по рiзному розподiлялися в клiтинi (на прикладi клiтин печiнки) молодих и старих тварин. Попереднi введення до органiзму низьких доз (5 мкмоль/100 г маси тiла) сiрчанокислої мiдi приводили до збiльшення кiлькостi металотiонеїнiв у цитозолi, що впливало на характер внутрішньоклiтинного розподiлу iонiв мiдi.
3. Iндукцiя металотiонеїнiв в клiтинах печiнки була вираженою в бiльшiй мiрi в молодих тварин порiвняно зі старими. Металотiонеїни молодих тварин здатнi зв'язувати бiльше iонiв мiдi порiвняно з металотiонеїнами старих тварин.
4. Iони мiдi проникають в клiтиннi ядра i посилюють швидкiсть транскрипцiї при низьких дозах (5 мкмоль/100 г) та пригнiчують активнiсть РНК-полiмераз в клiтинних ядрах при бiльших дозах сiрчанокислої мiдi.
5. Низькi концентрацiї iонiв мiдi збiльшують активнiсть глюкозо-6-фосфатази (маркерного ферменту мембран ендоплазматичної сiтки), а високi - пригнiчують її активнiсть. Це супроводжується iндукцiєю перекисного окислення лiпiдiв та змiною структурного стану дослiджуваних мембран. Мiкросоми молодих щурiв зв'язують меншу кiлькiсть iонiв мiдi порiвняно iз старими тваринами.
6. У захисному ефектi вiд дiї iонiв мiдi для мiкросом велику роль вiдiграють металотiонеїни. Так, металотiонеїни, що були видiленi з цитозолю клiтин печiнки тварин, адаптованих до дiї iонiв мiдi, зменшували зниження активностi глюкозо-6-фосфатази мiкросом в 2 рази порiвняно з бiлками цитозолю печiнки не адаптованих до дiї iонiв мiдi щурiв.
7. Дiя iонiв мiдi на бiологiчнi системи залежить вiд функцiонального стану цих систем, що було показано на прикладi iнтактної i регенеруючої печiнки та печiнки молодих i старих тварин.
СПИСОК ПРАЦЬ. ЩО ВIДОБРАЖАЮТЬ
ОСНОВНI ПОЛОЖЕННЯ ДИСЕРТАЦIЇ
Шеббани М. Устойчивость крыс разного возраста к сернокислой меди// Биологический вестник.- 1997.- Т.1.- N1.- С.62-66.
Линник М.А., Шеббани М. Возрастные особенности распределения сульфата меди в клетках печени крыс в системах in vivo и in vitro//Биологический вестник.- 1997.- Т.1.- N2.- С.74-80.
Божков А.И., Длубовская В.Л., Линник М.А., Шеббани М. Онтогенез и адаптация к факторам среды//Цитология.- 1997.- Т.39.- N6.- С.458-459.
Божков А.И., Длубовская В.Л., Линник М.А., Шеббани М., Белоус А.М. Возрастные особенности адаптации животных к сернокислой меди//Доповiдi НАН України.- 1998.- N5.- С.153-157.
АНОТАЦIЯ
Шеббанi М.М. Механiзми адаптацiї тварин рiзного вiку до сiрчанокислої мiдi.- Рукопис.
Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.04 - бiохiмiя.- Харкiвський державний унiверситет Мiнiстерства освiти України, Харкiв, 1999.
Дисертацiю присвячено з'ясуванню ролi металотiонеїнiв в механiзмах адаптацiї тварин рiзного вiку до тривалої дiї великих доз сiрчанокислої мiдi. Показано роль металотiонеїнiв в депонуваннi i внутрішньоклiтинному розподiлi iонiв мiдi в гепатоцитах, що дозволяє пояснити роль цих бiлкiв в механiзмах адаптацiї. Вiковi особливостi адаптацiї тварин до тривалої дiї сiрчанокислої мiдi визначаються характером внутрішньоклiтинного розподiлу токсиканту, важливу роль в якому вiдiграють металотiонеїни. Здатнiсть тварин до адаптацiї залежить вiд схеми попереднiх введень низьких доз сiрчанокислої мiдi i метаболiчного стану органiзму. Розроблено схему iндукцiї адаптацiї тварин до дiї сiрчанокислої мiдi, яку може бути використано при вивченнi вiкових механiзмiв адаптацiї, їхніх змiн в онтогенезi, а також для оцiнювання антитоксичних препаратiв.
Ключовi слова: металотiонеїни, гепатоцит, вiк, адаптацiя, сiрчанокисла мiдь.
АННОТАЦИЯ
Шеббани М.М. Механизмы адаптации животных разного возраста к сернокислой меди.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия.- Харьковский государственный университет Министерства образования Украины, Харьков, 1999.
Диссертация посвящена выяснению роли металлотионеинов в механизмах адаптации животных разного возраста к длительному действию высоких доз сернокислой меди. Показана роль металлотионеинов в депонировании и внутриклеточном распределении ионов меди в гепатоцитах, что позволяет объяснить роль этих белков в механизмах адаптации. Возрастные особенности адаптации животных к длительному действию сернокислой меди определяются характером внутриклеточного распределения токсиканта, важную роль в котором играют металлотионеины. Способность животных к адаптации зависит от схемы предварительного введения низких доз сернокислой меди и метаболического состояния организма. Разработана схема индукции адаптации животных к действию сернокислой меди, которая может быть использована при изучении возрастных механизмов адаптации, их изменения в онтогенезе, а также при оценках антитоксических препаратов.
Ключевые слова: металлотионеины, гепатоцит, возраст, адаптация, сернокислая медь.
SUMMARY
Shebbani M.M. Mechanisms of adaptation to copper sulfate in animals of different ages. - Manuscript.
Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.04 - biochemistry.- Kharkiv State University, Kharkiv, 1999.
The dissertation is devoted to elucidation of metallothioneines role in the mechanisms of adaptation to copper sulfate in animals of different ages.
The dose of copper sulfate of 5 M/100 g of animal weight did not cause the death of experimental animals. One intraperitoneal injection of 12,5 M of copper sulfate for 100 g of animal weight led to the death of animals in 1-2 hours after the injection. It was shown that the young rats (2-3 months old) possessed greater resistance to high copper sulfate doses (12,5 M/100 g of animal weight) than the old animals (20-24 months old) did.
After repeated consecutive injections of low copper sulfate doses and then the lethal dose injection the death occurred 9,5 times later in the young animals and 4 times later in the old animals comparing to the rats that had not obtained the preliminary injections of low doses.
Repeated consecutive injections of the low copper sulfate doses (5 M/100 g of animal weight) formed the distinctive pattern of copper ions intracellular distribution which remained unchanged after the high copper sulfate dose injection (12,5 M/100 g of animal weight), that was likely to provide the resistance of the animals to the toxicant. The adaptability of animals depended on the scheme of preliminary injections of low copper sulfate doses.
Age peculiarities of animals adaptation to prolonged impact of copper sulfate depended on the pattern of intracellular distribution of the toxicant as well. The results of intracellular distribution of copper ions in the hepatocytes of 2 and 20 months old rats in vivo and in vitro showed that the young and the old animals did not differ in the quantity of copper ions bound to the nuclei and the microsomes fractions. In the old rats the greatest copper concentration was discovered in the mitochondria. In the young rats the greatest increase of copper accumulated was found in the microsomes. In the cytosol after 3 injections of copper sulfate the concentration of copper did not change in the young animals and decreased in the old animals. The high molecular weight cytosol fraction of the old animals contained 2 times less copper ions and the low molecular weight fraction contained 2,6 times more copper ions comparing to the young animals.
It was shown the role of cytosol proteins in maintaining and intracellular distribution of metal ions in hepatocytes that made it possible to explain the role of metallothioneines in adaptation mechanisms. The thermostable cytosol proteins fraction which contained the metallothioneines was separated into 2 fractions by chromatography on the sephadex G-75. The light fraction to which the metallothioneines belonged formed 80-90% in the young rats but in the old rats it formed not more than 55-60% from all the thermostable proteins. In the hepatocyte cytosol of the young animals the metallothioneines content increased to the greater extent than in the old animals after 3 consecutive injections of 5 M/100 g of animal weight. These proteins bound 2 times more copper ions for 1 mg of the metallothioneine in comparison to the old animals.
Copper ions penetrated into hepatocytes nuclei. The low copper sulfate doses (lower than 5M/100 g of animal) encreased transcription rate and higher doses inhibited RNA-polymerases activity. The greatest effect of copper ions expressed itself on the posttranscriptional level in the rate changing of newly synthesised RNA processing and transport to polysomes.
The low copper sulfate doses enhanced the activity of glucoso-6-phosphatase - the marker enzyme of endoplasmic membranes, and the high doses inhibited its activity. That was accompanied by lipid peroxidation induction and structural state changing in the membranes investigated.
The metallothioneines extracted from liver cells cytosol of the animals adapted to copper ions influence possessed the protective effect on microsomes in vitro. Thus, the microsomal glucoso-6-phosphatase activity decrease was 2 times less pronounced at the presence of these proteins comparing to the control variant.
The effect of copper ions depended on functional status of biological systems that was shown in the intact and regenerating liver and the liver of young and old animals.
It was discovered the threephase dose-depended character of the reaction to copper ions of hepatocytes genetic system and microsomal enzymes activity which consists of the latent stimulation and inhibition phases.
The induction scheme of adaptation to copper sulfate in animals was elaborated. It may be used in adaptation mechanisms and their ontogenetic changing investigation and in antitoxic drugs estimation as well.
Key words: metallothioneine, hepatocyte, age, adaptation, copper sulfate.
| 
