Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ПОВСТЯН ОЛЕКСАНДР ВІКТОРОВИЧ

УДК 577.352:612.73

МЕМБРАННІ МЕХАНІЗМИ ДІЇ АПАМІНУ НА ІОННІ СТРУМИ ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВОЇ КЛІТИНИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник:     академік НАН України, доктор медичних наук

Шуба Михайло Федорович

зав. відділом нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:      доктор біологічних наук

Веселовський Микола Сергійович

заст. директора Міжнародного центру молекулярної фізіології при НАН України

кандидат біологічних наук

Лук’янець Олена Олександрівна

старший науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа:      відділ біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “6” червня 2000 р. о “1400” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “6” травня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук                                                Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Токсини з отрут різноманітних тварин знайшли широке застосування в біохімічних та фізіолого-біофізичних дослідженнях. На даний час апамін (поліпептид з отрути медоносної бджоли) є одним із найуживаніших токсинів, який, поруч з харібдотоксином (поліпептидом з отрути скорпіона), використовується для високоспецифічного блокування кальційзалежних калієвих каналів (КСа). Також виявлена висока ефективність цих токсинів і щодо їх дії на нервово-м’язову передачу. Зацікавленість до вивчення дії апаміну на іонні провідності клітинних мембран виникла після того, як у 1978 р. в лабораторії Шуби М.Ф. вперше було показано, що цей токсин дуже ефективно і специфічно блокує один з типів синаптичної передачі в периферичних синапсах (Владимирова, Шуба 1978, Байдан та ін. 1978, Shuba, Vladimirova 1980, 1981). На основі цих досліджень було зроблено припущення, що апамін є специфічним блокатором неадренергічного гальмування, а медіатором цього гальмування є аденозин-5’-трифосфат (АТФ).

Згодом у лабораторії Барнстока не тільки підтвердили дані про блокування апаміном гальмування в гладеньком’язових клітинах (ГМК), але й поширили уявлення про механізм дії цього токсину (Banks et al 1979). В цій роботі були наведені дані про те, що апамін діє не на пізнавальну частину хеморецептора, а на калієві канали, що активуються за рахунок підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію. Подальші дослідження, проведені в інших лабораторіях, підтримали цю концепцію (напр., Blatz, Magleby 1986, Capiod, Ogden 1989), і нині широке розповсюдження отримала точка зору, згідно якої дія апаміну пов'язана виключно з блокуванням КСа малої провідності плазматичної мембрани. Однак, необхідно відзначити, що прямі і переконливі докази на користь даної концепції щодо мембрани ГМК досі відсутні. Лише останнім часом з’явилося декілька робіт на вісцеральних ГМК (Gagov et al 1993, Повстян та ін. 1997, Vogalis, Goyal 1997, Koh et al 1997), в яких за допомогою методу “patch-clamp” показано наявність апамінчутливого компонента Са2+-залежного К+ струму (IK(Ca)). Тим часом, детальне вивчення мембранних механізмів дії апаміну на ГМК і, зокрема, на властивості апамінчутливого компонента IK(Ca), потребує подальших досліджень. Аналогічні дослідження допомогли б більш глибоко з’ясувати механізми збудливості, її регуляцію, а також механізми синаптичних процесів, в яких беруть участь апамінчутливі канали.

Хоча taenia coli морської свинки вже давно і широко використовується як об'єкт біофізичного дослідження поодиноких ГМК кишкового тракту (Рекалов та ін. 1984, Ганіткевич та ін. 1985, Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989, Hu et al 1989), питання про типи КСа мембрани цих клітин, до цього часу остаточно не вирішене. Тому, без сумніву, становить науковий інтерес розділення загального трансмембранного іонного струму на компоненти, а також порівняльна характеристика харібдотоксин- та апамінчутливого компонентів IK(Ca) і їх регуляція іонами Са2+.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за темами “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком’язових клітин” та “З’ясування молекулярних механізмів специфічних змін провідності клітинних мембран при виникненні основних нервових процесів”.

Мета і завдання дослідження. Враховуючи вищевикладене, метою даної роботи було дослідження мембранних механізмів дії апаміну на ГМК. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Розробити методику виділення функціонально повноцінних ізольованих ГМК taenia coli морської свинки і застосувати до них метод фіксації потенціалу “patch-clamp".
2. Дослідити амплітудно-кінетичні характеристики інтегрального трансмембранного іонного струму мембрани ГМК taenia coli морської свинки, провести його розділення на компоненти і дослідити біофізичні та фармакологічні властивості виявлених компонентів струму, а також вплив на них апаміну.
3. Вивчити дію апаміну та харібдотоксину на трансмембранний іонний струм, ідентифікувати апамін- та харібдотоксинчутливі компоненти IК(Са), провести порівняльну амплітудно-фармакологічну характеристику їх властивостей.
4. З'ясувати роль поза- і внутрішньоклітинних іонів Са2+ в регуляції виявлених компонентів IК(Са).
5. Протестувати на чутливість до апаміну ГМК артерій.

Наукова новизна одержаних результатів. Методом фіксації потенціалу “patch-clamp” в режимі внутрішньоклітинного діалізу ГМК taenia coli морської свинки досліджено мембранні механізми дії апаміну. Вперше виявлена здатність апаміну активувати катіонну провідність мембрани. Вперше для даних ГМК методом “patch-clamp” виділено апамінчутливий компонент IК(Са), досліджено його фармако-біофізичні характеристики та механізми регуляції іонами Са2+. Проведено порівняльну характеристику апамін- та харібдотоксинчутливого компонентів IК(Са).

Отримані результати значно доповнюють сучасні уявлення щодо механізмів дії апаміну на вісцеральні ГМК. Показано, що дія апаміну включає в себе два механізми: блокування КСа малої провідності, з одного боку, та активування катіонної провідності мембрани, з іншого боку. Причому, в межах потенціалу спокою ГМК, обидва ці ефекти спрямовані у напрямку збільшення вхідного струму, тобто сприяють розвитку деполяризації клітини та перешкоджають розвитку реполяризації і слідової гіперполяризації потенціалу дії.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати перш за все мають фундаментальний інтерес, оскільки одержано принципово нові дані щодо механізмів дії апаміну на вісцеральні ГМК, а саме, виявлена здатність апаміну активувати катіонну провідність мембрани. Ідентифікація іонних провідностей, що беруть участь у переносі загального трансмембранного струму, їх кількісний аналіз та деякі, досліджені в даній дисертаційній роботі, аспекти регуляції калієвих каналів дозволяють істотно доповнити сучасні уявлення про функціонування ГМК, зробити ще один крок вперед для розшифрування механізмів електричної збудливості та її регуляції, а також механізмів, що лежать в основі спряження процесів збудження поверхневої мембрани і скорочення ГМК.

Подальші дослідження чутливості кожного з ідентифікованих компонентів трансмембранного іонного струму до фармакологічних речовин можуть привести до виявлення лікарських препаратів, що вибірково впливають на певні функції гладеньких м’язів. Тобто, результати досліджень представляють інтерес для біофізиків, фізіологів та фармакологів і можуть бути використані для дослідження механізмів дії та розробки нових фармакологічних препаратів, що використовуються для лікування захворювань шлунково-кишкового тракту (ШКТ).

Особистий внесок. Автором особисто було виконано всі електрофізіологічні дослідження інтегрального трансмембранного іонного струму та його компонентів, а також розроблено методику ферментативно-механічної ізоляції повноцінних поодиноких міоцитів taenia coli морської свинки, проведено обробку експериментального матеріалу, аналіз і узагальнення результатів досліджень. Вперше здобувачем показано здатність апаміну до активування катіонної провідності мембрани і запропоновано новий механізм дії апаміну на вісцеральні ГМК, який окрім блокування КСа малої провідності включає в себе активування вищезгаданої катіонної провідності.

Дослідження активності поодиноких Са2+-залежних калієвих каналів проводилось спільно з к.б.н. Зимою О.В.

Тензометричні дослідження проводились спільно з асп. Цвіловським В.В.

У розробці концепцій роботи і обговоренні її результатів, а також в формуванні висновків брали активну участь інші співавтори публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались і обговорювались на наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (1995 - 1998), на 2-му з'їзді Українського Біофізичного товариства (Харків, 1998), на конференції “New Approaches to Pharmacotherapy for Hepatic and Gastrointestinal Ulcerative and Inflammatory Disorders" шлунково-кишкового сектору Міжнародного Фармакологічного товариства (Сперлонга, Італія, 1996), на спільному засіданні Фізіологічних товариств Угорщини та Румунії (Сегед - Тімішоара, 1996), на 40-му, 41-му, 43-му щорічних з'їздах Біофізичного товариства США (Балтімор, 1996; Новий Орлеан, 1997, Балтімор, 1999), на Міжнародному семінарі “Intracellular Signalling" (Київ, 1997), на засіданні Сектора нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (червень 1999).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в шести наукових статтях і шести тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 273 найменувань. Робота викладена на 138 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 27 рисунками та 3 таблицями.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Основну частину досліджень було проведено на свіжоізольованих поодиноких ГМК поздовжнього м’язового шару сліпої кишки (taenia coli) морської свинки. Для виділення клітин шматочки taenia coli поміщали до 2 мл номінально безкальцієвого розчину, що містив 3 мг колагенази (тип IА), 2 мг бичачого сироваткового альбуміну та 2 мг соєвого інгібітора трипсину на 25 - 35 хв. при 34 оС. Оброблені таким чином шматочки taenia coli відмивалися від ферменту і багаторазово пропускалися через пастерівську піпетку в номінально безкальцієвому розчині. Частина експериментів була проведена на судинних ГМК (мезентеріальні артерії морської свинки та щура). Процедура виділення цих ГМК суттєво не відрізнялась від згаданої для taenia coli.

В основній частині експериментів для дослідження іонних струмів ізольованих ГМК застосовувалась класична “whole-cell” конфігурація методу “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Мікропіпетки виготовляли з м’якого молібденового скла, після заповнення розчином вони мали опір 2 - 4 МОм. Вихідний зовнішній розчин містив (мМ): NaCl 120.4; КCl 5.9; CaCl2 2.5; MgCl2 1.2; d-глюкоза 11,5; HEPES 5; pH 7.4 (NaOH). Піпетковий розчин мав такий склад (мМ): КCl 135; MgSO4 1; Na2ATФ 2; ЕГТА 0.3; HEPES 10; pH 7.3 (КOH). Внутрішньоклітинна концентрація вільного Са2+ ([Ca2+]i) при використанні останнього розчину була близькою до фізіологічної і становила приблизно 100 нМ. Дане значення оцінювалося таким чином: концентрація вільного Са2+ в номінально безкальцієвому розчині визначалася за допомогою флуоресцентного спектрофотометра “HITACHI” F-4000 з використанням барвника fura-2; для розрахунку істинного значення [Ca2+]i в розчині застосовували програму “EQCAL”. При дослідженні Са2+ струму (ICa) іони К+ в розчинах еквімолярно замінювались на Cs+, також до зовнішнього розчину додавали 5 мМ тетраетиламонію (ТЕА). При дослідженні катіонного струму замість К+ та Са2+ використовувались відповідно Cs+ та Со2+. В частині дослідів було проведено реєстрацію активності поодиноких калієвих каналів в конфігураціях “cell-attached”, “inside-out” та “outside-out”.

Реєстрація іонних струмів проводилась за допомогою підсилювача “РОК-3М”. Сигнал з виходу перетворювача струм - напруга надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач і далі в комп’ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програм “Screen”, “DataSel”, “pCLAMP 5.5” та “Origin 5.0”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ

Загальна характеристика трансмембранного іонного струму ГМК taenia coli морської свинки. В переважній більшості досліджених клітин в нормальних розчинах у відповідь на ступінчасті деполяризуючі зміщення мембранного потенціалу від -60 мВ до рівнів більш позитивних, ніж -40 мВ на початку імпульсу виникав короткочасний вхідний ICa, який через декілька десятків мілісекунд переходив у вихідний струм великої амплітуди, основними носіями якого є іони К+. За кінетичними властивостями у складі вихідного струму можна виділити, принаймні, два компоненти - початковий, зі швидкою інактивацією та наступний стаціонарний. Оскільки вхід іонів Са2+ в клітину є ключовим моментом для підвищення [Ca2+]i і активування кальційзалежних іонних провідностей (однієї з яких є і апамінчутлива К+ провідність), в першій частині роботи нами було вивчено вхідний струм і можливість його модуляції апаміном. Отримані результати підтвердили проведені раніше дослідження (Ганіткевич та ін. 1985, Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989, Зима та ін. 1994), згідно яким в мембрані ГМК taenia coli морської свинки ICa переноситься лише через високопорогові потенціалзалежні Са2+ канали L-типу. Виявилося, що апамін не мав помітного впливу на цей ICa (рис. 1). Виходячи з цього, в наступних експериментах дію апаміну на вихідний К+ струм вивчали в нормальному зовнішньому фізіологічному розчині. Оскільки допускається, що “мішенню" для дії апаміну є КСа, основну увагу в цих дослідах було приділено вивченню фармако-біофізичних характеристик IK(Ca).

Дія селективних блокаторів КСа на вихідний калієвий струм. У наступних експериментах  була  зроблена  спроба  розділити  IK(Ca) на  компоненти.  З  цією

метою використовувались харібдотоксин і апамін - селективні блокатори КСа великої і малої провідності відповідно. Аплікація харібдотоксину (100 нМ) спричиняла значне зменшення вихідного струму, особливо його складової, що інактивується та істотне пригнічення осциляцій (рис. 2, А). Апамін (500 нМ) на фоні дії харібдотоксину викликав додаткове, але незначне зменшення вихідного струму. На рис. 2, Б представлена дія апаміну (500 нМ) на вихідний струм і наступна аплікація харібдотоксину (100 нМ) в присутності апаміну. Видно, що апамін заблокував вельми незначну частину вихідного струму, осциляції та кінетика струму не змінювалися, ефект же харібдотоксину в присутності апаміну знову таки був досить великим, повністю блокувалася початкова складова, що інактивується. Ці дані дозволяють говорити про те, що харібдотоксин і апамін діють на різні типи каналів не залежно один від одного, і внесок харібдотоксинчутливих каналів (тобто КСа великої провідності) в сумарний вихідний струм суттєво більший, ніж внесок апамінчутливих каналів (тобто КСа малої провідності).

Крім того, нами було виявлено, що на відміну від харібдотоксину, апамін, окрім блокування вихідного К+ струму, в більшості досліджених клітин спричиняв також зміщення холдінгового струму (трансмембранного іонного струму що протікає при потенціалі, що підтримується) у вхідному напрямку (рис. 2). Величина такого зміщення холдінгового струму варіювала у різних клітин від десяти до ста пікоампер. Подібний феномен в дії апаміну досі в науковій літературі не згадувався, тому ми провели серію експериментів, спрямованих на його вивчення. Результати цих досліджень наведені нижче.

На рис. 3 представлені усереднені (за даними, отриманими на 9-ти клітинах) вольт-амперні характеристики (ВАХ) дії 100 нМ харібдотоксину на трансмембранний іонний струм. Видно, що харібдотоксинчутливий струм виявляв потенціалзалежні властивості: зі збільшенням рівня деполяризації спостерігалося збільшення його амплітуди, незважаючи на зменшення входу Са2+ в ГМК при потенціалах +20…+40 мВ. Виразний перегин на його ВАХ свідчить про Са2+-залежність цього струму. Внесок харібдотоксинчутливого компонента в загальний вихідний струм був більшим на максимумі останнього, аніж в кінці деполяризуючої сходинки тривалістю 300 мс. Це, очевидно, пов'язане з чутливістю струму до зниження [Ca2+]i наприкінці деполяризуючого імпульсу. З тієї ж причини перегин на ВАХ, побудованій на 300-й мс деполяризуючого імпульсу, відсутній і чітко помітна тенденція до зменшення внеску цього IК(Ca) в інтегральний трансмембранний іонний струм.

Усереднені (за даними, отриманими на 14-ти клітинах) ВАХ дії 500 нМ апаміну на трансмембранний іонний струм представлені на рис. 4. При побудові цих ВАХ для аналізу бралися лише клітини з мінімальним ефектом апаміну на холдінговий струм. По характеру ВАХ цього IK(Ca) можна зробити висновок, що на відміну від харібдотоксинчутливого, апамінчутливий струм майже не виявляв потенціалзалежність. І на максимумі струму, і наприкінці деполяризуючого імпульсу тривалістю 300 мс, внесок апамінчутливого компонента до загального вихідного струму був приблизно однаковий.

На рис. 3 та 4 ВАХ були побудовані на максимумі вихідного струму, значення якого в різних клітинах при +50 мВ нормалізувалися до 1,0.

Дія ТЕА на IK(Ca). В наступній частині роботи ми досліджували дію ТЕА - відомого неселективного блокатора калієвих каналів - на виявлені компоненти IK(Ca). Цей блокатор в концентрації 4 мМ інгібував вихідний струм більш, ніж на 50%. Апамін на фоні дії такої концентрації ТЕА спричиняв подальше зменшення вихідного струму (рис. 5), причому відсоток блокування становив ті ж 10 - 15%, що і в контролі (рис. 2). У той же час харібдотоксин, при додаванні його до розчину з ТЕА у концентраціях 4 і навіть 0.8 мМ, не викликав додаткового пригнічення струму.

Залежність блокуючої дії харібдотоксину і апаміну від [Са2+]i. При встановленні [Са2+]i на рівні 50 нМ (для цієї мети використовувався Са2+ - ЕГТА буфер), апамін не викликав звичайного зменшення вихідного струму. Певно, дана концентрація Са2+ всередині клітини була недостатньою для активації апамінчутливих КСа (рис. 6). У той же час апамін в присутності Со2+ в зовнішньому розчині (коли вхід Са2+ до клітини через потенціалзалежні Са2+ канали повністю пригнічений) частково блокував вихідний К+ струм (рис. 7, А), у той час як харібдотоксин за цих умов не викликав достовірних змін амплітуди вихідного струму (рис. 7, Б).

На рис. 5 - 7 струми викликали ступінчатою деполяризацією мембрани від -60 до +10 мВ.

При аплікації розчину, що містив іони Со2+ замість Са2+, спостерігалося значне пригнічення вихідного струму, що свідчить на користь наявності в ньому досить великого Ca2+-залежного компонента К+ струму. За цих умов вихідний струм переносився в основному лише через калієві канали “затриманого випрямлення”, які є нечутливими до іонів Са2+.

Внесок різних компонентів іонного струму в сумарний трансмембранний струм. Ми також спробували розділити інтегральний трансмембранний іонний струм ГМК на компоненти шляхом віднімання різних складових з сумарного струму і дати кількісну оцінку внеску кожного з компонентів в інтегральний струм при 0 мВ (рис. 8). На початку експерименту реєструвався сумарний трансмембранний іонний струм (реєстрація 1), потім за допомогою апаміну усувався IK(Ca), що переноситься через канали малої провідності (реєстрація 2), після чого зовнішній розчин замінювали гіперкалієвим розчином, концентрація іонів К+ в якому дорівнювала внутрішньоклітинній. За цих умов EK, ECl, а також Eкат були рівними 0 мВ, тому деполяризаційне зміщення мембранного потенціалу до цього рівня активувало лише вхідний кальцієвий струм (реєстрація 3). Са2+-незалежний К+ струм виділяли аплікацією розчину з Со2+ (реєстрація 4). Відніманням реєстрацій 3 та 4 з реєстрації 2 одержували “чистий” IK(Ca), що переноситься через канали великої провідності і блокується харібдотоксином (5). Кінетика спаду цього струму практично цілком співпадає з кінетикою інактивації ICa. “Чистий” апамінчутливий IK(Ca), що переноситься через канали малої провідності можна отримати відніманням реєстрації 2 з реєстрації 1.

В багатьох клітинах при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу спостерігалося виникнення спонтанних вихідних струмів (СВС). СВС повністю блокувалися харібдотоксином, а також ТЕА. Аплікація кофеїну супроводжувалась появою швидкого фазного вихідного струму, після якого СВС пригнічувались.

Активування апаміном катіонної провідності плазматичної мембрани ГМК. Заключна частина досліджень присвячена вивченню вперше виявленого нами в ГМК taenia coli морської свинки апамін-індукованого зміщення холдінгового струму у вхідному напрямі. Цей ефект можна пояснити як блокуванням струму вихідного напрямку, так і активуванням струму вхідного напрямку. Вищеописане блокування апаміном вихідного IK(Ca) не викликає сумніву. Проте в даному випадку цей механізм не спрацьовує, оскільки зміщення холдінгового струму завжди супроводжувалося збільшенням іонної провідності мембрани (рис. 9), а не зменшенням, чого слід було б очікувати у випадку блокування КСа низької провідності. Також аплікація апаміну завжди супроводжувалась збільшенням шуму, що є ще одним доказом на користь активування, а не блокування додаткової провідності.

Під час проведення експериментів нами було виявлено, що ключовим іоном, що відповідає за такий ефект апаміну, може бути Na+. Його видалення із зовнішнього розчину (в цих і наступних дослідах для еквімолярної заміни іонів Na+ в нормальному фізіологічному розчині використовувався мембранонепроникний N-метіл-D-глюкамін) на фоні дії апаміну супроводжувалось поступовим поверненням холдінгового струму до початкової величини, а в безнатрієвому розчині токсин не виявляв на цей струм ніякого помітного впливу.

Нижче представлені результати експериментів дії апаміну на трансмембранний іонний струм в нормальному та безнатрієвому розчинах. Рис. 10, А, Б ілюструє досить значне (близько 100 пА) і зворотнє зміщення холдінгового струму у вхідному напрямку у відповідь на додавання апаміну до нормального фізіологічного розчину. Видалення іонів Na+ із зовнішнього розчину в присутності апаміну призводило до відновлення вихідної величини холдінгового струму (рис. 10, В). Нами було виявлено, що безнатрієвий розчин спричиняв значне зменшення амплітуди вихідного компонента трансмембранного іонного струму, викликаного деполяризацією. Апамін за цих умов викликав звичайне додаткове зменшення вихідного струму, пов'язане з блокуванням низькопровідних КСа (рис. 10, Г). Холдінговий струм при цьому не змінювався. З цих експериментів можна зробити висновок, що дія апаміну на трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки, окрім блокування КСа низької провідності, проявляється також і в активуванні Na+ або Na+-залежної провідності, яка в області потенціалу спокою ГМК має вхідний напрямок. Для уточнення цього висновку були проведені експерименти із використанням розчинів, що містять Сs+ та Со2+ замість К+ і Са2+ відповідно. За таких умов через мембрану протікав стаціонарний струм, потенціал реверсії якого знаходився в діапазоні потенціалів -5 … 0 мВ (рис. 11). Апамін викликав збільшення цього струму як у вхідному напрямку (до потенціалу реверсії), так і у вихідному (після потенціалу реверсії). Ці дані дозволяють припустити, що каналом, відповідальним за таку дію апаміну, може бути неселективний катіонний канал, аналогічний рецепторкерованому катіонному каналу (Carl et al 1996, Zholos 1999, Farrugia 1999), який переносить всі одновалентні катіони (включаючи Na+, K+, Cs+).

За відсутністю іонів K+ і Ca2+ були повторені описані вище експерименти по вивченню дії апаміну на трансмембранний іонний струм в безнатрієвому розчині. Виявлено, що всі ефекти апаміну, які спостерігалися в нормальному фізіологічному розчині збереглися: видалення Na+ із зовнішнього розчину запобігало активуванню струму апаміном, яке, однак, спостерігалося відразу після повернення іонів Na+ до цього розчину. І, нарешті, було виявлено, що в присутності ТЕА ефект активування катіонного струму апаміном був повністю відсутній (рис. 1). В присутності ТЕА (рис. 5) апамін спричиняв лише блокування IK(Ca). Отже, цей неспецифічний блокатор може бути використаний як фармакологічний інструмент для розділення ефектів блокування апаміном КСа малої провідності та активування катіонної провідності мембрани вісцеральних ГМК.

На відміну від ГМК ШКТ, жодна з іонних провідностей плазматичної мембрани ГМК мезентеріальної артерії щурів та морських свинок не виявила чутливості до дії апаміну (Зима та ін. 1996, Хархун та ін. 2000).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Дана робота присвячена фармако-біофізичному дослідженню компонентів сумарного трансмембранного іонного струму ГМК поздовжнього шару сліпої кишки (taenia coli) морської свинки та вивченню мембранних механізмів дії на кожний з них апаміну - поліпептидного нейротоксину з отрути медоносної бджоли.

Ця робота є логічним продовженням досліджень, виконаних у відділі нервово-м’язової фізіології в кінці 70-х - на початку 80-х років цього сторіччя (Владимирова, Шуба 1978, Байдан та ін. 1978, Shuba, Vladimirova 1980, 1981), в яких вперше було показано здатність апаміну специфічно блокувати неадренергічне нехолінергічне (НАНХ) синаптичне гальмування гладеньких м'язів ШКТ. Відомо (Владимирова, Шуба 1978, Владимирова, Шуба 1984, Шуба та ін. 1998), що гальмуючі синаптичні потенціали (ГСП) в усіх відділах ШКТ складаються з двох компонентів: апамінчутливого швидкого та харібдотоксинчутливого повільного. Більш того, в цих же роботах було показано, що для ГМК кільцевого та поздовжнього шарів сліпої кишки морської свинки при дії апаміну характерна навіть поява НАНХ збуджуючих синаптичних потенціалів. Що ж торкається механізму блокування апаміном ГСП, то допускається, що цей токсин блокує КСа малої провідності, які і беруть участь в генерації ГСП. Однак, до останнього часу були відсутні прямі експериментальні дані про наявність в плазматичній мембрані ГМК ШКТ згаданих КСа і тим більше не було даних і щодо блокування цих каналів апаміном.

У поданій роботі використано новий, у порівнянні зі згаданими роботами, методичний підхід (метод фіксації потенціалу “patch-clamp”), що дозволив розділити сумарний трансмембранний іонний струм на компоненти і вперше детально дослідити дію на кожний з них апаміну.

Результати наших досліджень показали, що при ступінчастій деполяризації основними носіями трансмембранного струму ГМК taenia coli морської свинки є іони Са2+ та К+. Причому, за нормальних умов, іони Са2+ переносять струм вхідного напряму через потенціалкеровані кальцієві канали L-типу, а іони К+ - струм вихідного напряму. В переносі останнього беруть участь принаймні три типи каналів: К+ канали “затриманого випрямлення”, що не залежать від Са2+ і два типи КСа.

На підставі кінетичних характеристик, потенціал- і Ca2+ - чутливості, а також фармакологічних властивостей ідентифіковано два компоненти IK(Ca): харібдотоксинчутливий та апамінчутливий, перший з яких переноситься через КСа великої провідності, а другий - через КСа малої провідності, причому внесок перших в загальний трансмембранний іонний струм істотно більший. Виявлено, що близько 90% вихідного струму переноситься через К+ канали “затриманого випрямлення” і харібдотоксинчутливі КСа великої провідності. Потрібно зазначити, що результати про процентний внесок кожного з вищенаведених компонентів до вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадають з результатами, отриманими за допомогою віднімання окремих компонентів вихідного струму. Що стосується КСа малої провідності, то виявилося, що їхній внесок до вихідного струму вельми незначний (щонайбільше він складав 10 - 15%).

Апамінчутливий IK(Ca) не демонстрував часзалежної інактивації, також він не виявляв потенціалзалежних властивостей. На відміну від апамінчутливого, харібдотоксинчутливий IK(Ca) мав швидку кінетику інактивації - його спад практично співпадав з кінетикою інактивації Ca2+ струму. Також цей струм був потенціалзалежним - із збільшенням рівня деполяризації спостерігалося збільшення його амплітуди.

Крім того, що КСа великої і малої провідності мають високоспецифічні блокатори - харібдотоксин та апамін відповідно, вони також значно відрізняються за чутливістю до ТЕА - неселективного блокатора К+ каналів. Якщо перші з означених каналів повністю блокуються ТЕА у відносно малих концентраціях (в наших експериментах вона становила всього 0,8 мМ), то апамінчутливі канали виявилися нечутливими до аплікації цього блокатора навіть в концентрації 4 - 5 мМ. Більш того, було показано (Blatz, Magleby 1986), що ТЕА не виявляє впливу на апамінчутливі КСа навіть в ще більших концентраціях (20 - 25 мМ).

Важливою характеристикою IK(Ca) є їхня чутливість до [Са2+]i. Встановлено (Becker et al 1989, Ganitkevich, Isenberg 1991), що за фізіологічних умов [Са2+]i в ГМК варіює у межах 100 - 120 нМ, а при деполяризаційних зміщеннях мембранного потенціалу до 0 мВ різко зростає, сягаючи максимуму порядку 1000 нМ, після чого спадає до стаціонарного рівня 200 - 300 нМ, на якому тримається протягом декількох секунд аж до закінчення ступінчастої деполяризації. В наших експериментах було виявлено, що апамінчутливий IK(Са) в досліджуваних клітинах  був дуже чутливим до змін [Ca2+]і. Зниження [Ca2+]і від 100 до 50 нМ призводило до майже повного пригнічення цього струму. Недавно аналогічні дані були отримані в експериментах на тонкому кишечникові миші (Vogalis, Goyal 1997). В цій же роботі була визначена порогова [Са2+]i, необхідна для активації КСа малої провідності. Вона становила 85 нМ. Було показано, що з підвищенням [Са2+]i ймовірність знаходження цього каналу у відкритому стані зростає із ЕС50 = 1.5 мкМ. КСа великої провідності активуються при дещо більших [Са2+]i (Barret et al 1982, Blatz, Magleby 1986). Проведені нами досліди із використанням Со2+ можуть служити додатковим тому підтвердженням.

Отримані нами дані свідчать про те, що в ГМК taenia coli морської свинки окрім викликаних вихідних струмів також можуть виникати і СВС.

Великий інтерес являє питання про джерело Са2+, необхідного для активації кожного із згаданих компонентів IK(Ca). До цього часу остаточна відповідь на це запитання не дана. В наших, а також раніше проведених (Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989, Cole, Sanders 1989) дослідженнях було показано, що амплітуда вихідного К+ струму значно залежить від амплітуди вхідного ICa. Нами виявлено, що для активації КСа великої провідності в ГМК taenia coli морської свинки обов'язково необхідний вхід Са2+ до клітини через потенціалзалежні Са2+ канали L-типу. В той же час, для активування КСа малої провідності, очевидно, необхідно підвищення [Са2+]i вище деякого порогового рівня (близько 50 - 85 нМ) незалежно від джерела надходження Са2+.

Спонтанні короткочасні потоки іонів Ca2+ із саркоплазматичного ретикулуму (СР) - Са2+ спарки - також можуть викликати активацію КСа великої провідності, але останні в цьому випадку будуть проявляти свою активність у вигляді СВС (Benham, Bolton 1986, Gordienko et al 1998). Наші дані підтверджують припущення (Benham, Bolton 1986, Ганіткевич, Шуба 1988), що СВС - це вторинний ефект періодичного вивільнення Ca2+ із кофеїнчутливого СР. Це вивільнення Са2+ також викликає і одночасну активацію харібдотоксинчутливих КСа великої провідності.

Підсумовуючи вищевикладені дані, можна зробити висновок, що в ГМК taenia coli морської свинки є два типи IK(Ca), що відрізняються не тільки провідністю каналів, через які ці струми переносяться, але й різною чутливістю до [Са2+]i та потенціалу на мембрані, відношенню до блокаторів (апаміну, харібдотоксину, ТЕА) а також кінетичними характеристиками.

І, нарешті, в заключній частині роботи нами була показана здатність апаміну активувати катіонну провідність мембрани. Внесок цієї провідності в інтегральний трансмембранний іонний струм значно менший у порівнянні з ICa або IK, однак, в межах потенціалу спокою ГМК активування катіонних каналів може відігравати ключову роль в процесах деполяризації клітинної мембрани, активуванні потенціалзалежних Са2+ каналів і, отже, збудливості ГМК.

Питання щодо функціональної ролі виявлених іонних струмів остаточно не вирішене. Що стосується Са2+ каналів L-типу, то вони є основним шляхом входу іонів Са2+ до клітини які відіграють ключову роль в спряженні між збудженням та скороченням ГМК. Активація катіонних каналів - головний механізм деполяризації мембрани при агоніст-індукованому збудженні ГМК ШКТ. Активація К+ каналів має важливе значення в контролі мембранного потенціалу і модуляції збудливості ГМК.

ГМК taenia coli морської свинки електрично збудливі - у відповідь на стимуляцію вони генерують потенціал дії (ПД) з “овершутом” в 10 - 15 мВ та слідовою гіперполяризацією (рис. 12). ПД ГМК є результатом сумарного, але строго регульованого, руху іонів через плазматичну мембрану. В більшості міоцитів фаза порогової деполяризації за фізіологічних умов, мабуть, опосередкована потоком іонів натрію (та, можливо, хлору) через катіонні (та хлорні) канали. Початкова порогова деполяризація, що розвивається при відкриванні цих каналів призводить до активації потенціалзалежних Ca2+ каналів L-типу. Фаза реполяризації формується балансом інактивації вхідного ICa, і активацією вихідного IK через потенціал- та Са2+-залежні К+ канали. Слідова гіперполяризація зумовлена роботою, в основному тільки КСа малої провідності, які мають більш високу чутливість до [Ca2+]i ніж КСа великої провідності. Виходячи з результатів наших досліджень, можна зробити припущення, що апамін здатний блокувати фазу слідової гіперполяризації, а також ініціювати фазу порогової деполяризації ПД. Друга можливість раніше в літературі описаною не була, і може бути важливою доповнюючою ланкою в механізмі дії апаміну.

Як показано в нашій роботі, внесок апамінчутливого компоненту IK(Ca) в сумарний трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки вельми незначний. При 0 мВ (потенціал реверсії катіонного струму), коли ефект апаміну полягає лише в блокуванні КСа малої провідності, внесок апамінчутливого IK(Ca) до загального трансмембранного іонного струму становить всього 10 - 15 %. В межах потенціалу спокою вхід Са2+ до клітини через потенціалкеровані Са2+ канали відсутній, проте апамінчутливі КСа малої провідності можуть активуватися за рахунок вивільнення Са2+ з ІР3-чутливого СР. В гладеньких м’язах ШКТ цей механізм може пояснити гальмівну дію АТФ, який передбачається (Владимирова, Шуба 1978, Байдан та ін. 1978, Shuba, Vladimirova 1980, 1981) на роль медіатора НАНХ синаптичного гальмування. Механізм цього АТФ-індукованого гальмування полягає в зв’язуванні АТФ з Р2У рецептором, активації фосфоліпази С, що призводить до збільшення синтезу ІР3 та підвищення рівня [Ca2+]i, яке і призводить до активації КСа малої провідності чутливих до блокуючої дії апаміну (Kong et al 2000).

Таким чином, дія апаміну на трансмембранний іонний струм в ГМК taenia coli морської свинки включає в себе два механізми: блокування КСа малої провідності, з одного боку, та активування катіонної провідності, з іншого боку. Причому, в районі потенціалу спокою ГМК, обидва ці ефекти спрямовані в бік збільшення вхідного струму, тобто сприяють розвитку деполяризації ГМК. Активування катіонної провідності відіграє важливу роль в розвитку порогової деполяризації для генерації ПД ГМК. Блокування ж КСа малої провідності, що відіграють основну роль в розвитку повільної слідової гіперполяризації, сприятиме збільшенню частоти генерації ПД.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу фіксації потенціалу було показано, що трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки, активований ступінчатою деполяризацією, складається з вхідного Са2+ струму L-типу і вихідного К+ струму, в якому можна виділити три компоненти: потенціалзалежний струм “затриманого випрямлення” та два Са2+-залежні струми, один з яких чутливий до блокуючої дії апаміну, другий - до харібдотоксину. Крім того, виявлено новий апамін-активований катіонний струм з потенціалом реверсії близько 0 мВ.
2. Апамінчутливий компонент IK(Ca) не мав потенціалзалежних властивостей, не виявляв часзалежної інактивації, був нечутливий до дії TЕA (4 мМ) і повністю блокувався апаміном в концентрації 500 нМ.
3. Харібдотоксинчутливий компонент IK(Ca) був потенціалзалежний, мав швидку кінетику інактивації - його спад практично співпадав з кінетикою інактивації Ca2+ струму, також цей струм був чутливий до дії TЕA в концентрації менше, ніж 1 мМ; харібдотоксин в концентрації 100 нМ повністю його блокував.
4. Апамінчутливий компонент IK(Ca) мав високу чутливість до [Ca2+]i і тільки зниження [Ca2+]i до 50 нМ призводило до повного його блокування. Цей струм активувався збільшенням [Ca2+]i не залежно від його джерела. Чутливість харібдотоксинчутливого компоненту IK(Ca) до [Ca2+]i була нижчою, ніж у апамінчутливого. Для активації цього струму необхідний вхід Са2+ через потенціалзалежні Са2+ канали, а при вивільненні Са2+ із внутрішньоклітинних депо його активність проявляється у вигляді СВС.
5. Відносний внесок компонентів К+ струму до сумарного вихідного струму (на максимумі амплітуди) при 0 мВ становив 35 - 45 % для потенціалзалежного К+ струму “затриманого випрямлення”, 5 - 15 % для апамінчутливого IK(Ca) та 45 - 55 % для харібдотоксинчутливого IK(Ca).
6. Вперше показано, що дія апаміну на трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки включає в себе два механізми: блокування КСа малої провідності, з одного боку, та активування катіонної провідності, з іншого боку.
7. При фізіологічних значеннях мембранного потенціалу ГМК обидва ці ефекти апаміну спрямовані у бік збільшення вхідного струму, тобто сприяють розвитку деполяризації клітини і перешкоджають розвитку слідової гіперполяризації ПД.

Список опублікованих робіт здобувача за матеріалами дисертації.

1. Зима О.В., Бєлєвіч А.Е., Повстян О.В., Хархун М.І., Цицюра Я.Д., Шуба М.Ф., “Механізм дії донорів окису азоту на потенціалкеровані кальцієві канали гладеньком’язових клітин судин”, Нейрофізіологія, 1996, т.28, № 6: 296-304.
2. Повстян О.В., Зима О.В., Рєзніков В.Л., Цицюра Я.Д., Шуба М.Ф., “Компоненти трансмембранного іонного струму електрозбудливої мембрани гладеньком’язових клітин taenia coli морської свинки”, Нейрофізіологія, 1997, т.29, № 4/5: 340-350.
3. Зима О.В., Повстян О.В., Шуба М.Ф., “Кальційзалежні калієві канали великої провідності в мембрані гладеньком’язових клітин taenia coli морської свинки”, Вісник Харківського університету, 1999, № 466, серія “Біофізичний вісник”, випуск 5: 47-51.
4. Повстян О.В., Зима О.В., Хархун М.І., Шуба М.Ф., “Властивості харібдотоксинчутливого компонента кальційзалежного калієвого струму в гладеньком’язових клітинах taenia coli морської свинки”, Нейрофізіологія, 2000, т.32, № 1: 16-21.
5. Хархун М.І, Бєлєвіч А.Е., Повстян О.В., Шуба М.Ф., “Роль потенціалзалежних калієвих каналів в формуванні мембранного потенціалу спокою міоцитів резистивних артерій щура”, Фізіологічний журнал, 2000, т 46, № 2: 91-97.
6. Повстян О.В., Зима О.В., Хархун М.І., Шуба М.Ф., “Властивості апамінчутливого компонента кальційзалежного калієвого струму в гладеньком’язових клітинах taenia coli морської свинки”, Нейрофізіологія, 2000, т.32, № 2: 89-95.
7. Povstyan O.V., Rekalov V.V., Shuba M.F., “Unusual effect of apamin on holding current in guinea pig taenia coli cells”, Biophysical Journal, 1996, 70, № 2: A97 // 40-th Annual Meeting of the Biophysical Society, February 17-21, Baltimore, USA.
8. Shuba M.F., Povstyan O.V., “The components of potassium current in electrically excitable membrane of taenia coli single smooth muscle cells”, Physiology, 1996, 6, № 2: 35 // Joint Meeting of the Hungarian Physiological Society and the Romanian Society of Physiological Sciences, June 29 - July 5, Szeged, Hungary and Timisoara, Romania.
9. Povstyan O.V., Myakushko O.I., Shuba M.F., “Potassium currents in the membrane of guinea pig taenia coli smooth muscle cells”, Digestive Diseases and Sciences, 1997, 42, № 1: 198 // IUPHAR GI Section Conference, September 3-7, Sperlonga, Italy.
10. Povstyan O.V., Rekalov V.V., Shuba M.F., “Activation of the ionic current by apamin”, Biophysical Journal, 1997, 72, № 2: A271 // 41-st Annual Meeting of the Biophysical Society, March 2-6, New Orleans, USA.
11. Повстян ОВ., Зима О.В., Рєзніков В.Л., Шуба М.Ф., “Фармако-біофізичні характеристики Са2+-активованих калієвих струмів мембрани гладеньком’язових клітин taenia coli морської свинки”, Збірник тез доповідей, с. 116 // ІІ з’їзд Українського Біофізичного товариства, 29 червня - 3 липня, 1998, Харків, Україна.
12. Povstyan O.V., Zima O.V., Shuba M.F., “Characteristics of Ca2+-activated potassium currents in the membrane of guinea pig taenia coli smooth muscle sells”, Biophysical Journal, 1999, 76, № 1: A187 // 43-rd Annual Meeting of the Biophysical Society, February 13-17, Baltimore, USA.