|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ
Ковтунович Геннадій Леонідович
УДК 577.113.5: 577.152.3
КЛОНУВАННЯ ТА АНАЛІЗ СТРУКТУРИ І ФУНКЦІЙ
ГЕНА ЕКЗОПОЛІГАЛАКТУРОНАЗИ ЕНДОФІТНОЇ
БАКТЕРІЇ Klebsiella oxytoca VN13
03. 00. 22- молекулярна генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2002
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).
Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший
науковий співробітник
Козировська Наталія Олексіївна,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, старший науковий співробітник
відділу регуляторних механізмів клітини.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, член-
кореспондент НАН України
Мацелюх Богдан Павлович,
Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д. К. Заболотного НАН України,
завідувач відділу генетики мікроорганізмів;
кандидат біологічних наук, старший
науковий співробітник
Черепенко Олена Йосипівна,
Інститут молекулярної біології і
генетики НАН України, провідний науковий
співробітник відділу молекулярної генетики.
Провідна установа: Інститут агроекології та біотехнології
УААН, м. Київ.
Захист дисертації відбудеться “24 ” грудня 2002 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143,
вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143,
вул. Заболотного, 150.
Автореферат розіслано “ 20 ” листопада 2002 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О. В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Екологічна криза, що набуває все більш загрозливих масштабів, потребує термінових заходів по зменшенню техногенного навантаження на навколишнє середовище. Серед сфер людської діяльності величезний вплив на довкілля має сільськогосподарське виробництво. Інтенсивне використання мінеральних добрив, пестицидів та гербіцидів негативно впливає на стан довкілля та на загальний стан здоров’я населення.
Одним із шляхів виходу з даної ситуації є використання біопрепаратів комплексної дії на основі живих бактерій. Один із таких препаратів - “Клепс” було розроблено в нашому інституті, він пройшов повномасштабні випробування і добре зарекомендував себе серед сільськогосподарських товаровиробників. Позитивна дія даного препарату забезпечується реалізацією природних властивостей ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13, що має здатність до фіксації атмосферного азоту, синтезу гормонів росту рослин. Займаючи унікальну екологічну нішу у внутрішніх тканинах коренів, ці бактерії конкурують із місцевою патогенною мікрофлорою і запобігають ураженню кореневої системи рослин. У зв’язку з цим, актуальним є вивчення механізмів, що забезпечують взаємодію K. oxytoca VN13 з рослинами. Ці знання є необхідною передумовою для створення штучних штамів із заданими корисними властивостями.
K. oxytoca VN13 в кліматичних умовах України не виживає поза асоціацією з рослиною. Тому здатність до проникнення у внутрішні тканини коренів рослин є одним із основних факторів, що забезпечують ефективність даної бактерії. Але пошук біохімічних чинників та їх генетичних детермінант ускладнюється відсутністю чітких фенотипових ознак у бактерій та рослини- хазяїна, які б вказували на сам факт та інтенсивність колонізації, як це спостерігається при симбіотичній взаємодії бульбочкових рослин із представниками родини бобових. Однак, здатність K. oxytoca VN13 взаємодіяти з представниками небобових рослин та позитивний вплив на врожайність значної кількості сільськогосподарських культур робить актуальним дослідження в напрямку пошуку внутрішніх чинників, що впливають на цей процес та їх генетичних детермінант. Проведення досліджень в цьому напрямку надасть можливість направленої зміни властивостей даних бактерій та створення на основі генетично змінених штамів нових біопрепаратів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою “Вивчення підходів до створення асоціації господарсько-цінних рослин з ендофітними бактеріями” (№ 2.2.4.23).
Мета та завдання дослідження. Метою нашого дослідження було встановлення зв’язку між ефективністю внутрішньої колонізації коренів рослин бактерією K. oxytoca VN13 та функціонуванням системи пектинолізису цієї бактерії, а також окремих її компонентів; вивчення організації одного з генів пектинолізису та з’ясування його ролі в процесах взаємодії з рослинами. Також ми мали на меті розробити зручний та надійний метод ідентифікації K. oxytoca для спрощення виявлення цих бактерій в зразках різного походження. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:
1. Виділити форми бактерій K. oxytoca VN13, що мають підвищену пектолітичну активність та визначити їх здатність до внутрішньої колонізації коренів рослин порівнянно з вихідим типом.
2. Створити плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та клонувати ген (гени) пектинолізису в Escherichia coli.
3. Визначити нуклеотидну послідовність клонованого гена та вивчити його структуру.
4. Створити мутант з інактивованим пектиназним геном та дослідити значення клонованого гена в процесах катаболізму пектину та взаємодії K. oxytoca VN13 з коренями рослин.
5. Використовуючи фрагменти клонованої ДНК з унікальною послідовністю нуклеотидів, розробити праймери та відпрацювати методику ідентифікації K. oxytoca за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Об’єктом дослідження були молекулярно-генетичні механізми взаємодії ендофітних бактерій з рослинами, а предметом дослідження–роль екзополігалактуронази в процесах інтеграції цих бактерій у внутрішні тканини кореня рослини.
Для досягнення поставленої мети викостовували такі методи як клонування генів у плазмідному векторі, направлений мутагенез in vitro та заміщення нативного гена на мутантний in vivo, визначення і комп’ютерний аналіз нуклеотидної послідовності гена та виведеної амінокислотної послідовності.
Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що, в результаті виконання даної роботи, вперше було встановлено зв’язок між рівнем пектиназної активності ендофітних бактерій та інтенсивністю колонізації внутрішніх тканин коренів рислин. Вперше було клоновано ген екзополігалактуронази (pehX) K. oxytoca, визначено його нуклеотидну послідовність та проаналізовано кодований ним поліпептид порівняно з іншими спорідненими білками. Ідентифіковані в промоторній ділянці pehX-гена дві послідовності, що відповідають консенсусу для зв’язування KdgR-репресора, вказують на наявність даного регулона в K. oxytoca VN13. На підставі унікальності послідовності ДНК pehX-гена, вперше було розроблено метод ідентифікації K. oxytoca на основі ПЛР.
Практичне значення одержаних результатів полягає в можливості використання відібраних Pel+-форм як основи для виробництва біопрепаратів комплексної дії для використання в рослинництві. За результатами наших досліджень встановлено, що дана форма краще колонізує корені рослин з поверхні та із середини, а також має більший позитивний вплив на ростові характеристики рослин. Розроблений метод ідентифікації на основі ПЛР має велике практичне значення через його швидкість, надійність та можливість ідентифікувати K. oxytoca у складних популяціях бактерій.
Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано особисто автором або за його безпосередньої участі у плануванні та проведенні експериментів.
Апробація результатів. Матеріали дисертації пройшли апробацію на 10-му Міжнародному конгресі з азотфіксації (Санкт-Петербург, Росія, 1995), 7-му Конгресі з біотехнології (Ніца, Франція, 1995), 1-4-й Європейських конференціях з азотфіксації (Сегед, Угорщина, 1994; Познань, Польща, 1996; Люнтерен, Нідерланди, 1998; Севілья, Іспанія, 2000), Міжнародному науковому семінарі з охорони довкілля (Ужгород, 2001) та інших наукових зібраннях.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей та тези 10 доповідей у збірниках міжнародних конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, трьох розділів, в яких подано отримані результати та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 118 сторінках машинописного тексту. Вона містить 22 рисунки та 15 таблиць. Список використаної літератури охоплює 134 джерела.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження.
У роботі використовували штами: Klebsiella oxytoca VN13, K. oxytoca ATCC 13183, K. pneumoniae ATCC 13883, K. planticola ATCC 33531, Escherichia coli JM109, E. coli DH5б, E. coli JM109 λpir, E. coli S17-1 λpir, Erwinia carotovora subsp. carotovora 8982, E. carotovora subsp. atroceptica 9027, E. chrysanthemi 8183. Як поживне середовище для вирощування бактерій використовували LB. При дослідженні пектолітичних функцій використовували мінімальне середовище М9 з 0,2% гліцерином. При необхідності додавали полігалактуронат натрію (ПГН) або глюкозу до концентрації 0,2% та вітамін В1 до 0,0005% при вирощуванні штамів E. coli. Для виявлення пектиназної активності використовували чашки з середовищем Логана або з кальційстабілізованим поліпектатним гелем (Starr, 1977).
Ферменти рестрикції BamHI, BglI, NotI, EcoRI, HindIII, PstI, XbaI, SalI, MluI фірми “Fermentas” та SacI, Sau3A, HpaII фірми “Pharmacia Biotech”, ДНК-полімеразу І, ДНК-лігазу фага T4, лужну фосфатазу фірми “Boehringer Mannheim”, фрагмент Кльонова ДНК-полімерази І, Taq-полімеразу та екзонуклеазу Bal31 фірми “Fermentas” використовували за приписом виробника. Гель-електрофорез, елюцію ДНК з гелю та перенос фрагментів ДНК з агарозного гелю на нейлонову мембрану для блот-гібридизації здійснювали за стандартними методиками (Sambrook et al., 1988). Гібридизацію здійснювали з використанням набору для мічення та детекції фірми “Boehringer Mannheim”, в якому використовується дигоксигенінова мітка.
Приготування і зберігання компетентних клітин, а також трансформацію, здійснювали за методом Нішімура (Nishimura, 1990).
Підбір праймерів для ідентифікації K. oxytoca VN13 методом ПЛР та аналіз термодинамічних характеристик олігомерів здійснювали за допомогою програми “Gene Runner 3.00”. В реакційній суміші використовували стандартний буфер для Taq-полімерази, додаючи дезоксинуклеотидтрифосфати до концентрації 0,2 мМ та MgCl2 до 2,5 мM. Зміна концентрації іонів Мg++ в діапазоні 1-4 мМ не впливала на вихід і чистоту продуктів реакції. Ампліфікацію виконували на приладі “Gene ATAQ Controller”. Оптимальні параметри програми: попередня денатурація - 95 °С - 2 хв, потім цикл: 94 °С - 20 с, 59 °С - 30 с, 72 °С - 20 с, що повторювався 25 - 35 разів, залежно від концентрації ДНК в пробі. За зразки для ПЛР-аналізу використовували очищені препарати ДНК та температурні лізати бактерій, що отримували інкубуванням відмитої бактеріальної суспензії на водяній бані при 100 °С протягом 3 - 4 хв.
Нуклеотидну послідовність ДНК визначали за методом Сенгера (Sanger et al., 1977) з використанням автоматичного секвенатора ALF Express та набору для секвенування “Cy5 AutoCycle” (“Pharmacia Biotech”) Для аналізу визначеної нуклеотидної послідовності та виведеної амінокислотної послідовності полігалактуронази використовували програму “Gene Runner 3.00”. Аналіз гомології ДНК та поліпептидного продукту здійснювали, використовуючи комп’ютерні програми blastn та blastx електронної служби Blast 2.0 Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) США. Пошук промоторів здійснювали за допомогою програми NNPP (Neural Network Promoter Prediction) (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html). Аналіз N-кінця первинного транслянта проводили за допомогою програми SignalP-HMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0).
Полігалактуроназну активність визначали за збільшенням концентрації вільних альдегідних груп, яку визначали фериціанідним методом (Starr, 1977). За одиницю активності брали таку кількість ферменту, що вивільняє 1 мМ альдегідних груп при 37 °С за 1 хв. в реакційній суміші такого складу: 0,5 % ПГН; 0,05 М Na(CH3COO) (pH 5,2); 0,2 M NaCl. Пектатліазну активність визначали за поглинанням ненасичених продуктів реакції при довжині хвилі 235 нм у реакційній суміші: 0,23 % ПГН; 0,1 М трис-HCl (pH 8,5); 0,3 M CaCl2. За одиницю активності брали кількість пектатліази, що збільшувала оптичну густину реакційної суміші на 1,0 опт. од. при 235 нм за 1 хв при 37 °С.
Зернівки пшениці стерилізували препаратом “Білизна” протягом 20 хв, поверхню корінців проростків - 5 хв. Для визначення кількості асоційованих бактерій наважку кореня розтирали в керамічній ступці з невеликою кількістю 0,8 % NaCl і висівали різні розведення на чашки із селективним середовищем.
Результати дослідження та їх обговорення.
1. Пектолітичні ферменти K. oxytoca VN13. Характеристика Pel+-клонів. Наявність пектолітичних ферментів у K. oxytoca VN13 було показано за допомогою тесту з використанням середовища Логана та підтверджено кількісним методом. Як субстрат використовували полігалактуронат натрію (ПГН), що є основою пектинових полімерів. Використовуючи фериціанідний метод визначення відновлювальної здатності розчинів, що дає можливість визначення концентрації вільних альдегідних груп як міри ступеня деградації ПГН, встановлено, що лізат K. oxytoca VN13 має два піки пектолітичної активності - в кислій та лужній ділянках рН (рис.1). Це вказує на наявність як полігалактуроназної (ПГ), так і пектатліазної (ПЛ) активностей.
Рис. 1. Залежність кількості вивільнених альдегідних груп від pH реакційної суміші
Метод визначення ПЛ-активності, що базується на поглинанні продуктів деградації субстрату цим ферментом при λ=235 нм, підтвердив, що тільки пік в лужній ділянці рН є результатом дії пектатліаз. Таким чином K. oxytoca VN13 має дві основні групи ферментів, що деполімеризують ПГН.
Встановлено, що більшість клітин лабораторного штаму K. oxytoca VN13 не має здатності засвоювати ПГН як єдине джерело вуглецю. Але з частотою 10-7 - 10 –5 в популяціях K. oxytoca VN13 виявлялись клітини, які здатні до росту з утворенням клонів на мінімальному середовищі з ПГН. Даний фенотип, позначений нами як Рel+, вказує на наявність в K. oxytoca VN13 всього комплексу генів катаболізму ПГН, але деякі з них знаходяться в криптичному стані, а їх активація відбувається внаслідок певних генетичних змін. При культивуванні Рel+-клонів на середовищі LB в популяції з’являються клітини дикого типу, які швидко витісняють Рel+-форми в процесі росту культури. При дослідженні властивостей Рel+-клонів K. oxytoca VN13, увагу привернули три особливості цих бактерій: 1) Рel+-клони мали втричі вищий рівень ПЛ- активності; 2) при обробці такими бактеріями насіння пшениці ефективність колонізації внутрішніх тканин коренів проростків була значно вищою, порівняно з диким типом; 3) Рel+-клони мали більший позитивний вплив на ріст проростків (табл.1).
Таблиця 1
Властивості Рel+-клонів Klebsiella oxytoca VN13
З наведених результатів випливає, що існує певний зв'язок між рівнем пектолітичної активності, здатністю бактерій до колонізації внутрішніх тканин коренів та стимуляцією росту рослин.
2. Клонування та визначення нуклеотидної послідовності pehX-гена. Банк генів K. oxytoca VN13 створювали на основі плазміди pBluescriptSKM. Для цього проводили неповний гідроліз хромосомної ДНК рестриктазою Sau3A, елюювали з агарозного гелю фрагменти розміром від 3 до 10 тис. п. н. та лігували з вектором, лінеаризованим BamHI. Сумішшю трансформували компетентні клітини E. coli JM109. Серед 4500 рекомбінантних клонів виявлено один, що занурювався на чашках з кальційстабілізованим поліпектатним гелем, а отже мав пектолітичну активність.
Виділена з даного клону плазміда pBluS2 містила вставку близько 3,5 тис. п. н. геномної ДНК K. oxytoca VN13. При додаванні ізопропілтіогалактозиду як індуктора векторного промотора рівень експресії пектолітичної функції не підвищувався, що вказувало на експресію гена з власного промотора. Пектолітична функція не проявлялась при наявності глюкози в середовищі, що вказувало на катаболітну репресію. Експресія клонованого гена в E. coli мала прояви токсичної дії продукту на цю бактерію, тому, для забезпечення стабільності наслідування, фрагмент було переклоновано в плазміду pK18, що несе ген резистентності до канаміцину, з утворенням плазміди pKS2. Кількісне визначення пектолітичної активності показало відсутність ПЛ-активності і наявність ПГ-активності. Дані вимірювання, які подано в табл. 2, показують, що K. oxytoca VN13, як і E. coli DH5α, з даною плазмідою мають в 5 разів вищий рівень ПГ-активності, ніж дикий тип K. oxytoca VN13.
Таблиця 2
Активність полігалактуронази, мМ · хв-1 · мл-1
Субклони клонованого фрагмента (рис. 2), створені відповідно до встановлених сайтів рестрикції (pBluS2ΔH, pBluS2ΔR, pKRS2, pKPS2, pKS2ДP, pUCMHS2, pKRMS2) та з використанням екзонуклеази Bal31 для вкорочення MluI-HindIII фрагмента (pBlu0.7Bal, pBlu0.9Bal, pBlu1.0Bal, pBlu1.4Bal), використовували для визначення нуклеотидної послідовності клонованого гена. Визначену нуклеотидну послідовність (2541 п. н.), що містить відкриту рамку зчитування (1974 п. н.), промоторну (237 п. н.) та прилеглу до 3'-кінця (330 п.н.) ділянки, зображено на рис. 3.
Рис. 2. Рестрикційна карта клонованого фрагмента та створені субклони
3. Аналіз первинної послідовності кодованого білка. Виведена з послідовності ДНК клонованого фрагмента амінокислотна послідовність становить 658 амінокислотних залишків (рис. 3), а розрахована молекулярна маса 71,9 кДа. Аналіз N-кінця показав наявність типової для сигнального пептиду послідовності амінокислот. Аспарагін в позиції 3 та аргінін в позиціях 2, 6, 9 формують позитивно заряджену голівку сигнального пептиду, за якою йде гідрофобне ядро з 16 нейтральних амінокислот та кілька потенційних сайтів розщеплення для sec-системи. Ймовірність існування сигнального пептиду, що оцінено програмою SignalP-HMM, становить 0,998. Найбільш ймовірним сайтом розщеплення є зв’язок між гліцином та цистеїном в позиціях 24, 25. Передбачена послідовність зрілого білка становить 634 амінокислотних залишків, а молекулярна маса - 69,5 кДа. Враховуючи той факт, що даний фермент майже не спостерігався в культуральній рідині, можна зробити висновок про його периплазматичну локалізацію.
1 GATCGGGGTTTGCCCATATCGTACCGACTTCGTGCGGCTATCGTATCGATGATTCTCAGCAGTAGAAGGGAAGCTGGGCGGTGAGGTCCG
91 CCTTTGCTTATCTGATTAAGTTTTTTTTCGCCTGATGAAAGATTGAACTGACTCGCGTTTATTTTCCCACATAAATATAAAATGATGTTT
| сигнальний
1 СЗР MetArgAsnThrPheArgProAlaArgGlyMet
181 TATTTTAAATGAATTTGAATTTTATTTTCTCATAAAATATGACATTAAGGAAAATCTATGCGCAATACCTTCAGACCTGCACGCGGCATG
пептид |
12 LeuAlaLeuAlaIleAlaLeuAlaGlyLeuAlaGlyGlyCysAsnAspSerGlyGlyThrValAspAsnGlnHisAspAlaProAlaSer
271 CTGGCGTTGGCAATCGCACTAGCCGGGCTCGCAGGCGGCTGTAATGACAGCGGCGGAACCGTCGATAACCAGCACGATGCGCCCGCCTCC
42 AlaProGlnAsnValMetValProIleLeuSerAlaAspGluAsnSerLeuValLeuValTrpGluLysProGluSerGluThrGluGln
361 GCGCCACAAAATGTCATGGTTCCGATACTGTCTGCCGATGAAAACAGCCTGGTGCTGGTCTGGGAAAAACCGGAGTCTGAGACCGAGCAG
72 ValValAspTyrAlaValTyrArgGlnGlyGluArgLeuGlyLeuAlaArgGluAsnGlnAsnHisPheSerProAlaLysProTyrIle
451 GTGGTGGACTACGCCGTCTATCGTCAAGGCGAGCGGCTGGGCCTGGCGCGTGAAAATCAAAACCATTTTTCCCCGGCAAAGCCCTATATT
102 AspAsnPheTyrGlnArgIleAlaSerAspGlyTrpGlnGlnLysIleAspLeuArgSerPheThrAlaThrAsnLeuGlnProAspThr
541 GATAACTTCTATCAGCGGATCGCCAGCGACGGCTGGCAGCAGAAAATCGATCTGCGCAGCTTCACGGCCACCAACCTGCAGCCGGATACG
132 GluTyrAlaPheThrValArgAlaValTyrAlaAsnGlyGlnGluSerProAspSerAlaValValLysAlaGlnThrArgLysThrPro
631 GAGTATGCCTTTACGGTGCGCGCGGTCTACGCCAATGGCCAGGAATCTCCGGACAGCGCGGTGGTTAAAGCGCAAACCCGCAAAACGCCG
162 HisValIleGluAlaSerThrPheGlyAlaLysGlyAspGlyThrThrLeuAsnThrGlnAlaLeuGlnArgAlaIleAspSerCysThr
721 CACGTCATCGAAGCCAGCACATTCGGCGCGAAGGGTGACGGCACCACGCTGAATACCCAGGCGCTGCAGCGGGCCATTGATAGCTGTACC
192 ValThrHisTyrProGlnGlyCysLysValLeuIleSerGlyGlyGluPheLysThrGlyAlaLeuPheLeuHisSerAspMetThrLeu
811 GTCACGCACTATCCTCAGGGCTGCAAGGTGCTGATTTCCGGCGGCGAATTCAAAACTGGCGCGTTGTTCCTGCACAGCGATATGACCCTG
222 AspIleAlaAlaGlyAlaThrLeuLeuGlySerAspAspProAlaGlnTyrProLeuAspLysGlyTyrTyrLeuTyrProTyrSerAsp
901 GATATTGCGGCTGGCGCCACCCTGCTGGGTTCGGACGATCCGGCCCAGTATCCGCTTGATAAAGGCTATTACCTCTATCCCTATAGCGAT
252 HisProGlnProArgArgProProSerLeuIleAsnValLeuGlyAlaAspAspLysGlyGluSerProAlaGlyThrPheArgAsnIle
991 CATCCGCAGCCTCGCCGCCCGCCATCATTAATTAACGTGCTGGGCGCGGACGATAAGGGCGAGTCTCCGGCCGGAACGTTTCGTAATATT
| 
