|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ
Лар Олена Василівна
УДК 577.113.5: 577.152.3
КЛОНУВАННЯ ТА АНАЛІЗ СТРУКТУРИ І ОСОБЛИВОСТЕЙ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНА ЕКЗОПЕКТАТЛІАЗИ ЕНДОФІТНОЇ
БАКТЕРІЇ Klebsiella oxytoca VN13
03. 00. 22- молекулярна генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2003
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).
Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший
науковий співробітник
Козировська Наталія Олексіївна,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, старший науковий співробітник
відділу регуляторних механізмів клітини.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Менджул Михайло Іванович,
Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д. К. Заболотного НАН України,
завідувач відділу вірусів водоростей;
кандидат біологічних наук, старший
науковий співробітник
Карпова Ірина Сергіївна
Інститут молекулярної біології і
генетики НАН України, старший науковий
співробітник відділу генетики людини.
Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної
інженерії НАНУ, м. Київ.
Захист дисертації відбудеться “ 25” лютого 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143,
вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143,
вул. Заболотного, 150.
Автореферат розіслано “25” січня 2003 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О. В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Інтенсивний розвиток генетичної інженерії та її впровадження в усі галузі біотехнології дозволяє проводити пошук та ідентифікацію генетичних детермінант корисних властивостей промислових штамів мікроорганізмів. У зв'язку з широким використанням у практиці сільського господарства біопрепаратів на основі ендофітних бактерій дослідження молекулярних механізмів взаємодії цих бактерій з рослиною стає наразі актуальним напрямком наукової роботи. До того ж, ефективність створюваних біопрепаратів можна значною мірою підвищити за рахунок модифікації генетичного контролю суттєвих для рослинництва характеристик бактерій.
Колонізуючи рослину, ендофітна бактерія K. oxytoca VN13 ефективно конкурує з патогенною мікрофлорою, а до того ж стимулює ріст рослинної біомаси фітогормонами та іншими фізіологічно активними речовинами, фіксує атмосферний азот та захищає рослини від накопичення в їх біомасі радіонуклідів та важких металів. Хоча в умовах України K. oxytoca VN13 не виживає поза асоціацією з рослиною, здатність до внутрішньої колонізації дозволяє їй швидко відновити популяцію зовнішньої поверхні кореня в разі вимирання бактерій при несприятливих умовах. Створені на основі K. oxytoca VN13 біопрепарати, зокрема “КЛЕПС”, добре зарекомендували себе як стимулятори росту та розвитку значної кількості сільськогосподарських культур, що дозволяє вважати їх природозберігаючою альтернативою використанню хімічних добрив.
Відомо, що здатність фітопатогенних бактерій, таких як Erwinia chrysanthemi та Erwinia carotovora, до мацерації рослинних тканин залежить від рівня експресії пектиназних генів, в першу чергу - пектатліаз, які задіяні в процесі деполімеризації пектину клітинної стінки рослини. У зв'язку з можливою залежністю здатності ендофітної бактерії K. oxytoca VN13 до колонізації рослин з рівнем експресії генів пектинолізису, вивчення організації та функціонування пектатліазних генів K. oxytoca VN13 може допомогти виявити молекулярні механізми цього процесу.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою “Вивчення підходів до створення асоціації господарсько-цінних рослин з ендофітними бактеріями” (№ держреєстрації 0199V000725, 1999-2002 рр.).
Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення організації одного з пектатліазних генів K. oxytoca VN13 та особливостей його експресії при наявності в середовищі індукторів рослинного походження, а також внесок кодованої ним пектатліази в загальну пектатліазну активність цієї бактерії. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:
- Створити плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та клонувати ген пектатліази в Escherichia coli.
- Визначити нуклеотидну послідовність клонованого гена та дослідити його структуру.
- Створити інсерційний мутант K.oxytoca VN13 з неактивною копією pelX-гена та встановити наявність або відсутність у K. oxytoca VN13 додаткового пектатліазного гена (-ів).
- Дослідити характер експресії pelX-гена у відповідь на додавання в середовище індукторів рослинного походження.
Для досягнення поставленої мети використовували такі методи як клонування генів у плазмідному векторі, направлений мутагенез in vitro та заміщення нативного гена на мутантний in vivo, визначення і комп'ютерний аналіз нуклеотидної послідовності гена та виведеної амінокислотної послідовності, біохімічне визначення активності ферментів.
Об'єктом дослідження були генетичні детермінанти пектолітичної активності K. oxytoca, а предметом - структура та регуляторні елементи гена, що кодує екзопектатліазу K. oxytoca VN13 та характер його експресії, а також внесок відповідного білка в загальну пектолітичну активність K. oxytoca VN13.
Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що в результаті виконаної роботи було клоновано ген екзопектатліази K. oxytoca, вперше визначено та проаналізовано його нуклеотидну послідовність та кодований нею поліпептид порівняно з гомологічними білками інших бактерій. У промоторній частині pelX-гена ідентифіковано дві операторні ділянки для зв'язування KdgR- репресора, що вказує на належність pelX-гена до вказаного регулона, наявність якого в K. oxytoca VN13 було встановлено нами раніше (Ковтунович та ін., 2000). Створений мутантний штам K. oxytoca VN13 з інактивованим pelX- геном дозволив виявити наявність ще одного або декількох пектатліазних генів у даної бактерії. Встановлено конститутивний характер експресії pelХ-гена та висунуто припущення про існування додаткового негативного регулятора його експресії. Запропоновано можливу роль продукту гена pelX як ініціатора процесу пектинолізису.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дозволяють охарактеризувати деякі риси структури і функціонування пектолітичної системи K. oxytoca VN13. Вказати на можливу роль продукту гена рelX як активатора процесу пектинолізису, а також можливі механізми контролю рослиною пектолітичної активності K. oxytoca, які дозволяють даній бактерії колонізувати внутрішні тканини рослини, але не спричиняти їх мацерацію, що може бути внеском у дослідженні механізмів створення асоціацій господарсько - цінних рослин із бактеріями.
Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано та проаналізовано особисто автором або за його безпосередньої участі у плануванні та проведенні експериментів.
Апробація матеріалів дисертації. Матеріали, викладені в дисертації, пройшли апробацію на міжнародному науковому семінарі “Fourth European Nitrogen Fixation Conference”, Севілья, Іспанія, 2000.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті у фахових наукових виданнях і тези однієї доповіді.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, трьох розділів, в яких викладено отримані результати та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 117 сторінках машинописного тексту. Вона містить 28 рисунків та 7 таблиць. Список використаної літератури охоплює 130 джерел.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження.
Бактеріальні штами та плазміди. У роботі використовували штами Еscherichia coli JM 109, Е. coli S17-1, Е. coli S17-1лpir та Klebsiella oxytoca VN13 з колекції відділу. Було використано плазміди pUC19, pUC28, pBluescriptSKM, pJP5603, pHP45Щ-Cm з колекції відділу та плазміди pDK5 та pCB192, що були люб’язно надані проф. Д. Кляйнером (Університет м. Байройт, ФРН).
Бактеріальні середовища та умови вирощування. Для вирощування бактерій використовували середовище LB та мінімальне середовище М9 (Miller, 1972). Антибіотики ампіцилін та рифампіцин використовували в концентрації 100 мкг/мл, канаміцин - 50 мкг/мл, хлорамфенікол - 60 мкг/мл. Штами Е. coli та K. oxytoca вирощувалися при 37°С та 30°С відповідно. Для якісного виявлення пектиназної активності використовували чашки з кальційстабілізованим поліпектатним гелем (Starr, 1977).
Біохімічне визначення пектатліазної та β- галактозидазної активності. Загальну пектатліазну активність в лізатах бактеріальних культур вимірювали за методом, що базується на спектрофотометричному моніторингу вивільнення ненасичених продуктів з полігалактуронату натрію, які мають максимум поглинання при 235 нм (Starr et al., 1977). За одиницю активності брали кількість ферменту, що вивільняє 1 мкМ ненасичених уронідів з полігалактуронату за одну хвилину, що відповідає збільшенню поглинання реакційної суміші на 1,6 опт. од. при заданих умовах та температурі 37°С (Евтушенков и др., 1996). β- галактозидазну активність в лізатах бактеріальних культур вимірювали, використовуючи методику, що базується на спектрофотометричному моніторингу вивільнення забарвленого продукту (о- нітрофенолу) з безбарвного о- нітрофеніл- β-d- галактопіранозиду (ОНПГ), який має максимум поглинання при 420 нм (Miller, 1972). За одиницю активності брали кількість ферменту, що вивільняє 1 мкМ о- нітрофенолу за одну хвилину, що призводить до збільшення поглинання реакційної суміші на 1,3 опт. од. при заданих умовах та температурі 30°С, як це було встановлено за допомогою калібрувальної кривої. Питому активність ферментів вимірювали, перераховуючи загальну активність ферменту на 1 мл бактеріальних лізатів, вирівняних за оптичною густиною.
Генноінженерні методи. Виділення плазмід та хромосомної ДНК, гідроліз ендонуклеазами рестрикції, лігування, гель - електрофорез, елюцію ДНК з гелю та перенос фрагментів ДНК з агарозного гелю на нейлонову мембрану для блот- гібридизації здійснювали за стандартними методиками (Sambrook et al., 1989). Гібридизацію проводили з використанням набору для мічення та детекції фірми “Boehringer Mannheim”, в якому використовується дигоксигенінова мітка. Для отримання компетентних клітин бактерій та трансформації користувалися методом Нішімура (Nishimura, 1990). Первинну послідовність ДНК клонованого фрагмента визначали за методом Сенгера (Sanger, 1977), використовуючи апарат ALF expressTM та Cy5TM AutoCycle набір фірми “Pharmacia Biotech”; частину нуклеотидної послідовності отримали з сервісу “MWG AG Biotech" (Еберсберг, ФРН). Для аналізу ДНК та поліпептидного продукту використовували програму “Generunner”, програму NNPP (Neural Network Promoter Prediction) та “SignalP prediction 2.0” (Nielsen, 1997), а також програми blastn та blastx електронної служби Blast Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) (США).
Реєстрація нуклеотидної послідовності в електронному банку генів. Визначена нуклеотидна послідовність pelX- гена зареєстрована в EMBL, GenBank та DDBJ під номером AF454849.
Результати дослідження та їх обговорення.
Клонування pelX-гена K. oxytoca VN13, визначення і аналіз його нуклеотидної послідовності та виведеної амінокислотної послідовності кодованого ним білка. Для пошуку генів пектинолізису K. oxytoca VN13 було створено геномну бібліотеку на основі вектора pUC19 з використанням для її створення Sau3A фрагментів хромосомної ДНК K. oxytoca VN13 розміром 4-9 тис. п. н. Скрінінг 1000 клонів трансформантів на селективному Pес-SSA середовищі дозволив ідентифікувати один клон, що утворює заглиблення в поліпектатному гелі, тобто демонструє пектолітичну активність. З відібраного клону було виділено плазміду розміром 7,9 тис. п. н., що отримала назву pPL11.
Було проведено біохімічне визначення наявності пектатліазної активності в лізаті культури бактерій E. coli JM109, що містить плазміду pPL11. (табл. 1). Експеримент продемонстрував високий рівень пектатліазної активності для штаму Е. coli JM109, трансформованого pPL11 що в 10 разів перевищувала загальну пектатліазну активність K. oxytoca VN13. Отриманий результат дав можливість ідентифікувати клонований в складі плазміди pPL11 ген, як такий, що кодує пектатліазу.
Таблиця 1
Пектатліазна активність штамів бактерій E. coli JM109 без плазміди,
E. coli JM109 з плазмідою pPL11 та K. oxytoca VN13
Рестрикційний аналіз, проведений за допомогою набору колекції рестриктаз, продемонстрував, що рPL11 містить 5,2 тис. п. н. інсерцію хромосомної ДНК (рис.1). Подальший делеційний аналіз дав змогу локалізувати клонований ген в межах 3 тис. п. н. SacI- EcoRV фрагмента рPL11, який було переклоновано у вектор pUC28 (рис.1), отриманою конструкцією pLC28Р трансформовано E. coli JM109 та перевірено на наявність пектатліазної активності. Було встановлено, що така активність у клітин E. coli з плазмідою рPL11 та pLC28Р не відрізняється. У складі вказаних конструкцій клонований ген має орієнтацію протилежну щодо напрямку транскрипції із векторного промотору Рlac. Це дозволяє зробити висновок про експресію пектатліазного гена в межах клонованого фрагмента хромосомної ДНК K. oxytoca VN13 із власного промотору.
Рис. 1. Рестрикційна карта повного та мінімального фрагментів ДНК, що містять клонований ген K. oxytoca VN13
За допомогою хроматографії на папері було встановлено екзосубстратну специфічність продукту клонованого гена при дії на полімерний субстрат-полігалактуронат, що є складовою частиною пектину стінки рослинної клітини.
Аналіз нуклеотидної послідовності pelX-гена. З метою визначення нуклеотидної послідовності клонованого гена, із вихідної конструкції pLC28Р було створено ряд субклонів. Для цього pLC28Р гідролізували відповідними рестриктазами, отримані фрагменти елюювали з агарозного гелю та клонували у вектори pUC19 та pUC28, які містять місця для зв’язування стандартних праймерів для секвенування. Було визначено нуклеотидну послідовність AgeI- EcoRV фрагмента pLC28P, що склала 2950 п. н. (рис.2). Аналіз послідовності виявив наявність відкритої рамки зчитування (ВРЗ), що починається ATG кодоном в позиції 609 та складає 2199 п. н. Аналіз кінцевої ділянки клонованого гена продемонстрував наявність GC- багатої паліндромної послідовності та полі-Т - ланцюг, який складається з 5 нуклеотидів (див. рис. 2). Ця структура може бути задіяна в термінації транскрипції pelX- гена.
1 ATCTTCATCGTCGCTGAAGAACGGCGCCGCCTGCTGCATGGCGTGGCCGGTACCAAGCTGTTCGGCCTGTAGGACCC
78 AGTTAAGATTGTCTTCGCGCAGCGTCTGGCGAAGCAGGTCGCCGCCGTGCCCGTACACCAGATGTACGGCGGATGCCC
156 CTAATTCTTTAGCCGCATCAATAACATGCTGCACCATCGGCTTTCCGGCCAGCGAATGCAACACCTTAGGAAGATCGG
234 AATACATGCGGGTACCTTTGCCTGCGGCAAGAATAACCACGCTCATCGGACTGTTTGACATACGCATCCTGACTGCTG
312 TTAGAACGAAAAGTAAAAGCCTTTCACGTTGAAATATCTACATATTTTTCATCATGAAACGAGACGAAGATAAAACGC
390 ACAAGCGTAACGCTATACACCATTTTAGGTGGGTATTTTTAGCCAGCGCAAACCCGTTTAGCGCAAAAAAAGCATTTT
468 AACGGGGAGGGATACCGGCTATCCCTCTGCTTTTGCTGTTTTTTTGATGGAAAAATAAAGAAAATCCATAAAGTAAAA
СИГНАЛЬНИЙ ПЕПТИД
MetProValAsnAsn
546 CGCGGTTTTAATATGCATTAATTGTGACGCAATAAATAGAAACACCATTTCATTTTCCTGATAATGCCGGTTAATAAT
AlaLeuProLeuGlnTyrProGlyGluLysAsnGluAsnLysIleProLeuAlaLeuThrLeuCysSerThrMetIle
624 TACCCAGGAGAAAAAAATGAAAACAAAATACCTTTGGCATTAACCCTTTGCAGTACGATGATCGCGCTACCGCTGCAG
SerAsnValLeuProAlaAsnGluGlyHisGlnTrpArgAlaIleAlaPheGlyGlnSerThrAspSerAsnPheSer
702 GCCAACGAAGGCCATCAGTGGCGGGCAATCGCCTTTGGGCAATCCACCGACAGTAACTTTTCCTCGAACGTGTTGCCG
AspLeuSerGlnProGluLysIleGlyValAsnAspValThrIleAlaGlyLysLysLeuThrProGlnAspSerAla
780 GAAAAAATTGGCGTCAATGATGTCACCATTGCCGGGAAAAAGCTGACGCCGCAGGATTCCGCCGATCTCAGCCAGCCC
ThrGluLeuProThrIleThrIleGluSerArgGlyGlyLysIleAlaAsnSerHisAspGlyLeuThrPhePheTyr
858 ATTACCATCGAGAGCCGGGGAGGTAAAATTGCCAACTCCCACGACGGACTGACCTTCTTTTACACCGAGCTGCCAACC
ArgProAlaAlaGlnAsnLysAsnPheIleLeuGlnAlaThrValThrValAsnGlnPheGlyProGluAsnGlyAla
936 AATAAGAATTTTATCCTGCAGGCTACGGTGACCGTCAATCAGTTTGGACCGGAAAATGGCGCGCGTCCGGCGGCGCAG
GlyTyrGluGluPheGluGlyAlaGlyLeuLeuValArgAspValIleGlyAsnProArgGlnGlnProLeuLysVal
1014 GAAGGCGCGGGACTGCTGGTCCGCGACGTCATTGGCAACCCGCGCCAACAGCCTCTCAAGGTCGGCTACGAAGAGTTC
IleLysLeuGlnAlaProAlaAlaSerAsnMetValMetAsnAlaIleMetThrGlnAspLysLysAspGlySerHis
1092 CCGGCGGCATCCAATATGGTGATGAACGCCATTATGACCCAGGATAAAAAAGATGGCTCGCATATCAAGCTGCAGGCT
TyrLysGluLysIleIleSerArgGluGlyIleThrGlnProTrpGlyAsnAlaGlyAlaAlaIleLysArgGlnSer
1170 ATTAGCCGGGAAGGGATAACCCAACCGTGGGGCAATGCGGGCGCTGCAATCAAGCGTCAAAGTTACAAAGAGAAAATC
AspIleGlnGlnThrProThrPheGlnLeuLysLeuGluArgThrAsnAspGlyPheIleThrSerTrpAlaAlaThr
1248 GATATCCAGCAAACCCCGACGTTTCAGCTTAAGCTGGAACGTACTAACGACGGATTTATTACCTCATGGGCGGCAACG
GlySerAsnGluTrpValSerGlnArgValProHisAlaAspLeuIleAlaGlnGlnAspLysGluHisTyrTyrVal
1326 GGCAGTAATGAATGGGTAAGCCAGCGGGTTCCTCACGCCGATCTGATTGCTCAGCAGGATAAAGAACATTACTACGTC
GlyPhePheAlaSerArgAsnAlaLysIleThrValSerAsnAlaSerLeuThrThrSerAlaAlaAsnThrValPro
1404 GGTTTCTTCGCCTCACGTAACGCCAAAATCACCGTCAGCAATGCTTCCCTGACGACCTCCGCGGCAAATACGGTTCCC
SerAlaProTyrValAlaLysSerTrpProProValMetGlnIleAlaSerGlyThrLysSerGlnSerLysGluTyr
1482 TCCGCCCCGTATGTTGCCAAAAGCTGGCCGCCGGTCATGCAAATTGCCTCGGGGACAAAAAGCCAGAGCAAAGAGTAT
| 
