|
Національна Академія Наук України
Iнститут фізіології ім. О. О. Богомольця
-----------------------------
Філіпов Віталій Михайлович
УДК 612.822:577.3
К+-активована Na+-керована калієва провідність у мембрані пірамідних нейронів мозку щура
03.00.02 - біофізика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран
Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук
Кришталь Олег Олександрович
зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи Веселовський Микола Сергійович (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України)
Кандидат біологічних наук, зав. відділом нейрохімії Гіммельрейх Ніна Германівна (Інститут біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України)
Провідна установа: Національний Університет ім. Т. Г. Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ
Захист відбудеться " 22 " червня 1999 р. о " 14-00 " годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця 4.
Автореферат розісланий " 21 " травня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Збудження щільно спакованих центральних нейронів супроводжується значним збільшенням зовнішньоклітинної концентрації калію. Підвищення зовнішньоклітинної концентрації K+ в межах фізіологічного діапазону від 2 - 4 мМ (Sykova, 1983; Croning et al., 1995) до 5 - 9 мМ викликає мембранну деполяризацію (Traynelis & Dingledine, 1988), збільшує амплітуду EPSP і популяційних потенціалів дії (Hablitz & Lundervold, 1981), сприяє поширенню збудження у відповідь на електростимуляцію (Somjen & Giacchino, 1985; Ludvig et al., 1996). При патологіях в центральній нервовій системі концентрація калію досягає значно вищих значень. Артеріальна гіпоксія може викликати підвищення концентрації калію до рівня 15 мМ і вище (Kirshner et al., 1975). Відзначені випадки гіпоксії мозку, при яких концентрація зовнішньоклітинного калію збільшується більш різко, і може досягати рівнів, що перевищують 50 мМ (Hansen, 1985). Підвищення концентрації калію може мати різне функціональне значення в залежності від того, яким чином мембранні механізми, що підтримують потенціал спокою, реагують на зміни градієнта цих іонів. Провідність деяких K+ каналів регулюється неорганічними іонами. Кальцій-активовані калієві канали IK(Ca) (Brown & Griffith, 1983) та IAHP (Alger & Nicoll, 1980) активуються внутрішньоклітинним Ca2+, в той час як IK(Na) (Kameyama et al,. 1984) активується змінами у внутрішньоклітинній концентрації іонів Na+. Існують також дані про здатність проникаючих іонів модулювати кінетику K+ каналів та їх провідність (Hoshi et al., 1990; Dale, 1993), добре описана роль внутрішньоклітинної концентрації натрію в регуляції провідності калиєвих каналів із внутрішнім випрямленням (Harvey & Ten Eick, 1989). Нами виявлений механізм калієвої провідності, який безпосередньо керується іонами K+ і Na+. Цей механізм контролює значну частину мембранної провідності пірамідних нейронів поблизу потенціалу спокою і може істотно впливати на реакцію щільно упакованих пірамідних нейронів у відповідь на зміни зовнішньоклітинної концентрації калію, викликані нейрональною активністю.
Мета дослідження. Метою роботи було детальне дослідження властивостей K+- активованого струму плазматичної мембрани пірамідних нейронів мозку щурів, вивчення його основних електрофізіологічних і фармакологічних характеристик, а також з'ясування механізмів регуляції цієї провідності іонами K+ і Na+.
Завдання дослідження. Використовуючи метод внутрішньоклітинної перфузії в конфігурації "ціла клітина" в комбінації з технікою імпульсної зміни розчину, кінетично розділити K+- активований струм на окремі компоненти. Провести фармакологічний аналіз K+ - активованого струму з метою порівняння основних типів потенціалкерованих K+ каналів з каналами, що лежать в основі K+ - активованої провідності пірамідних нейронів гіпокампа.
З'ясувати особливості потенціалзалежності K+- активованого струму і встановити його іонну природу. Вивчити роль зовнішньоклітинного Na+ в управлінні провідністю, що активується калієм.
Дослідити температурну залежність кінетики активації IΔK.
Проаналізувати можливе значення IΔK в формуванні реакції пірамідних нейронів у відповідь на стрибкоподібні зміни зовнішньоклітинного калію, викликані активністю сусідніх нейронів.
Наукова новизна роботи. Виявлений раніше невідомий механізм калієвої провідності, який безпосередньо активується іонами K+, а керується іонами K+ і Na+. Цей механізм властивий пірамідним нейронам гіпокампа і кори, однак практично відсутній в нейронах задніх корінців спинного мозку та нейронах мозочка. Отримані в роботі результати дозволяють зробити припущення, що іони натрію і калію грають роль специфічних регуляторів, відповідальних за стан більшої частини провідності спокою пірамідних нейронів.
Ці дані значно доповнюють уявлення, що існували раніше, про калієвий струм "витоку", або струм спокою (Storm, 1990). Використана в роботі техніка зміни розчину за допомогою п’єзокристала, що є на даний момент найбільш швидкою серед методів вивчення реакцій агоніст-рецептор в нерівноважних умовах, дозволила кінетично розділити провідність, що активується миттєво і являє собою "звичайний" витік і провідність, що лежить в основі активації IΔK. Проведений фармакологічний аналіз IΔK. За допомогою сучасних електрофізіологічних методів вивчений вплив зовнішньоклітинного Na+ на IΔK, досліджена потенціалзалежність нового струму, встановлена його іонна природа.
Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати дозволяють істотно розширити уявлення про реакцію пірамідних нейронів на різкі зміни зовнішньоклітинної концентрації калію в ЦНС щурів. Нові дані з цього питання є важливими для формування більш повного уявлення про фізіологічну роль зовнішньоклітинного калію в регуляції функцій нервової системи, таких як нейрональне збудження і міжклітинні взаємодії, а також в функціонуванні гліальних клітин.
Повільне зв’язування натрію з мембранними структурами, що спостерігається в умовах прямої реєстрації і слідові ефекти після його видалення дозволяють розширити сучасні уявлення про процеси, що відбуваються в структурі каналу.
Дослідження впливу блокаторів потенціалкерованих К+ каналів на К+- активований калієвий струм може послужити початком пошуку нових шляхів фармакологічного впливу на нейрональні механізми, пов'язані з калієвою активністю, такі як епілепсія та ішемія.
Особистий внесок. Автором особисто були виконані всі електрофізіологічні експерименти. У розробці концепції досліджень активну участь приймали співавтори друкованих робіт.
Апробація роботи. Основні положення роботи були докладені і обговорені на: 2-ом щорічному з'їзді Європейського Нейронаукового Товариства (1996, Страсбург, Франція); 26-ому щорічному з'їзді Нейронаукового Товариства (1996, Вашингтон, США); 4-ому міжнародному фармакологічному конгресі "Калієві Канали", (1996, Вашингтон, США); 5-ому щорічному з'їзді Ізраїльського Нейронаукового Товариства (1996, Ейлат, Ізраїль); 1-ому германо-українському симпозіумі “Potassium Channels Gene Expression“ (Київ, 1997); 27-ому щорічному з'їзді Нейронаукового Товариства (1997, Новий Орлеан, США); Конгресі Фізіологічного Товариства Великобританії (1998, Саутгемптон, Великобританія).
Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті та тези шести доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел зі 234 найменувань. Робота викладена на 121 сторінці та ілюстрована 23 рисунками.
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єкт досліджень. Дослідження проводилися на ізольованих нейронах гіпокампа, кори, нейронах задніх корінців спинного мозку та нейронах Пуркін’є мозочка щурів.
Свіжодисоційовані нейрони гіпокампа одержували за допомогою прийомів, подібних описаним раніше (Kiskin et al., 1990). 12 – 14-денних щурів лінії Вістар швидко декапітували без застосування анестезії. Із маси мозку виділяли гіпокамп, який різали на зрізи завтовшки 300-500 мкм в розчині, який містив в собі (в мМ на 1 л): NaCl – 150; КСl – 5; NаН2РО4 – 1.25; СаС12 – 2; MgС12 – 2; NaНСО3 – 26; глюкозу – 20. Преінкубація зрізів у такому розчині тривала 30 хв при кімнатній температурі. Ензиматична обробка проводилася в подібному розчині, але зі зниженою до 0.5 мМ концентрацією Са2+ та доданням 0.5 протеази з Aspergillus oryzae (“Sigma”, США). Інкубація в розчині з ферментом тривала 30 – 40 хв при 32 оC. Потім зрізи переносили до розчину без ферменту та з нормальною концентрацією Са2+; протягом 6 – 8 год вони слугували джерелом ізольованих нейронів. У процесі ізоляції та наступної інкубації розчини постійно насичувалися сумішшю 95 % О2 та 5 % СО2, що забезпечувало підтримання рН на рівні 7.4. Для дисоціації клітин зріз переносили в розчин, який містив у собі (в мілімолях на 1 л): NаС1 – 150; КС1 – 5; СаС12 – 2; МgС12 – 2; НЕРЕS – 10; рН доводився до 7.4 доданням NаОН. Поодинокі пірамідні кітини ізолювалися із зон СА1 і САЗ. Після ізоляції такі клітини могли бути використані для відведення протягом 2 – 4 год. При ізолюванні нейронів кори процедури виділення клітин і розчини для обробки були ті ж. Нейрони задніх корінців спинного мозку ізолювали по методиці, подібній описаним раніше (Krishtal et al. 1988). Нейрони Пуркін’є мозочка ізолювали за методикою, подібною описаній раніше (Panchenko et al., 1993).
Прикладання фармакологічно активних речовин. Зміна розчинів та аплікація фармакологічних агентів виконувалися за допомогою методики швидкої фіксації концентрації з використанням швидкісної мікроперфузійної системи. Остання базувалася на позиціонуванні ламінарних струмів розчинів за допомогою п'єзоелектричного керуючого пристрою (Franke et al., 1987; Colquhoun et al., 1992). Двоствольні піпетки для аплікацій вироблялися з трубочок θ-скла із зовнішнім діаметром 2 мм (“Clark Electromedical Instruments”, Велика Британія); після витягування діаметр кінчика становив близько 150 мкм. Піпетка для аплікацій приєднувалася до п'єзоелектричного перемикача (Р810-30, “Physik Instrumente”, ФРН). Зовнішні розчини постачалися в кожний з двох стволів піпетки за допомогою контрольованого комп'ютером ротаційного пристрою з п'єзоперемиканням (“Лілея”, Україна), який мав 16 резервуарів. Один канал використовували для прикладання тест-розчину, а другий – для прикладання індиферентного розчину. Надходження кожного з розчинів керувалося за допомогоiо індивідуального клапана і також контролювалося комп'ютером. Крім того, вся камера постійно перфузувалася контрольним розчином для того, щоб запобігти накопиченню фармакологічних
Рис. 1. Принцип дії швидкісної мікроперфузійної системи аплікації зовнішньоклітинних розчинів. Один отвір θ-капіляра використовували для прикладання тест-розчину, а другий – для прикладання індиферентного розчину. Петч-піпетка з клітиною знаходилася в контрольному розчині в безпосередній близькості від границі змішування розчинів. Камера постійно перфузувалася контрольним розчином для запобігання накопиченню фармакологічних агентiв. Аплікація здійснювалася при швидкому зсуві межі між розчинами відносно петч-піпетки під дією п'єзоелектричного керуючого пристрою.
агентiв. Кінчик петч-піпетки розташовували безпосередньо біля межі, де стикались два розчини, що пропускались. Швидка зміна розчину досягалася переміщенням границі між розчинами відносно петч-піпетки в результаті прикладання поштовху напруги на п'єзоелектричний перемикач. Ця процедура дозволяла досягти повного обміну розчинів протягом 0.5 мс, що близько до оцінки мінімального можливого часу обміну (Maconochie & Knight, 1992). Швидкість та ефективність обміну розчинів тестувалися наприкінці експерименту за допомогою “здування” клiтини та вимірювання швидкості зміни рідинного контактного потенціалу з використанням розведеного в 10 разів контрольного розчину (Maconochie & Knight, 1992).
Електрофізіологічні вимірювання. Внутрішньоклітинні розчини містили в собі (в мМ на 1 л): розчин 1) КF – 100; трис-Сl – 30 (рН 7.3); розчин 2) КН2РО4 – 100; глюкоза – 0.25; МgСl2 – 0,2; НЕРЕS-трис – 20; ATP - 5; GTP - 0.5; (рН 7.3). Зовнішньоклітинні розчини містили в собі (в мМ на 1 л): 1) KCl - 20; NaCl, від 130 до 0; CaCl2 - 2.5; Tris-Cl - 20 (pH 7.3); 2) KCl, від 0 до 80; NaCl - 70; CaCl2 - 2.5; Tris-Cl - 20. Зміни в концентрації KCl і NaCl завжди компенсувалися еквімолярною заміною на холін-хлорид.
Струми реєструвалися за допомогою стандартної методики петч-клемп у конфігурації “ціла клітина”. У роботі використовувався підсилювач для петч-клемп виробництва “List Electronics” (ФРН). Петч-мікропіпетки з м'якого скла мали опір від 0.5 до 2.0 МОм. Командні зрушення потенціалу коригувалися з урахуванням рідинного контактного потенціалу між внутрішнім та омиваючим розчинами. Відведені струми фільтрувались (частота зрізу 3 кГц), оцифровувались з інтервалом дискретизації 200 мкс, накопичувались та аналізувалися за допомогою комп'ютера з використанням програмного забезпечення Оrigin (“МісrоСа1”, США). Якщо не зазначено інше, експерименти виконувалися при кімнатній температурі (19 – 24 оС).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Пірамідні нейрони реагують на стрибкоподібну зміну зовнішньоклітинного K+ повільним вхідним струмом. Реакція нейрона Пуркін’є на зсув зовнішньоклітинної концентрації калію від 0 мМ до 20 мМ [K+]out продемонстрована на рис. 2A. Подібні відповіді спостерігалися у всіх досліджених Пуркін’є нейронах
Рис. 2. Реакція нейронів різних типів на стрибкоподібне збільшення зовнішньоклітинного калію. А. Нейрон Пуркін’є знаходився в безкалієвому зовнішньому розчині і потім швидко переносився в розчин з 20 мМ KCl. Калій прикладали при різних значеннях підтримованого потенціалу, від -40 мВ до -100 мВ з 10 мВ інтервалами, що викликало "прямокутний" вхідний струм. Б. Приклад експериментальних кривих, отриманих в подібному експерименті на нейроні DRG. В, Г. Аналогічні експерименти були проведені з гіпокампальними (В) і кортікальними (Г) нейронами. Швидке збільшення зовнішньоклітинного калію викликало двофазний вхідний струм з додатковою уповільненою компонентою, що залежала від потенціалу. Постійна часу, отримана при VH = -100 мВ в (В), дорівнювала 34 мс.
(n = 8) і в периферійних нейронах (n = 10) ізольованих з DRG (рис. 2Б). Такий квазі-миттєвий розвиток вхідного струму відповідає класичній зміні "витоку" (Halliwell & Adams, 1982; Brown, et al. 1990) у відповідь на швидкі зміни у зовнішньоклітинній концентрації калію. Швидкість зміни зовнішньоклітинної концентрації K+ не дозволяє визначити часовий хід цього процесу. Якісно інша реакція спостерігалася в гіпокампальних (рис. 2В) або кортикальних (рис. 2Г) пірамідних нейронах. Стрибкоподібна зміна [K+]out веде до появи вхідного струму, що повільно активується, виявляє потенціал-залежність і зникає з деполяризацією. Цей струм, позначений нижче як IΔK, далі вивчався на пірамідних нейронах гіпокампа щурів. Як показано в Рис. 2В, реакція нейрона на концентраційний калієвий імпульс при підтримуваному потенціалі VH = -40 мВ уявляє собою вхідний струм, що миттєво активується. Час, протягом якого струм, що вимірюється при цьому потенціалі, досягає стаціонарного рівня, був прийнятий як верхня оцінка часу встановлення нової концентрації K+.
Залежність струму, що активується калієм, від зовнішньоклітинної концентрації калію. Амплітуда IΔK залежить від зовнішньоклітинної концентрації калію, в той час як кінетика ні (рис. 3A). Рис. 3Б демонструє експеримент, в якому IΔK активувався двома способами: спочатку, зсувом від 0 до 20 мМ [K+]out і потім від
Рис. 3. Вплив зовнішньо-клітинної концентрації калію на струм, що активується калієм. А. Криві струмів, викликаних у відповідь на концентраційний стрибок від 0 мМ [K+]out до різних значень концентрації K+out. Миттєвий вхідний струм супро-водиться повільною релаксацією, амплітуда якої монотонно збіль-шується із зростанням концен-трації K+out, в той час як кінетика не залежить від [K+]out. Б. Внесок повільної компоненти в загальний мембранный струм меншає із збільшенням початкової концентрації K+out. VH = -100 мВ.
4 мМ до того ж самого рівня 20 мМ. Відповідь на концентраційну сходинку 4-20 мМ відрізняється від 0-20 мМ по амплітуді "миттєвого" зсуву, який супроводиться тією ж самої незалежною від концентрації кінетикою. Очевидно, початковий миттєвий струм відображає частину каналів, активованих попередньою концентрацією К+out і дозволяє визначити криву активації IΔK. У експерименті, що демонструється на рис.4
Рис. 4. Крива активації IΔK. A. Релаксації струмів у відповідь на швидку зміну розчинів отримані додатком 80 мМ [K+]out на фоні різних початкових концентрацій зовнішньоклітинного калію. VH = -120 мВ. Схема вимірювань зображена на вставці. Струм досягав сталого значення в [K+]out = X мМ і потім амплітуда, що залежить від часу, вимірювалася після стрибкоподібного зсуву до 80 мМ [K+]out. Максимальний IΔK був визначений як повільний струм, активований зсувом в концентрації калію від 0 до 80 мМ. Б. Стаціонарна активація IΔK зовнішньоклітинним калієм.
струм досягав стаціонарного рівня при різних значеннях початкової концентрації K+out і потім вимірювалася амплітуда IΔK після зсуву до однієї і тієї ж високої концентрації поблизу насичення активації IΔK, а саме 80 мМ. Експериментальні дані були наближені рівнянням: I / Imax = 1 / {1 + ([K+]out / IC50) p} зі значеннями IC50 = 2.34 ± 0.31 мМ для константи напівактивації зовнішньоклітинним калієм і p = 0.76 ± 0.07 (рис. 4Б; n = 5).
Потенціалзалежність IΔK. Потенціалзалежність IΔK продемонстрована на Рис. 5. Повільний вхідний струм не реверсував при потенціалах більш позитивних, ніж рівноважний потенціал для іонів калію, EK. Цей факт ілюструється на Рис. 5Б: для зовнішньоклітинної концентрації калію [K+]out = 20 мМ калієвий рівноважний потенціал, передбачений з рівняння Нернста був рівний -40.5 мВ ([K+]out / [K+]in =
Рис. 5. Потенціал-залежність IΔK. A. Прикладання високої кон-центрації калію при різних VH від -20 мВ до -120 мВ з 20 мВ інтервалами. IΔK спостерігаєтся тільки при потенціалах більш негативних, ніж EK. Кінетика IΔK не залежить від потенціалу. Постійні часу дорівнюють 76.3 мс, 72.9 мс, 69.4 мс і 75.1 мс для потенціалів -120 мВ, -100 мВ, -80 мВ і -60 мВ відповідно. На нижній панелі представлені нормовані криві. Б. Вольт-амперна залежність IΔK, викли-каного стрибкоподібним збіль-шенням концентрації калію від 0 до 20 мМ (n) і до 80 мМ (l). В. Потенціал-залежність IΔK при двох різних значеннях [Na+]out: 40 мМ (n) і 130 мМ (l). Осмолярність підтримувалася заміною хлориду натрію на холін хлорід.
= 20 / 100), в той час як для [K+]out = 80 мМ ця величина була рівна -5.6 мВ. Значення потенціалу, при якому повільна компонента калій-активованого струму зникала, збігалося з потенціалом реверсії для іонів калію (n = 19) та у разі варіювання рівня зовнішньоклітинного калію зміщувалось відповідно до змін EK, як мало бути у випадку типового струму внутрішнього випрямлення (Jan & Jan 1997; Sakmann & Trube, 1984). Рисунок 5В також демонструє, що амплітуда IΔK збільшувалася із збільшенням зовнішньоклітинної концентрації Na+. Однак це збільшення амплітуди не супроводилося зсувом потенціалу, при якому IΔK зникав.
Участь зовнішньоклітинного Na+ в управлінні провідністю, що активується калієм. IΔK активується тільки в присутності Na+ у зовнішньому розчині. Рисунок 6A демонструє, що заміна зовнішньоклітинного Na+ на холін хлорид або Li+ веде до зникнення повільної кінетики. Струм у відповідь на збільшення зовнішньоклітинної концентрації калію, що вимірювався в натрієвому зовнішньоклітинному розчині, був більшим ніж струм що вимірювався в холін хлориді, але меньшим, ніж в літієвому зовнішньоклітинному розчині. Додаток зовнішньоклітинного K+ на фоні збільшення концентрацій зовнішньоклітинного Na+ демонструє Na+-залежну появу повільної кінетики (рис. 6Б), в той час як загальна амплітуда струму, що активується калієм, тільки трохи збільшується із збільшенням [Na+]out. Часовий хід активації IΔK виявляв моноекспоненціальну залежність від [Na+]out: константа часу збільшувалася із збільшенням [Na+]out. Крива доза-відповідь з IC50 = 29.74 ± 3.37 мМ і p = 1.69 ± 0.29 показана на Рис. 6В (n = 11, A1 = 0.16 и A2 = 1).
Рис. 6. IΔK активується тільки в присутності Na+ у зовнішньому розчині. А. Заміна Na+out на холін хлорид або Li+ приводила до повного зникнення IΔK. VH = -120 мВ. Б. IΔK вимірювався на фоні різних концентрацій зовнішньо-клітинного Na+.. Кінетика активації IΔK залежить від концентрації зовнішньоклітинного натрію: постійні часу дорівнюють 36.3 мс, 62.2 мс, 96.7 мс і 106.5 мс для [Na+]out = 10 мМ, 20 мМ, 80 мМ і 130 мМ відповідно. Нормовані криві представлені на нижній панелі В. Доза-залежність для IΔK від зовнішньоклітинної кон-центрації Na+.
Особливості впливу іонів натрію на механізм активації IΔК. Таким чином, зовнішньоклітинний Na+ грає подвійну роль в реакції пірамідних нейронів до підвищення зовнішньоклітинної концентрації K+: іони натрію забезпечують повільну активацію струму і роблять внесок в стаціонарну амплітуду току.
Наступний експеримент був проведений для того, щоб детальніше пояснити ці особливості впливу іонів натрію на механізм активації IΔК (рис. 7). Стрибок зовнішньоклітинної концентрації калію був зроблений в розчині, що містить 0 мМ [Na+]out, а потім Na+out прикладали у моменти, відповідні різним періодам розвитку IΔK. Результати таких експериментів, зроблених при потенціалі VH = -120 мВ (нижня пара накладених кривих) вказують на те, що у відсутності іонів Na+ вся провідність, що бере участь в повільній активації IΔK повністю активована або активація зовнішньоклітинним K+ відбувається з дуже швидкою кінетикою. Аналогічні вимірювання, проведені при різних значеннях потенціалу (показані тільки -40 мВ і -20 мВ), також продемонстрували, що потенціал реверсії для струму, що викликаний аплікацією [Na+]out відповідає значенню калієвого рівноважного потенціалу EK = -40.5 мВ ([K+]in / [K+]out = 100 / 20), що можна було б пояснити регулюючою роллю іонів Na+ у зовнішньоклітинній середі в механізмі провідності, що активується зовнішньоклітинним K+.
Рисунок 8A пояснює додаткові особливості ролі іонів натрію. Na+out був видалений на різних стадіях розвитку IΔK при різних значеннях підтримованого потенціалу. Зміни в амплітуді струму, що активується калієм, викликані видаленням зовнішньоклітинного натрію реверсують близько до EK = -17.5 мВ ([K+]in / [K+]out = 100 / 50). Як показано для порівняння на Рис. 8Б, відповіді, викликані видаленням зовнішньоклітинного натрію в розчині, що містить 0 мМ [K+]out значно менші. Ці дані ще раз показують, що участь Na+out в IΔK як носія заряду незначна: швидше іони натрію регулюють відповідну K+ провідність, оскільки реверсія струму у відповідь на видалення/додання Na+out зсувається відповідно до рівняння Нернста для іонів калію (див. Рис. 7 і 8A). Цей висновок добре узгоджується з даними, що демонструються на Рис. 5В.
Рис. 7. Для активації IΔK зовнішньоклітинний натрій повинен бути прикладений до аплікації калію. Верхня панель являє собою загальний концентраційний протокол для [K+]out і два різних протоколи для [Na+]out. Контрольний IΔK (протокол 1, тонкі лінії) був отриманий при постійній концентрації [Na+]out = 130 мМ. Протокол 2 (жирні лінії) ілюструє результат додатку Na+ на різних стадіях розвитку IΔK. Повільна кінетика IΔK, зареєстрована при потенціалі -120 мВ в натрії, приведена на фоні прямокутної відповіді, отриманої в розчині, що містить 0 мМ [Na+]out. Подальші короткі аплікації [Na+]out вмить досягають стаціонарної амплітуди струму. Імпульси натрію в протоколі 2 мають тривалість 30 мс. Зміни в концентрації Na+out компенсувалися еквімолярною заміною на холін хлорид. Аналогічні вимірювання були також зроблені при потенціалах VH = -40 мВ і -20 мВ.
Кінетика IΔK відображає слідові процеси, пов'язані з доданням / видаленням Na+ у зовнішньоклітинній середі. Інша важлива особливість, представлена на Рис. 8A: коли Na+out видалений з зовнішньоклітинної середи, IΔK не переходить в стан, що активується миттєво - він продовжує повільний розвиток, хоч кінетика стає швидшою. Цей факт детально демонструється на Рис. 8В: Na+out видалений через 15
Рис. 8. Вивчення ролі Na+ в управлінні провідністю IΔK. A. Na+out в значно більшій мірі регулює K+-активовану K+ провідність, ніж бере участь в мембранній провідності як носій заряду. Швидкі видалення Na+ були зроблені на різних стадіях розвитку IΔK. Стрілка вказує на контрольний струм, викликаний 0 - 50 мМ зсувом в [K+]out , [Na+]out = 70 мМ, VH = -120 мВ. Б. Відповіді, викликані видаленням зовнішньоклітинного натрію, в розчині з 0 мМ [K+]out порівняно малі. (А), (Б) - один і той самий нейрон. В. Повільна кінетика IΔK стає швидкою, але не "миттєвою" після швидкого видалення Na+out.
мс після початку аплікації високої концентрації K+out і IΔK продовжує розвиток з τ = 25.5 мс, в той час як в контролі τ = 65.6 мс. Оскільки в 0 мМ [Na+]out IΔK розвивається швидше, то наступне за видаленням додання Na+ приводить до перескоку контрольного значення IΔK, як видно з порівняння з контролем. Примітне те, що IΔK починає слідувати контрольній кінетиці через декілька мілісекунд після того, як Na+out знову доданий у зовнішньоклітинну середу.
Загалом, Рисунок 8 показує, що воротний механізм, лежачий в основі активації IΔK вимагає деякого часу для досягнення стаціонарного стану в безнатрієвому середовищі.
Щоб оцінити, як швидко IΔK "забуває" Na+out, були проведені експерименти (рис. 9), в яких IΔK активувався в безнатрієвому розчині з регульованою затримкою після видалення Na+out. "Проміжна" частина кінетики зникає протягом 200 мс (τ = 46.3 мс,
Рис. 9. Механізм провідності, що лежить в основі IΔK повільно "забуває" зовнішньоклітинний Na+. А. Верхня панель - протокол експеримента і сімейство кривих. Аплікація [K+]out проводилася після різних експозицій в розчині з 0 мМ [Na+]out (TNa+=0). Це приводило до виникнення струму, який був більш швидким, ніж контрольний IΔK, (аналогічний струм приведений на Рис. 8В, порів. (1) і (2)). Збільшений фрагмент приведений на середній панелі. Амплітуда струму оцінювалася в момент встановлення концентрації K+out при потенціалі, на якому повільна кінетика була відсутньою (-20 мВ, нижня панель). Б. Залежність амплітуди від TNa+=0 найкращим чином апроксімувалась експоненціальною функцією. В. Одночасна аплікація натрію і калію не приводить до повільної кінетики IΔK. Мембрана повинна вступити в контакт з Na+out принаймні за 200 мс до аплікації калію, щоб досягнути стаціонарних умов.
рис. 9Б). Незначна залишкова компонента "проміжної" кінетики зберігається навіть при нескінченному значенні TNa+=0 = 0 і може бути видалена деполяризацією (рис. 9A, нижня панель; див. також рис. 6В, доза-відповідь для [Na+]out). При одночасному додатку натрію і калію, Na+out не спроможний сповільнити кінетику активації IΔK. Мембрана повинна вступити в контакт з Na+out принаймні за 200 мс до аплікації калію, щоб досягнути стаціонарних умов (рис. 9В).
Кінетика активації IΔK продемонструвала дуже високу температурну залежність, як показано для конкретного нейрона на Рисунку 10 A-В. Значення Q10 рівне 7.31 ± 0.75 (n = 8) було отримано для постійної часу активації, в той час як значення Q10 = 1.28 ± 0.06 (n = 4) було отримано для амплітуди струму.
Рис. 10. Температурна залежність кінетики активації IΔK. А. Сімейство струмів було отримане на одній і тій же клітині при температурах, що змінюються в діапазоні від 10 до 23OC. Б. Значення Q10 рівне 7.94 було отримане для постійної часу активації у разі конкретного нейрона. Середнє значення Q10 для всіх даних - 7.31 ± 0.75 (n = 8). В. Значення Q10 рівне 1.32 було отримане для амплітуди IΔK на тому ж самому нейроні що в (А) і (Б). Середнє значення Q10 для амплітуди - 1.28 ± 0.06 (n = 4).
Фармакологічні властивості IΔK. З метою порівняння IΔK з відомими калієвими струмами, фармакологічні властивості калій-активованого вхідного струму вивчалися при підтримуваному потенціалі -100 мВ. IΔK повністю блокувався зовнішньоклітинним Ba2+ (5 мМ) (рис. 11Б) або TEA (10 мМ) (рис. 11В) але продемонстрував низьку чутливисть до зовнішньоклітинного Cs+ (1 мМ) (рис. 11А), специфічного блокатора вхідного струму, що залежить від часу - Ih, який є активним в тому ж самому діапазоні потенціалів (Mayer & Westbrook, 1983; Maccaferry et al.,
Рис. 11. Дія Cs+ і Ba2+ на калій-активований вхідний струм. А. Струми, викликані ступінчастими змінами зовнішньої концентрації К+ у контролі та у присутньості 1мМ Cs+ та 1 мМ Ba2+. Б. Доза-залежність блокуючуї дії зовнішньоклітиного Ba2+ на калій-активований вхідний струм. В. Струми, викликані ступінчастими змінами зовнішньої концентрації К+ від 0 мМ до 20 мМ у контрольному розчині та у присутньості 1 та 10 мМ зовнішньоклітинного ТЕА.
1993). IC50 для блокуючуї дії зовнішньоклітиного Ba2+ складала 480 μM ± 90 мM (n = 3) (рис. 11Б). Заміна K+ на Cs+ в еквимолярных концентраціях у внутрішньоклітинному розчині не вносила ніяких змін в амплітуду IΔK. Також калій-активований вхідний струм не блокувався 4-амінопірідіном (4 - AP) в концентрації 1 мМ, відомим блокатором K+ каналів, що селективно блокує ID (Storm, 1993; Crepel et al., 1993) і IA (Numann et al., 1987; Rudy, 1988). IΔK відрізнявся по фармакологічних властивостях від IM, повільного струму, що не інактивується (Brown & Adams, 1980; Storm, 1993) і був нечутливий до агоністу мускариновых рецепторів - карбахолу (50 мM). IΔK був також нечутливий до 1 μМ тетродотоксину (TTX) і до 1 мМ уабаіну, специфічного блокатора N+/K+-ATPази. Зміни у концентраціі зовнішньоклітинного Mg2+ з 0 мМ до 2.5 мМ не відбивалися на IΔK. Додання ATP у внутрішньоклітинний розчин не впливало помітним чином на поведінку IΔK. Повільний струм, що активується калієм, практично не виявляв run-down в ході 1-2 годинних експериментів. IΔK був нечутливий до 1 мМ зовнішньоклітинного Cd2+. Підвищення зовнішньоклітинного Ca2+ з 2.5 мМ до 10 мМ не впливало на IΔK.
Обговорення результатів досліджень
Переважання K+ провідності в формуванні потенціалу спокою нейронної мембрани здебільшого відбувається завдяки існуванню пасивних каналів “витоку" (Halliwell & Adams, 1982; Brown et al., 1990), хоч число виявлених механізмів провідності, відповідальних за поведінку клітин в підпороговому діапазоні мембранних потенціалів постійно збільшується, особливо у разі центральних нейронів. Ці нейрони відрізняються надзвичайно щільним спакуванням. Всі зміни в трансмембранних іонних градієнтах, викликані нейрональною активністю приводять до вивільнення іонів калію з внутрішньоклітинного простору і його акумулювання в надто вузькому зовнішньоклітинному просторі (Sykova, 1983). Накопичення калію може бути істотним чинником в регуляції функцій нервової системи, таких як нейрональне збудження і міжклітинні взаємодії, а також в функціонуванні гліальних клітин. Таким чином, не було великою несподіванкою виявити, що значна частина провідності спокою пірамідних нейронів, розташованих в найбільш щільно упакованих нейрональних структурах забезпечується системою, що керується основними проникаючими іонами і напруженням.
Досліди по вивченню гетерогенности потенціалів спокою астроцитів в зрізах гипокампа показали залежність експресії каналів внутрішнього і зовнішнього випрямлення від характеру калієвої активності в різних локальних зонах (Roy et al., 1996; Janigro et al., 1997). Можна передбачити, що клітини щільно спакованих нейрональних структур, що зазнають високих стрибків калію, характеризуються селективною експресією каналів, лежачих в основі активації IΔK. Підтвердженням цієї гіпотези може служити той факт, що реакція нейронів Пуркін’є і периферійних нейронів, ізольованих з задніх корінців спинного мозку, на зсув зовнішньоклітинної концентрації калію (рис. 2 А,Б) якісно відрізняється від реакції, що спостерігається в гипокампальних (рис. 2 В) або кортікальних (рис. 2 Г) пірамідних нейронах.
Отримані в роботі результати дозволяють зробити припущення, що іони натрію і калію грають роль лігандів для специфічних дільниць з’вязування, відповідальних за стабілізацію значної частини провідності спокою пірамідних нейронів. Виходячи з коефіцієнта Хилла, для відкриття каналів, лежачих в основі активації IΔK, необхідний один іон K+ (рис. 4Б), в той час як два іони Na+ необхідні для того, щоб забезпечити достатню затримку активації цих каналів (Рис. 6В). Незалежність кінетики активації IΔK від концентрації калію вказує на те, що з’вязування лиганда не є стадією, що визначає швидкість процесу. Крім коефіцієнта Хіла, існують і інші факти, вказуючі на не однозначну роль іонів натрію в регуляціі провідності, що активується калієм. Швидке видалення зовнішньоклітинного Na+ з поверхні мембрани приводить до миттєвого переходу кінетики IΔK від повільної до проміжної (Рис. 8). Аналізуючи результати дослідів по видаленню/доданню зовнішньоклітинного натрію можна зробити мінімальне припущення про те, що один іон Na+ зв'язується з дільницями швидкої трансформації каналу, в той час як інший забезпечує повільні конформаційні зміни, що відбиваються в повільній кінетиці активації IΔК. Не можна також виключати можливість того, що повільне скріплення натрію з мембранними структурами (рис. 9А, Б) і слідові ефекти, що спостерігаються після його видалення (рис. 9В) відображають trapping-untrapping, процес так званого "прилипання - відклеювання" іонів, що відбувається в структурі каналу. Ця гіпотеза, очевидно, пояснює “ідеальні" випрямляючі властивості калій-активованого струму, що не реверсує з деполяризацєю.
Як було показано вище, механізм, лежачий в основі активації IΔK демонструє особливості специфічного іонного обмінника, здатного не тільки розрізнювати Na+ і K+, але також Na+ і Li+ (рис. 6A). Якісна різниця між Na+ і Li+ в їх здатності модулювати K+ провідність була описана для TREK-1, нещодавно клонованого калієвого каналу (Fink et al., 1996). У той самий час канали, що безпосередньо активуються у відповідь на додаток зовнішньоклітинного калію, мають характерну фармакологію, властиву K+ каналами, чутливими до блокуючої дії TEA і барію. У даний момент важко сказати, чи пов'язаний IΔK с Ih - струмом, що активується гіперполяризацією. Дія Cs+ та Ba2+ (рис. 11) вказує, що фармакологічні властивості IΔK та Ih дещо відрізняються, але для остаточного висновку необхідні більш специфічні блокатори.
Надзвичайно висока температурна залежність кінетики (Рис. 10 A-В), ймовірно, може поясняться тим, що в основі активації IΔK лежить ряд паралельних конформаційних змін. Нещодавні роботи на гіпокампі (Illievich et al., 1994) показали залежність вивільнення глутамату внаслідок ішемії від температури. Деякі дані дозволяють передбачити залучення IΔK до термочутливого механізму вивільнення збудливих амінокислот. Зокрема, температурна залежність калій-активованого ([K+]out = 60 мМ) вивільнення глутамата мала значення Q10 = 5.54 в діапазонах температур 40 - 34 оC (Dirig et al., 1997).
У гіпокампі короткочасні зміни [K+]о, викликані електричною стимуляцією коливалися від рівня 2.5 - 3.0 мМ до 12 мМ (Krnjevic et al., 1982). Підвищення концентрації калію в інтервалі 6.5 - 8.5 мМ здібно індукувати эпілєптоформну активність як in vivo (Zuckermann & Glaser, 1968) так і in vitro (Rutecki et al., 1985; Traynelis & Dingledine, 1988; Leschinger et al., 1993). Зовнішньоклітинна концентрація калію під час епілептиформних розрядів, що реєструється in vivo і при роботі на зрізах мозку часто перевищує 10 мМ, демонструючи максимальні значення в stratim piramidale (Fisher et al., 1976; Avoli et al., 1996). Отримана величина IC50 = 2.34 ± 0.31 мМ для константи половинної активації початковим зовнішньоклітинним калієм (рис. 4), що лежить в області фізіологічних концентрацій К+out, говорить про максимальну гнучкість механізму IΔK при відхиленні [K+]out від нормальних значень. У пірамідних нейронах CA1 зони гіпокампу в нормальному калій ([K+]о = 3.5 мМ) короткочасний деполяризаціний імпульс викликав генерацію одиночного потенціалу дії (Jensen et al., 1994). Підвищення зовнішньоклітинної концентрації калію до 7.5 мМ призводило до оборотного виникнення пачечної активності. Основною особливістю виявленого механізму є те, що повільна активація IΔK можлива тільки при мембранних потенціалах більш негативних, ніж значення EK. Така ситуація може виникати у разі нейрона, що покоїться, підданого хвилі K+, підвищеного внаслідок активності сусідніх нейронів. Калій, що короткочасно зріс, генерує вхідний струм, який прагне перезарядити місткість мембрани до більш деполяризованого значення потенціалу спокою. Уповільнений механізм активації провідності, що лежить в основі IΔK, зменшує цей внутрішній струм доти, поки мембранний потенціал більш негативний, ніж EK. Відповідно, утворюється негативний зворотний зв'язок і деполяризація, викликана підвищенням зовнішньоклітинного калію, сповільнюється. Екстраполяція отриманих даних для оцінки кінетики IΔK при 37 oC дає значення постійної часу для повільної активації між 3 і 5 мс - що порівнянно із часом розвитку популяційного спайка в stratum pyramidale у відповідь на стимуляцію stratum radiatim CA1 зони гіпокампу (Jensen et al., 1994; Jensen & Yaari, 1997; Poolos et al., 1987). Таким чином, виявлений механізм може грати важливу роль в запобіганні нейронів від спонтанного збудження, викликаного підвищенням зовнішньоклітинного калію. Запропонована функція IΔK може мати значення тільки в щільно упакованих нейронних матрицях, таких як гіпокамп або кортекс.
Як альтернатива, не можна виключати участь описаного механізму в іонообмінних процесах. Останнім часом з'явився цілий ряд робіт, присвячених ролі зовнішньоклітинного калію в довготривалій GABA-опосередкованої деполяризації, викликаній високочастотною стимуляцією пірамідних нейронів гіпокампа щура. Зокрема, було показано (Avoli et al., 1996; Kaila, et al., 1997; Lamsa & Kaila, 1997) що локальні гальмівні мережі гіпокампальних нейронів здатні генерувати калієвий транзієнт, що досягає 5 - 8 мМ [K+]out. У нещодавній роботі (D'Ambrosio et al., 1998) на гіпокампальних астроцитах - клітинах, що беруть участь в просторовому накопиченні [K+]out (Newman, 1995) була виявлена повільна провідність, що активується калієм, з низькою чутливістю до зовнішньоклітинного Cs+. Як в гіпокампі, так і в корі пірамідні нейрони включені в комплексну нейрональную мережу, регульовану багатостадійними процесами збудження та гальмування. Високочастотна стимуляція пірамідних нейронів гіпокампу в присутності антагоністів іонотропних глутаматних рецепторів викликає двохкомпонентний GABA-опосередкований постсинаптичний потенціал (Davies & Collingridge, 1993; Staley et al., 1992; Kaila et al., 1997). Ця відповідь складається з швидкого гиперполяризаційного гальмового постсинаптичного потенціалу і тривалого GABA-опосередкованого деполяризаційного постсинаптичного потенціалу. Таким чином, деполяризацію, що розглядалася раніше як пізня стадія постсинаптичного потенціалу, можна зв’язати зі стрибком [K+]o, що викликаний збудженням суміжних з пірамідними клітинами інтернейронів. Ці дані передбачають унікальну можливість: IΔK може бути залучений до формування реакції пірамідних нейронів у відповідь на стрибкоподібні зміни зовнішньоклітинного калію, що генеруються активністю сусідніх нейронів. Фізіологічна роль IΔK може бути в затримці K+- активованого падіння вхідного опору і, відповідно, шунтування пізнього постсинаптичного гальмування.
ВИсновкИ
1. При збудженні щільно спакованих центральних нейронів відбувається значне збільшення зовнішньоклітинної концентрації калію (від 2-4 мМ до 5-9 мМ). Широко розповсюджені патології центральної нервової системи супроводжуються ще більшими значеннями концентрацій калію (15 мМ і вище). У з’язку з цим, у данній работі досліджувалися відповіді ізольованих пірамідних нейронів на швидке підвищення концентрації іонів калію. Досліди проведені із застосуванням метода петч-кламп у конфігурації “від цілої клітини”. Удосконалення техніки імпульсної зміни розчину за допомогою методу перемикання потоків дало можливість розділити струм, що активується калієм на окремі компоненти та з великою точністю зареєструвати їх співвідношення.
2. Підвищення зовнішньоклітинної концентрації іонів К+ викликало двофазний вхідний струм при мембранних потенціалах, негативніших за потенціал реверсії для іонів K+. Цей струм складався зі струму витоку, що “вмить“ змінюється та уповільненого струму (IΔK) з τ = 40 - 50 мс при 21OC.
3. Спостережений уповільнений струм мав кінетику активації першого порядку з дуже високою температурною залежністю (Q10 = 7.31). Його кінетика не залежала від потенціалу і концентрації іонів K+. Амплітуда цього струму визначалася прикладеною концентрацією іонів K+ та збільшувалась за умов гіперполяризації.
4. Внесок повільної компоненти в загальний мембранний струм меншав із збільшенням початкової концентрації K+out. Відповідна концентрація половинної дії дорівнює 2.5 мМ для активації початковим зовнішньоклітинним калієм.
5. Потенціал-залежність IΔK, що вимірювалась при підтримуваних потенціалах -120 - -20 мВ, була подібною до потенціал-залежності К+ струмів із внутрішнім випрямленням.
6. Активація IΔK залежила від концентрації іонів Na+: заміна зовнішньоклітинного Na+ на холін хлорид або літій майже повністю усувала IΔK.
7. IΔK не спостерігався в нейронах задніх корінців спинного мозку та нейронах мозочка.
8. Сповільнюючи вхід К+ в клітину, IΔK може грати істотну роль в запобіганні щільно упакованих пірамідних нейронів гіпокампу та кори від спонтанного збудження внаслідок швидкого підвищення зовнішньоклітинної концентрації іонів К+.
Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації.
1. V. Filippov, V. Pinchenko, T. Volkova and O. Krishtal. Membrane responses to extracellular potassium in isolated pyramidal neurons // Neurophysiology. -1998. -V. 30, - N. 4/5. - P. 259-263.
2. V. Filippov, O. Krishtal. Pharmacological properties of potassium activated inward current in hippocampal pyramidal neurons // Neurophysiology. -1999. -V. 31, -N. 1. -P. 69-73.
3. V. Filippov, O. Krishtal. The mechanism gated by external K+ and Na+ controls the resting conductance in hippocampal and cortical neurones // Neuroscience. -1999. -V. 92, -N. 4. -P. 1231-1242.
Тези доповідей:
- O. Krishtal, V. Pinchenko, V. Filippov et.al. K+ activated, K+, Na+ - permeable inward rectifier in the hippocampal pyramidal neurones // Eur. J. Neurosci. -1996. -N. 9, -P. 15.
- V. Filippov, V. Pinchenko, T. Volkova, O. Krishtal. K+, Na+ - gated inward delayed rectifier in the hippocampal pyramidal neurones // Israel J. Med. Sci. -1996. -V. 32, -P. 26.
- V. Filippov, N.Lozovaya, T. Volkova, O. Krishtal. K+-activated potassium conductance controls the major part of the input resistance of the hippocampal and cortical neurones // Soc. for Neurosci. Abstracts, -1997. -N. 23, -P. 1197
- V. Filippov, O. Krishtal. Slow membrane responses to extracellular potassium in isolated hippocampal neurones // J. Physiol. -1998. -N. 513P, -P. 132.
Анотації:
Філіпов В. М. К+-активована Na+-керована калієва провідність у мембрані пірамідних нейронів мозку щура. - Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальностю 03.00.02 - Біофізика. - Інститут Фізіології їм. О. О. Богомольця, Київ, 1999.
Дисертація присвячена вивченню реакції гостроізольованих пірамідних нейронів на швидке прикладення іонів калію із застосуванням метода петч-кламп у конфігурації “від цілої клітини”. Підвищення зовнішньоклітинної концентрації іонів К+ викликало двофазний вхідний струм при мембранних потенціалах негативніших за потенціал реверсії для іонів K+. Цей струм складався зі струму витоку та уповільненого струму (IΔK) з τ = 40 - 50 мс при 21OC. Спостережений уповільнений струм мав кінетику активації першого порядку, що не залежала від потенціалу та концентрації іонів K+. Амплітуда цього струму визначалася прикладеною концентрацією іонів K+ та збільшувалась за умов гіперполяризації. Потенціал-залежність IΔK була подібною до потенціал-залежності К+ струмів із внутрішнім випрямленням. Активація IΔK залежала від концентрації іонів Na+; заміна зовнішньоклітинного Na+ на холін хлорид чи літій майже повністю усувала IΔK.
IΔK спостерігався в пірамідних нейронах гіпокампа і кортекса, однак був практично відсутній в нейронах задніх корінців спинного мозку та нейронах мозочка. Сповільнюючи вхід К+ в клітину, IΔK може грати істотну роль в запобіганні щільно спакованих пірамідних нейронів від спонтанного збудження внаслідок швидкого підвищення зовнішньої концентрації іонів К+.
Ключові слова: гіпокамп, кортекс, калієвая провідність, зовнішньоклітинний калій, натрій, метод фіксації концентрації.
|
