|
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
ШКАВОЛЯК АНДРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ
УДК 612.015.31..611.37.0018.1-084
ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА БІОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА
Na/Li-ПРОТИТРАНСПОРТУ
В БЕТА-КЛІТИНАХ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ЩУРА
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті ім. Данила Галицького МОЗ України.
Захист відбудеться 7 вересня 2004 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН (79034, м.Львів, вул. Стуса, 38).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м.Львів, вул. Стуса, 38.
Автореферат розісланий 2 серпня 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради О.І.Віщур
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Важливість підшлункової залози в здійсненні метаболізму визначається розмаїттям властивостей панкреатичних гормонів, утворення та вивільнення яких тісно спряжені з трансмембранним перенесенням моновалентних іонів. Зокрема, в реалізації цих процесів в острівцях Лангерганса провідна роль належить іонам Na+ та К+ (Anello M. et al., 1996). Стимуляція бета-клітин нутрієнтами призводить до зниження значень рН в результаті утворення кислих метаболітів, і цей процес тісно пов’язаний з транспортом Na+ (Hattory М. et al., 1994; Shepherd R.M., Henquin J.C., 1995). Цілком ймовірно, що острівці Лангерганса володіють декількома іонними транспортерами, які попереджують накопичення протонів. В еритроцитах найбільш реальними претендентами на цю роль є механізми Na/Н- та Na/Na-протитранспорту (Орлов С.Н. и соавт., 1994; van Norren K. et al., 1997). Відомо також, що плазматична мембрана еритроцитів людини та тварин деяких видів володіє нечутливою до овабаїну транспортною системою, здатною каталізувати обмін іонів Na+ на Li+, причому остання розглядається як різновид зазначених вище транслокацій. Na/Li-протитранспорт може здійснюватись однією з ізоформ транспортера, за посередництвом якого відбувається Na/H-обмін (Canessa M. et al., 1992; Zerbini G. et al., 2003), а також бути гомологом Na/Na-протитранспорту (Escobales N., Figueros J., 1991; Hardman T.C., Land A.F., 1996). При певних патологічних станах, зокрема, за розвитку діабету, властивості механізмів Na/Li-протитранспорту в еритроцитах істотно відрізняються від таких, характерних для цих клітин у здорової людини ( Guarena C. et al., 1992), і дана обставина обгрунтовує високу ймовірність наявності в панкреатичних клітинах транспортерів, за посередництвом яких може відбуватись незалежний від натрієвої помпи обмін іонів Na+ та Li+. Однак, незважаючи на важливість виявлення транспортувальних шляхів, якими здійснюється транслокація моновалентних іонів у панкреатичних клітинах за фізіологічних та екстремальних умов, з категорії овабаїн-резистентних систем найбільш повно вивчено властивості лише Na,K,Cl-котранспорту в ацинарних (Zhao Н., Muallem М., 1995) та в бета-клітинах (Sandstrom P.I., Sehlin J., 1993) миші, Na/H-обміну – в ацинарних (Anderie I., Thevenod F., 1996) та в бета-клітинах (Shepherd R., Henquin J.C., 1995) щура. Na,K,Cl-котранспорту – в бета-клітинах щура (Бобровник A.Д., 1997). Тому однією із актуальних проблем є дослідження і інших овабаїн-нечутливих механізмів іонного обміну, зокрема, Na/Li-протитранспорту, що можуть функціонувати у підшлунковій залозі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планами науково-дослідних робіт “Обгрунтування методів відновлювальної фізичної терапії патологічних процесів, що супроводжуються явищами іонної мембранопатії”, № держреєстрації 0194U008107 та “Дослідження механізмів розвитку іонних мембранопатій”, № держреєстрації 0198U00877.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з’ясування можливості обміну в бета-клітинах острівців Лангерганса щура внутрішньоклітинного Na+ на позаклітинний Li+ і вивчення біохімічних властивостей механізму Na/Li-протитранспорту.
Для здійснення поставленої мети вирішували наступні основні задачі:
1. Аналіз кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах при їх інкубації в середовищах зі змінними рН, температурою та осмоляльністю.
2. Вимірювання інтенсивності Na/Li-протитранспорту в нативних бета-клітинах та в бета-клітинах зі змінним іонним складом.
3. Порівняння кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах здорової людини.
4. Вивчення взаємоз’язку між концентрацією моновалентних іонів, швидкістю Na/Li-протитранспорту та інтенсивністю активного транспорту Na+ в бета-клітинах щурів, опромінених монохроматичним червоним світлом.
Об'єкт дослідження: Іон-транспортувальні системи.
Предмет дослідження: Кінетичні параметри Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса та в еритроцитах щура, в еритроцитах людини.
Методи дослідження:
- біохімічні – фармакокінетичний аналіз параметрів Na-транспортувальних процесів;
- фізіологічні – виділення острівців Лангерганса, лазерне опромінення лабораторних щурів;
- морфологічні – електронна мікроскопія острівців Лангерганса;
- статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Нами вперше отримано свідчення наявності в бета-клітинах острівців Лангерганса щура іон-транспортувального механізму, який може здійснювати стимульовану позаклітинним літієм транслокацію внутрішньоклітинного Na+. У використаних як експериментальні транспортні моделі бета-клітинах виявлено та кількісно оцінено основні параметри Na/Li-протитранспорту. Окреслено механізми регуляції вказаного іонного обміну, що реалізуються через модуляцію його окремих властивостей за впливу змінних фізичних (температура, осмоляльність) та хімічних (наявність транспортних інгібіторів, іонний склад внутрішньо- та позаклітинного середовищ, рН) факторів. Вперше проведено порівняння кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах людини. Розширено теоретичні уявлення про механізми функціонування Na/Li-протитранспорту в нееритроїдних клітинах.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати вказують, що експериментальною моделлю для вивчення властивостей Na/Li-протитранспорту можуть служити бета-клітини острівців Лангерганса щура, позаяк останні достатньою мірою проявляють фармакологічні (чутливість до транспортних інгібіторів) та функціональні (чутливість до рН, осмоляльності, температури, іонного складу внутрішньо- та позаклітинного середовищ) характеристики.
Проведено оптимізацію умов дослідження Na/Li-протитранспорту, що дозволяє здійснювати порівняльну оцінку окремих показників цієї іонної транслокації в клітинах, що перебувають в стані, наближеному до природнього, за створення екстремальних умов та за впливу випромінювання гелій-неонового лазера. Матеріали дисертаційної праці впроваджені в навчальний процес у ЛНМУ ім. Данила Галицького в лекційні курси кафедр нормальної фізіології, патологічної фізіології, біохімії.
Особистий внесок здобувача. Збір літератури, лазерне опромінення лабораторних тварин, статистичне обчислення отриманих даних, їх опис виконано особисто дисертантом. Разом з науковим керівником сплановано комплекс біохімічних та фізіологічних методів і серії експериментальних досліджень, обговорено та узагальнено одержані результати. Виділення острівців Лангерганса та вимірювання параметрів Na-транспортувальних систем проведено спільно зі співробітниками ЦНДЛ ЛНМУ, які є співавторами публікацій. Електронно-мікроскопічне дослідження здійснено старшим науковим співробітником цієї ж лабораторії Ковалишиним В.І.
Апробація результатів дисертації. Основні результати та положення роботи були оприлюднені та винесені на обговорення на XV з’їзді фізіологів України (Львів, 1998), науково-практичній конференції “Актуальні проблеми лазерної медицини, ендоскопічної хірургії та гінекології” (Одеса, 1999), симпозіумі “Водно-сольовий обмін та його роль в гомеостатичних реакціях організму” (Львів, 1999), Міжнародній науковій конференції “С.З.Гжицький і сучасна аграрна наука” (Львів, 2000), IV та V Міжнародних медичних Конгресах студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2000 та 2001, відповідно), Міжнародній конференції студентів і молодих вчених (Дніпропетровськ, 2001), ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), VІІ з’їзді Українського лікарського товариства (Тернопіль, 2003).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 18 публікаціях, з яких 7 опубліковано у наукових фахових виданнях, 4 – у збірниках та вісниках наукових праць, 7 – у матеріалах та тезах конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках машинописного тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, опису отриманих результатів та їх обговорення, узагальнення, висновків, списку використаних джерел із 200 найменувань та 3 додатків (актів впровадження). Робота ілюстрована 5 таблицями, 23 рисунками та 4 світлинами, які займають 15 сторінок тексту.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень
Робота виконана на 230 лабораторних щурах-самцях. Дослідження проводили на виділених методом Lacy P.E., Kostianowsky M. (1967) бета-клітинах острівців Лангерганса, інтактність яких оцінювали за посередництвом трипанового синього (Senglen P., 1976) та електронною мікроскопією, а також на еритроцитах цих тварин і 30 здорових осіб.
На стаціонарний стан бета-клітин острівців Лангерганса впливали декількома способами: модифікацією іонного складу розчинів, які використовували для інкубації, змінами рН, осмоляльності та температури позаклітинного середовища. У вільному від Na+ або Li+ середовищі ці іони заміняли на холінхлорид. Значення осмоляльності інкубаційного середовища контролювали осмометром типу ОМКА Ц-01. Про об’єм клітин судили за вмістом внутрішньоклітинної води (Sayeed M.M., 1984).
Параметри Na/Li-протитранспорту встановлювали в нативних клітинах та в клітинах зі змінним іонним складом, що досягалось впливом пара-хлормеркурібензенсульфонату (Garrahan P., Rega A.F., 1967) або інкубацією клітин при 0,5°С. Вимірювання концентрацій Na+ та К+ у клітинах здійснювали методом полум’яної фотометрії на фотометрі моделі Plapho 4, Carl Zeiss, Jena.
Про інтенсивність овабаїн-чутливого транспорту Na+ судили за збільшенням концентрацій Na+ в клітинах після їх інкубації в середовищах, що містили овабаїн (в ммоль/л): 5,0 – для бета-клітин; 1,0 – для еритроцитів щура; 0,1 – для еритроцитів людини (Cumberbatch M., Morgan B., 1978; de Mendonca M. et al., 1983). Активність Na,K-АТФази клітин обчислювали як різницю між активностями сумарної АТФази та Mg-АТФази, що їх визначали за приростом концентрацій неорганічного фосфату. Na/Li-протитранспорт був досліджений як стимульований позаклітинним літієм вихід Na+. Стандартну активність Vstd та максимальну реакційну швидкість Vmax Na/Li-протитранспорту встановлювали за різницею концентрацій Na+, виміряних в в клітинах в нульовий та завершальний час інкубації при поєднаному додаванні в середовища потоку, що містили NaCl в концентрації 140 ммоль/л або 150 ммоль/л, відповідно, двох транспортних інгібіторів – овабаїну та фуросеміду – за наявності та відсутності LiCl. Константа спорідненості Міхаеліса (Кm) до позаклітинного Na+ була визначена графічним методом.
При опроміненні піддослідних тварин розфокусований потік монохроматичного червоного світла (МЧС), генерований гелій-неоновим лазером типу ЛГ-75, скеровували на депільовану епігастральну область. Густина потужності випромінювання становила 0,5 мВт ⋅ см-2. Дозування проведено шляхом змін кількості сеансів та їх тривалості.
Статистичний аналіз одержаних результатів здійснювали на персональному комп’ютері Celeron-400 з використанням програми Excel пакету Microsoft Office. Для оцінки рівня вірогідності використовували критерій Стьюдента. Зміни показників вважали вірогідними при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив змін рН інкубаційного середовища на стимульований позаклітинним літієм вихід натрію з бета-клітин щура. Завдання даного фрагменту праці – встановлення величин стандартної активності (Vstd) та максимальної швидкості (Vmax) Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щура в процесі їх інкубації в середовищах з низьким (6,4), фізіологічним (7,4) і високим (8,4) рНо та аналіз зв’язку можливих модуляцій вказаного іон-транспортувального механізму з активністю Na,K-АТФази цих же клітин.
При з’ясуванні залежності стандартної активності та максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту від іонів Н+, концентрація яких зумовлювала реакцію інкубаційного середовища, в бета-клітинах острівців Лангерганса щура не зареєстровано достатньо тісного зв’язку між обидвома аналізованими параметрами. В тому випадку, коли рНо був на рівні 7,4, Vstd іонного обміну становила 0,49 ± 0,02 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1, а Vmax сягала 0,70 ± 0,01 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год1. При інкубації бета-клітин в середовищі з рН 8,4 активність Vstd збільшувалась на 26%, а швидкість Vmax – на 33%. Закиснення інкубаційного середовища, в якому впродовж 1 год витримували бета-клітини, до рН 6,4 проявлялось пригніченням Vstd – на 30%.
Обчисленням даних, отриманих у результаті вимірювання Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту, не виявлено залежності між цими показниками в бета-клітинах, що були інкубовані в середовищах при рНо 7,4 та 8,4. При їх витримуванні в закисненому середовищі аналізований коефіцієнт кореляції становив +0,24.
З’ясовано також, що активність Na,K-АТФази бета-клітин при їх інкубації в середовищі, рН якого сягало 7,4, становить 1,22 ± 0,34 мкмоль Рі ⋅ 1 мг білка-1 ⋅ 1 год-1. Різновекторні зміни рН інкубаційного середовища не позначались на процесах екструзії Na+, про що свідчила висока стабільність цього ферменту. Отримані результати вказують на можливість здійснення в бета-клітинах острівців Лангерганса щура Na/Li-протитранспорту, який за застосованих експериментальних умов не проявляє модулюючого впливу на натрієву помпу.
Температурна залежність інтенсивності Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура. Відомою є ймовірність розвитку змін іонної проникності плазматичної мембрани внаслідок витримування клітин в інкубаційному середовищі при температурі 0,5°С, що призводить до зменшення в них концентрації К+ та збільшення - Na+, і в результаті подальшого їх переміщення в середовище при температурі 37°С, коли внутрішньоклітинні рівні вказаних іонів можуть повернутись до базальних значень (Sayeed, 1984).
Метою даного фрагменту праці було встановити в бета-клітинах острівців Лангерганса щура залежність інтенсивності Na/Li-протитранспорту від температури середовища, в якому здійснюється їх інкубація.
Результати досліджень засвідчили, що бета-клітини щура містять Na+ в концентрації 15,60 ± 0,44 ммоль · 1 кг клітин-1 та К+ в концентрації 96,28 ± 1,74 ммоль · 1 кг клітин-1. Витримування цих клітин в ізоосмоляльному середовищі, температура якого була знижена до 0,5°С, на 90 хв проявляється втратою біля 60% внутрішньоклітинного К+ та майже 4-кратним накопиченням Na+. Функціонування механізму Na/Li-протитранспорту за таких умов не зареєстровано.За часткового відновлення в результаті “теплової” (370С) інкубації концентрацій внутрішньоклітинного Na+ (до 38,78 ± 0,94 ммоль · 1 кг клітин-1) та К+ (до 70,95 ± 0,87 ммоль · 1 кг клітин-1) стандартна активність Na/Li-протитранспорту становила 0,22 ± 0,01 ммоль Na+ · 1 кг клітин-1 · 1 год-1.
Друга мета досліджень даної серії зводилась до вcтановлення залежності Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту від поєднаного впливу на бета-клітини двох факторів – температури та осмоляльності інкубаційного середовища.
Інкубація бета-клітин у середовищах вибраного температурного режиму за фізіологічної осмоляльності не відбивається на параметрах Na/Li-протитранспорту (табл.1). Інкубація цих клітин в гіперосмоляльному середовищі призводить до збільшення Vstd – на 58%, V max – на 34% відносно величин, встановлених при застосуванні ізоосмоляльного середовища. Підвищення температури гіперосмоляльного середовища до 40°С проявлялось зростанням Vstd – на 20%, а Vmax – на 40% стосовно базального рівня (37°С). Однак коли температура гіперосмоляльного середовища сягала 43°С, значення Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту істотно зменшувались, повертаючись в діапазон контрольних значень.
Таблиця 1
Вплив температури середовищ інкубації різної осмоляльності
на стандартну активність (Vstd) та максимальну швидкість (Vmax)
Na/Li-протитранспорту (в ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1)
в бета-клітинах острівців Лангерганса щура
Примітка. * - вірогідність p<0,05 стосовно базального рівня (37°С)
Одержані дані вказують на можливість об’ємної регуляції панкреатичних бета-клітин щура механізмом Na/Li-протитранспорту, позаяк відповідними змінами температури інкубаційного середовища можна пригнітити процеси його активації, зумовлені осмотичним зморщуванням.
Вплив осмотичного стресу на інтенсивність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура. Динамічна регуляція об’єму клітин визначається змінами властивостей іонних транспортерів, які відносяться до об’єм-збільшувальних або об’єм-зменшувальних систем. Хоча більшість з них є ідентифікованими та добре вивченими в еритроцитах, відомості щодо їх характеристик у клітинах органів травного тракту залишаються вкрай обмеженими.
Метою даного фрагменту роботи було – з’ясувати можливість регуляції об’єму бета-клітин острівців Лангерганса щура за участю механізму Na/Li-протитранспорту.
Перед висвітленням одержаних результатів доцільно навести дані щодо коливань кількості внутрішньоклітинної води при інкубації бета-клітин в середовищах змінної (200; 300; 400 мОсмоль /кг) осмоляльності (Бобровник А.Д. та співавт., 2001). Їх витримування в гіперосмоляльному середовищі за відсутності транспортних інгібіторів проявлялось зменшенням кількості внутрішньоклітинної води на 12% (р > 0,05) відносно значень, зареєстрованих при застосуванні ізоосмоляльного середовища. При внесенні в гіперосмоляльне середовище овабаїну (5,0 ммоль/л) об’єм бета-клітин залишався незмінним, а при їх інкубації в ізоосмоляльному середовищі за наявності овабаїну кількість внутрішньоклітинної води була на 19,6% (р < 0,05) більшою, ніж за відсутності цього ж інгібітора.
Є важливим, що хоча на 60-ій хв інкубації бета-клітин у гіпоосмоляльному середовищі вміст внутрішньоклітинної води істотно – на 79,5% (р < 0,05) - збільшувався, тим не менше вплив овабаїну на ефект гіпотонічного шоку як за наявності, так і за відсутності фуросеміду проявлявся нормалізацією клітинного об’єму.
Витримування бета-клітин острівців Лангерганса в гіперосмоляльному середовищі проявляється вірогідним зростанням інтенсивності Na/Li-протитранспорту (табл.1). Ймовірно, за умов пригнічення швидкості екструзії Na+ Na/Li-протитранспорт виконує компенсаторну роль в підтриманні натрієвого градієнту. При інкубації названих клітин у гіпоосмоляльному середовищі інтенсивність Na/Li-протитранспорту не відрізнялась від такої, встановленої за їх витримування в ізоосмоляльному середовищі.
В даному дослідженні отримано свідчення наявності в бета-клітинах острівців Лангерганса щура тісної кореляційної залежності співвідношень Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту від значень осмоляльності позаклітинної рідини. Так, за підтримання базальних умов інкубації (300 мОсмоль/кг; 37°С) коефіцієнт кореляції r становив +0,70, а за перебування клітин в гіперосмоляльному середовищі цей показник змінювався до –0,51. Отже, поєднане визначення вказаних параметрів може бути корисним для біохімічної характеристики даного іон-транспортувального механізму.
Залежність параметрів інтенсивності Na/Li-протитранспорту від концентрації позаклітинного Na+. Раніше аналізом швидкості однієї з компонент овабаїн-резистентного транспорту іонів – Na,K,Cl-котранспорту – як функції концентрацій позаклітинного Na+ було показано, що в бета-клітинах щура цей процес підпорядковується кінетиці насичення (Бобровник А.Д., 1997). Мета даної праці – встановлення особливостей впливу позаклітинного Na+o на інтенсивність іншого овабаїн-резистентного механізму іонної транслокації - Na/Li-протитранспорту.
У нашому дослідженні вихід Na+ з інкубованих бета-клітин острівців Лангерганса щура в сольове середовище, що містило Li+, виявився значно інтенсивнішим, ніж у середовище з холінхлоридом (0,49 ± 0,01 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1 проти 0,12 ± 0,01 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1, відповідно; Р<0,05). Цей факт додатково свідчить про можливість функціонування механізму Na/Li-протитранспорту.
На рис.1 наведено криву активації позаклітинним Na+ скерованого назовні транспорту цього іону, що здійснюється в обмін на субстратний Li+. Нами отримано дані, що в бета-клітинах острівців Лангерганса щура цей процес є функцією концентрацій позаклітинного Na+.
У таблиці 2 узагальнено значення окремих параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щура і, для порівняння, їх величини в еритроцитах цієї ж піддослідної тварини. Подібне дослідження виконано при двох концентраціях позаклітинного Na+ - 140 ммоль/л та 150 ммоль/л. Як свідчать наведені результати, у щура величини Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса виявились на 51% і 40%, відповідно, вищими, ніж такі в еритроцитах.
Роль внутрішньоклітинного Na+ як модулятора Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура. Кінетичний аналіз параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах включав встановлення залежності швидкості вказаної іонної транслокації від концентрації внутрішньоклітинного Na+. З цією метою застосовано техніку обробки клітин шляхом їх витримування в розчині, що містив пара-хлормеркурібензенсульфонат.
Таблиця 2
Порівняння активності та кінетики Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса і в еритроцитах щура
Na-навантаження здійснювали при 5-ти концентраціях субстратного Na+ - від 8 до 70 ммоль/л. Частину вимірювань параметрів Na/Li-протитранспорту проведено за відсутності в середовищах потоку пара-хлормеркурібензенсульфонату, за умови 5-кратного промивання бета-клітин MgCl2-сахарозним розчином.
Після застосування методичних прийомів, що сприяли Na-навантаженню клітин, збільшення внутрішньоклітинних концентрацій цього іону, при яких значення стандартної активності Na/Li-протитранспорту були максимальними, становило в середньому 150 відсотків (табл.3).
Таблиця 3
Концентрація Na+ та К+ (ммоль ⋅ 1 кг клітин-1) та
кінетичні параметри (ммоль Na+ · 1 кг клітин-1 · 1 год-1)
Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щура
Примітка. * - вірогідність р<0,05 стосовно величин в промитих клітинах
При вивченні кінетики Na/Li-протитранспорту отримано дані, які вказують на те, що цей обмін у певних межах є функцією концентрацій внутрішньоклітинного Na+. Так, його стандартна активність виразно пригнічується за різко зменшеної концентрації Na+і (10 ммоль ⋅ 1 кг клітин-1), зростаючи в міру збільшення цього параметру. Проте за умови перевершення концентрації Na+і рівня понад 40 ммоль ⋅ 1 кг клітин-1 гальмування вказаного процесу відновлюється, і швидкість останнього прямує до нуля, коли концентрації Na+ обабіч плазматичної мембрани наближаються до вирівнювання.
Порівняльний аналіз деяких біохімічних характеристик Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах людини.
Застосовуючи однакові методи аналізу, в даному дослідженні отримано результати, які засвідчують можливість обміну внутрішньоклітинного Na+ на позаклітинний Li+ не лише в бета-клітинах, але й в еритроцитах щура, хоча в останньому випадку цей процес здійснюється значно повільніше - Vstd Na/Li-протитранспорту становила (в ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин1 ⋅ 1 год-1): 0,32 ± 0,04 проти 0,49 ± 0,02, відповідно (p<0,05). Очевидно, біологічна доцільність високої іонної проникності плазматичної мембрани для Na+ полягає в тому, що клітини залозисто-епітеліальних тканин спеціалізовані на перенесенні більшої кількості іонів та молекул води впродовж здійснення процесів секреції (Saier H.M., 2000).
Vstd Na/Li-протитранспорту в еритроцитах 30-ти здорових осіб, об’єднаних у групу порівняння, сягала 0,24 ± 0,01 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1. Отримані середні значення цього параметру не відрізняються від таких, встановлених дослідниками, які процес даної іонної транслокації вивчали як Na-стимульований Li-вихід (Canessa M., 1989; Dowd A. et al., 1994). Однак, в еритроцитах 9-ти осіб з обстежених 30-ти величини Vstd цього обміну перевершували 0,30 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1, а у 10-ти осіб з тієї ж загальної кількості були нижчими від 0,20 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин1 ⋅ 1 год-1. Коли ж отримані значення Vstd згуртувати на основі статі осіб, які знаходились під спостереженням в даному дослідженні, то можна дійти висновку про більш високу інтенсивність Na/Li-протитранспорту в еритроцитах жінок, ніж в еритроцитах чоловіків, позаяк зареєстровані середні дані становили (в ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1): 0,29 ± 0,01 проти 0,18 ± 0,02, відповідно; p<0,05.
Транспорт Na+ в бета-клітинах підшлункової залози щура за впливу випромінювання гелій-неонового лазера. Метою дослідження було вивчити взаємозв’язок між концентрацією внутрішньоклітинного Na+, інтенсивністю активного транспорту вказаного іону та максимальною швидкістю Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щурів, опромінених генерованим гелій-неоновим лазером монохроматичним червоним світлом.
Як засвідчують результати, наведені в таблиці 4, вплив на лабораторних щурів лазерної енергії в дозах 2,86 та 5,72 Дж ⋅ см-2, розподілених на 10 15-хвилинних сеансів та 10 30-хвилинних сеансів, відповідно, не призводить до змін параметрів активного транспорту Na+. Однак, в бета-клітинах острівців Лангерганса щурів, опромінених МЧС у дозі 0,28 Дж ⋅ см-2 (5 3-хвилинних сеансів) концентрація К+ виявилась вірогідно підвищеною. Як наслідок, індекс К+і /Na+і був збільшеним на третину. Виникнення подібної метаболічної ситуації можна розглядати як вказівку на посилення процесів активного транспорту Na+ в клітинах, що їх досліджували. Вірогідність подібного припущення підтверджується напрямком змін і інших параметрів овабаїн-чутливої екструзії Na+.
Таблиця 4
Показники іон-транспортувальних процесів в бета-клітинах
острівців Лангерганса опромінених МЧС щурів:
концентрація Na+ та К+, співвідношення K+i /Na+i,
активність Na,K-АТФази (мкмоль Рі ⋅ 1 мг білка-1 ⋅ 1год1),
інтенсивність екструзії MNa+i,коефіцієнт екструзії KNa+i, V max Na/Li-протитранспорту
(ммоль Na+ ⋅ 1 кг клітин-1 ⋅ 1 год-1)
Примітка. * - вірогідність p<0,05 стосовно контролю
Отримані дані служать доказом участі механізмів екструзії Na+ в підтриманні Na-градієнту в бета-клітинах острівців Лангерганса за впливу на організм лабораторних щурів випромінювання гелій-неонового лазера в низьких дозах і дозволяють узагальнити, що модуляція іонної проникності плазматичної мембрани є однією з найбільш ранніх дій вказаного фізичного чинника. Цей висновок узгоджується з одержаними в даному дослідженні результатами вимірювання максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту.
ВИСНОВКИ
У дисертації відповідно до поставленої мети та задач дослідження обстежено як експериментальні транспортні моделі бета-клітини острівців Лангерганса щура і виявлено свідчення функціонування в них Na/Li-протитранспорту, інтенсивність здійснення якого визначається іонними, осмотичними та температурними факторами, що дозволило провести розв"язання нового наукового завдання - вивчення властивостей одного з овабаїн-резистентних механізмів транслокації моновалентних іонів в ендокринних клітинах підшлункової залози.
1. Вихід Na+ з бета-клітин, інкубованих у середовищі за наявності LiCl, відбувається в 2,5 рази інтенсивніше, ніж в середовищі, яке містить холінхлорид, що вказує на можливість здійснення стимульованої позаклітинним літієм транслокації внутрішньоклітинного Na+.
2. Вплив на бета-клітини залужненого інкубаційного середовища призводить до збільшення на третину стандартної активності та максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту. Закиснення інкубаційного середовища такою ж мірою пригнічує стандартну активність вказаного іонного переміщення.
3. Функціонування механізму Na/Li-протитранспорту в процесі “холодової” інкубації (0,5ºС) бета-клітин, внаслідок чого останні втрачають приблизно 60% К+ та накопичують 4-кратну кількість Na+, не проявляється. За часткового відновлення впродовж “теплової” інкубації (37ºС) вихідних концентрацій цих іонів стандартна активність Na/Li-протитранспорту є вдвічі нижчою за таку, встановлену перед початком “холодової” інкубації.
4. Витримування бета-клітин в гіперосмоляльному середовищі (400 мОсмоль · 1 кг-1) призводить до зростання інтенсивності Na/Li-протитранспорту: Vstd - наполовину, Vmax - на третину. При їх інкубації в гіпоосмоляльному середовищі (200 мОсмоль · 1 кг-1) параметри вказаного іонного переміщення не змінюються. Одержані результати не заперечують, що механізм Na/Li-протитранспорту може приймати участь в регуляції об’єму бета-клітин.
5. Інкубація бета-клітин в ізоосмоляльному середовищі при температурі 40ºС та 43ºС не відбивається на базальній інтенсивності Na/Li-протитранспорту. Вплив на ці клітини гіперосмоляльного середовища за температури 40ºС призводить до посилення названого обміну іонів (Vstd - на 20 %, Vmax - на 40 %). У процесі їх перебування в середовищі зазначеної осмоляльності при температурі 43ºС параметри Na/Li-протитранспорту повертаються в межі значень, встановлених при температурі 37°С.
6. Активність скерованого з бета-клітин транспорту Na+, стимульованого літієм, має концентраційну (0...120 ммоль · 1 л-1) залежність від позаклітинного Na+. Цей іонний обмін в певних межах (10...40 ммоль · 1 кг-1) є функцією концентрацій внутрішньоклітинного Na+, і його швидкість прямує до нуля, коли концентрації Na+ з обидвох сторін плазматичної мембрани наближаються до вирівнювання. Ці результати підтверджують можливість функціонування механізму Na/Li-протитранспорту при прогресивній зміні концентрацій Na+.
7. Стандартна активність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура наполовину перевершує таку в його еритроцитах і є вдвічі вищою, ніж в еритроцитах людини. Вища швидкість вказаного іонного обміну в бета-клітинах щура узгоджується зі зменшеною вдвічі константою спорідненості Кm (Na+o).
8. Хронічний вплив на щурів енергії гелій-неонового лазера в сумарних дозах 0,28 Дж · см2 та 2,86 Дж · см-2 пригнічує на 42% та 32%, відповідно, максимальну швидкість Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах за відсутності змін концентрації внутрішньоклітинного Na+.
Список основних опублікованих за темою дисертації робіт
1. Шкаволяк А.В. Кінетичний аналіз Na/Li-протитранспорту при дослідженні проникності еритроцитарної мембрани для іонів Na+ //Експерим. клін. фізіологія і біохімія. – 1999. - №1. – С.7-11.
2. Шкаволяк А.В. Активність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура за впливу випромінювання гелій-неонового лазера //Бібліотека Одеського медичного журналу. – 1999. – Додаток 5 (55). – С.149-153.
3. Шкаволяк А.В. Вплив змін позаклітинного рН на швидкість Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура //Матеріали ІV Міжнародного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль, 2000. – С.368-369.
4. Бобровник А.Д., Шкаволяк А.В., Гринчишин Н.М. Механізми транспорту моновалентних іонів в бета-клітинах підшлункової залози щура за впливу випромінювання гелій-неонового лазера //Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії та сільського господарства. – Львів, 1998. – С.147-149. – Здобувачем проведено лазерне опромінення щурів, аналіз та інтерпретацію отриманих даних.
5. Na/Li-протитранспорт у хворих на хронічний алкоголізм / А.Р.Панас, А.В.Шкаволяк, О.А.Бурий, Н.М.Гринчишин // Вісник проблем біології та медицини. – 1998. – Вип.23. – С.128-132. – Здобувачем встановлено швидкість Na/Li-обміну в еритроцитах здорових осіб і здійснено статистичне обчислення отриманих даних.
6. Шкаволяк А.В., Галібей І.Б. Властивості систем Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в еритроцитах людини //Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім.П.І.Шупика. – Київ, 1999. – Вип.8, Кн.1. – С.294-296. – Здобувачем отримано та інтерпретовано матеріали стосовно Na/Li-протитранспорту і здійснено загальне редагування статті.
7. Шкаволяк А.В., Бобровник А.Д., Гринчишин Н.М. Температурна залежність швидкостей Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура //Наук. вісник Львів. держ. акад. ветер. мед. ім.С.З.Гжицького. – 2000. – Т.2, №2, Ч. 3. – С.264-266. – Здобувачем проведено аналіз даних щодо Na/Li-протитранспорту.
8. Гжегоцький М.Р., Шкаволяк А.В., Бобровник А.Д. Швидкість Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура. Вплив концентрації позаклітинного Na+ // Наук. вісник Львів. держ. акад. ветер. мед. ім. С.З.Гжицького. – 2000. – Т.2, №3-4. – С.19-23. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту, статистичне обчислення отриманих даних.
9. Шкаволяк А.В., Гринчишин Н.М. Дослідження Na-транспортуючих систем в діагностиці іонних мембранопатій // Експерим. клін. фізіологія і біохімія. – 2000. - №4. – С.63-66. – Здобувачем проведено пошук та систематизацію даних літератури.
10. Вплив осмотичного стресу на активність Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура / А.Д.Бобровник, А.В.Шкаволяк, Н.М.Гринчишин, А.В.Манченко // Мед. хімія. – 2001. – Т.3, №1. – С.24-27. – Здобувачем опрацьовано фрагмент роботи стосовно вивчення властивостей Na/Li-протитранспорту.
11. Бобровник А.Д., Гринчишин Н.М., Шкаволяк А.В. Кінетичні механізми Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в ізольованих бета-клітинах щура //Фізіол. журнал. – 1998. – Т.44, №3. – С.153. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту, статистичне обчислення отриманих даних.
12. Шкаволяк А.В., Бобровник А.Д., Ковальський П.П. Дослідження Na/Li-протитранспорту в діагностиці іонних мембранопатій // Тези ХІV з’їзду терапевтів України. – Київ, 1998. – С.22. – Здобувачем виміряно швидкість Na/Li-протитранспорту в здорових осіб і проведено статистичне обчислення отриманих даних.
13. Shkavoliak A., Bajsa I. Comparison of Na/Li countertransport process of human and rat erythrocytes //2nd Internacional studente and 9th EMSA International Scientifice Symposium. – Lublin, 2000. – P.135. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту в еритроцитах людини та щура.
14. Шкаволяк А.В., Байса І.Ю., Ленишин Г.М. Визначення активності та кінетичних характеристик Na/Li-протитранспорту в еритроцитах людини //Матеріали Міжнародної медичної конференції студентів і молодих вчених “Сучасні проблеми клінічної та теоретичної медицини”. – Дніпропетровськ, 2001. – С.181-182. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту в еритроцитах практично здорових осіб та підготовка тез до друку.
15. Шкаволяк А.В., Байса І.Ю. Розмаїття механізмів транслокації літію через плазматичну мембрану. Видова та органна специфічність Na/Li-протитранспорту //Матеріали V Міжнародного конгресу студентів та молодих вчених. – Тернопіль, 2001. – С.170. – Здобувачем порівняно інтенсивність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах і еритроцитах щура та еритроцитах людини.
16. Шкаволяк А.В., Павлюст Л.П., Манченко А.В. Внутрішньоклітинний Na+ як модулятор Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура // Тези доповідей ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства – Львів, 2002. – С.136. – Здобувачем проведено аналіз параметрів Na/Li-протитранспорту, статистичне обчислення та інтерпретацію отриманих даних.
17.Стандартна активність Na/Li-протитранспорту в еритроцитах жінок та чоловіків / І.Й.Влох, А.В.Шкаволяк, Л.П.Павлюст, Н.М.Гринчишин, І.Ю.Байса // Укр. медичні вісті. – 2003. – Т.5, №1 (63). – С.157. – Здобувачем виміряно інтенсивність Na/Li-протитранспорту і здійснено статистичне обчислення отриманих даних.
18. Шкаволяк А.В., Павлюст Л.П., Гринчишин Н.М. Гіперосмотична регуляція Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура //Буковинський медичний вісник. – 2003. - №1-2. – С.172-173.– Здобувачем проведено вивчення особливостей обміну іонів за базальних та гіперосмотичних умов.
Анотація
Шкаволяк А.В. Ідентифікація та біохімічна характеристика Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біології тварин УААН, Львів, 2004.
Ця праця досліджує гіпотезу можливого здійснення в острівцях Лангерганса лабораторного щура Na/Li-протитранспорту як мембранної функції, що забезпечує обмін внутрішньоклітинного Na+ на позаклітинний Li+. Застосовуючи стандартну фармакокінетичну техніку аналізу, в бета-клітинах острівців Лангерганса, ізольованих ензиматичним розщепленням, визначено концентрацію К+ та Na+, стандартну активність та максимальну швидкість цього обміну, константу спорідненості до позаклітинного Na+ (Km), індекс Vmax /Km . 10-3. Проведено вивчення впливу рН, температури та осмоляльності позаклітинного середовища, концентрацій внутрішньоклітинного та позаклітинного Na+ на ці кінетичні параметри іонного обміну. Крім того, дане дослідження, виконане зі застосуванням однакових методів аналізу, було спрямоване на вирішення наступних завдань: 1) порівняння, які властивості Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах людини є подібними; 2) обстеження окремих показників активного транспорту Na+ та Na/Li-протитранспорту як індикаторів чутливості до випромінювання низькоенергетичного гелій-неонового лазера.
Результати даного дослідження засвідчують можливість функціонування в бета-клітинах острівців Лангерганса лабораторного щура механізму, який здійснює Na/Li-протитранспорт. Іонні, осмотичні та температурні зміни і різновекторні коливання рН в позаклітинному середовищі мають відношення до виникнення аномалій в бета-клітинах, які маніфестуються модуляцією властивостей Na/Li-протитранспорту. Інтенсивність цього обміну в бета-клітинах щура є вищою, ніж в його еритроцитах і в еритроцитах здорової людини. Хронічний вплив на щурів випромінювання гелій-неонового лазера в дозах 0,28 Дж ⋅ см-2 та 2,86 Дж ⋅ см-2 проявляється в бета-клітинах пригніченням максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту.
Ключові слова: Na/Li-протитранспорт, активний транспорт Na+, бета-клітини острівців Лангерганса, еритроцити, фармакокінетичний аналіз, лабораторні щурі, гелій-неоновий лазер.
Аннотация
Шкаволяк А.В. Идентификация и биохимическая характеристика Na/Li-противотранспорта в бета-клетках поджелудочной железы крысы. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биологии животных УААН, Львов, 2004.
В работе на основании данных литературы о модуляции в эритроцитах больных диабетом свойств ион-транспортирующих механизмов, посредством которых осуществляется обмен Na+ на Li+, сформулирована гипотеза о возможности функционирования в эндокринных клетках поджелудочной железы системы, принимающей участие в двухнаправленной транслокации названных ионов. Эта гипотеза проэкзаменирована автором на примере бета-клеток островков Лангерганса лабораторной крысы путем изучения Na/Li-противотранспорта как мембранной функции, обменивающей внутриклеточный Na+ на внеклеточный Li+.
Выделение островков Лангерганса проведено седиментационным методом с использованием коллагеназы для энзиматического расщепления тканей эндокринной части поджелудочной железы. Сохранение структурной интактности бета-клеток, подтвержденное результатами окрашивания трипановым синим и електронно-микроскопически, послужило обоснованием для их использования в качестве экспериментальных транспортных моделей.
В бета-клетках методом пламенной фотометрии определены концентрации ионов K+ (96,28 +/- 1,74 ммоль .1 кг клеток -1) и Na+ (15,60 +/- 0,44 ммоль . 1 кг клеток -1), методом фармакокинетического анализа - стандартная активность Na/Li-противотранспорта (0,49 ± 0,02 ммоль Na+ ⋅ 1 кг клеток-1 ⋅ 1 час-1) и максимальная скорость этого обмена (0,70 ± 0,01 ммоль Na+ . 1 кг клеток-1 ⋅ 1 час-1), константа сродства (Km) к внеклеточному Na+ (31,48 ± 1,50 ммоль ⋅ 1 л), индекс Vmax/Km . 10-3 (22,45 ± 0,43). Показано, что стандартная активность этого обмена в интактных бета-клетках превышает на 50% таковую в эритроцитах крысы и на 100% - в эритроцитах здорового человека. Кроме того, настоящее исследование направлено на решение следующих задач: 1) сравнение, какие свойства Na/Li-противотранспорта проявляют идентичность в бета-клетках и эритроцитах крысы и эритроцитах человека; 2) изучение отдельных показателей активного транспорта Na+ и Na/Li-противотранспорта как индикаторов чувствительности к излучению низкоэнергетического гелий-неонового лазера.
Показано, что для выявления в бета-клетках Na/Li-противотранспорта и определения его биохимического базиса правомерно использование тех ж методов анализа, которые разработаны для его изучения в эритроцитах человека.
Основной вывод проведенного исследования состоит в том, что в бета-клетках изолированных островков Лангерганса лабораторной крысы может осуществляться направленный наружу выход Na+, который обменивается на внеклеточный Li+. Этот противотранспорт подвергается ионному и метаболическому регулированию. Осмотические и температурные изменения и разнонаправленные колебания рН во внеклеточной среде причастны к возникновению аномалий в бета-клетках, которые проявляются модуляцией свойств Na/Li-противотранспорта. Хроническое влияние на крыс излучения гелий-неонового лазера в дозах 0,28 Дж ⋅ см-2 (5 3-минутных ежедневных сеансов) и 2,86 Дж ⋅ см-2 (10 15-минутных ежедневных сеансов) проявляется в бета-клетках угнетением максимальной скорости Na/Li-противотранспорта.
Получили потверждение те факты, согласно которым основные кинетические параметры Na/Li-противотранспорта в клетках различных типов (бета-клетки, эритроциты) проявляют тесную зависимость от концентраций вне- и внутри клеточного Na+, а отдельные динамические характеристики этого обмена (чувствительность к рН, температуре, осмоляльности) в условиях их отдельного или интегрального влияния имеют определённое сходство.
Результаты настоящего исследования свидетельствуют об отсутствии в эритроцитах существенных различий ион-транспортирующих механизмов, которые осущевствляют обмен внутриклеточного Na+ на внеклеточный Li+ и внутриклеточного Li+ на внеклеточный Na+ и обуславливают целесообразность решения вопроса о возможности проявления аналогичной ситуации в бета-клетках, поскольку последние могут служить прочной моделью для изучения принципов функционирования различних изоформ и гомологов Na/Li-противотранспорта .
Ключевые слова: Na/Li-противотранспорт, активный транспорт Na+, бета-клетки островков Лангерганса, эритроциты, фармакокинетический анализ, лабораторные крысы, гелий-неоновый лазер.
| 
